一种利用铜绿假单胞菌高效降解高效氯氰菊酯的方法

文档序号:8353529阅读:697来源:国知局
一种利用铜绿假单胞菌高效降解高效氯氰菊酯的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域,更具体地,涉及一种利用铜绿假单胞菌高效降解高效 氯氯菊醋的方法。
【背景技术】
[0002] 高效氯氯菊醋是一种常用的二代拟除虫菊醋类农药,具有耐光、热分解的特点,在 ±壤中的半衰期长达94. 2~1103天。该农药已被广泛用于防治作物害虫及家庭卫生害虫, 是目前农药市场上的主要品种之一。随着该农药的大量、频繁使用及使用时间的延长,高效 氯氯菊醋农药残留问题日益凸显。近年来,高效氯氯菊醋在地表水和城市污水中频频被检 出,也是我国蔬菜、水果中主要检出农药之一。不仅如此,大量研究发现,高效氯氯菊醋残留 对非祀标生物具有严重的危害,如对一些有益昆虫如家蚕、蜜蜂和赤眼蜂等造成了极大危 害,对鱼类和水生无脊椎动物具有很高的毒性,对人类和其他哺乳动物具有细胞毒性、神经 毒性和生殖毒性,长期接触或摄入可诱发一序列慢性疾病,甚至有致癌、致崎、致突变的危 险。
[0003] 高效氯氯菊醋残留污染不仅导致食品安全问题,同时给生态环境带来严重污染, 甚至危害到人体健康。因此,消除环境及农产品中高效氯氯菊醋的残留污染已成为科研工 作者亟待解决的具有重大经济和社会意义的科研命题。W微生物为主体的生物修复技术 (bioremediation)可用于降解各种环境污染物。生物修复技术与传统物理、化学处理方法 相比具有操作简便、经济实用、无二次污染等优点,拥有广阔的应用前景。但是,现有技术中 已报道的可降解高效氯氯菊醋的微生物降解效率低且不稳定,而且微生物降解环境中高效 氯氯菊醋受到诸多条件影响,如微生物菌种接种量、温度、pH、湿度和污染环境等等。因此, 筛选高效降解菌并优化其降解工艺条件,使其降解效果达到最大化是科研工作者迫切需要 解决的问题。

【发明内容】

[0004] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中利用微生物降解高效氯氯菊醋的 效率低的缺陷,提供一种利用铜绿假单胞菌高效降解高效氯氯菊醋的方法。
[0005] 本发明的目的是通过W下技术方案予W实现的: 一种利用铜绿假单胞菌高效降解高效氯氯菊醋的方法,即将铜绿假单胞菌PA01在温 度30.6 ° C、pH 7. 7和接种量为0.2 g/L的条件下降解高效氯氯菊醋;所述铜绿假单胞菌 PA01于2014年12月5日保藏在中国典型培养物保藏中也(CCTCC),保藏编号为CCTCC NO: M 2014630,保藏地址为湖北省武汉市武汉大学。
[000引 所述铜绿假单胞菌aerwinosa)菌株PA01通过富集培养法对野生 型菌株进行反复筛选复壮而来,使其具有高度耐药、降解稳定的能力。
[0007] 所述铜绿假单胞菌(Aew/offlmas aeru知fliosa)菌株PA01在LB固体平板中生长 较快,菌落形态为黄绿色、中央凸起、边缘扁平。通过生理生化特性测定,显示该菌株属于革 兰氏阴性杆菌,好养,氧化酶、明胶液化、硝酸盐还原反应阳性;剛巧反应阴性。该菌可分解 利用葡萄糖和木糖;不分解利用藏糖和乳糖。
[0008] 本发明通过响应曲面法优化了铜绿假单胞菌PA01降解高效氯氯菊醋的降解工艺 条件,响应曲面法可W减少实验次数,同时可进行因子的单次效应、二次效应W及交互效应 的分析,因此用响应曲面法可W快速获得菌株PA01降解高效氯氯菊醋的最优降解工艺条 件。
[0009] 具体地,所述响应曲面法优化包含W下步骤: 51. 将菌株PA01进行单因素降解试验,通过依次改变影响降解率的因素,如温度、抑 值、菌种接种量、装液量、振荡速率,测定菌株PA01对高效氯氯菊醋降解率,确定影响菌株 PA01降解率的显著因素; 52. 选取显著因素进行响应曲面优化设计(Response Surface Methodology, RSM),根 据Box-Behnken设计原则进行试验设计,W显著因素为自变量(屯也名),W高效氯氯菊 醋降解率为响应值(K),建立多元二次回归方程: K = 92. 53 + 1. 48Zi + 1. 46^2 + 1. 89名-6. 37杳-0. 43术乂2 + 0. 13Zi名-4. 29杳 -0. 35^2名-2. 09名2 53. 利用SAS 9.0统计软件根据多元二次回归方程进行绘图分析,得到回归方程的响 应曲面图及其等高线图; 54. 对多元二次回归方程求一阶偏导,通过解方程得到该模型的极值点,即理论最优降 解工艺条件;温度30. 6。C、pH 7. 7和菌种接种量0. 2 g/L。
[0010] 优选地,所述铜绿假单胞菌PA01降解高效氯氯菊醋的时间为5 d。
[0011] 优选地,所述铜绿假单胞菌PA01的基础培养基组分为;2g (NH4)2S04、0. 2g M拆〇4、 0.0 lg CaCl2、0. 005g FeS〇4、0. 002g MnCl2、10. 5g 馬册〇4、4. 5g K&PO"蒸觸水 1000 血,调 整培养基的抑为7. 7。
[0012] 与现有技术相比,本发明具有W下有益效果: 本发明提供了一种利用铜绿假单胞菌高效降解高效氯氯菊醋的方法,即将铜绿假单胞 菌PA01在温度30. 6 ° C、pH 7. 7的条件下降解高效氯氯菊醋,所述铜绿假单胞菌PA01的 接种量为0. 2 g/L ;利用上述降解工艺条件,菌株PA01对100 y g/血的高效氯氯菊醋的降 解率达90% W上;本发明所述方法可W为W后大规模工业应用提供理论实践依据,具有广 泛的意义。
【附图说明】
[0013] 图1.主要因子影响菌株PA01降解效果的预测模型。
[0014] 图2.温度与抑交互影响菌株PA01降解效果的响应曲面图(a)及其等高线图 (b)。
[001引图3.抑与接种量交互影响菌株PA01降解效果的响应曲面图(a)及其等高线图 (b)。
[0016] 图4.温度与接种量交互影响菌株PA01降解效果的响应曲面图(a)及其等高线图 (b)。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容,但不应理解为对本 发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的简单 修改或替换,均属于本发明的范围;若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术 人员所熟知的常规手段。
[0018] 本发明所述菌株降解高效氯氯菊醋的实验过程如下: 菌株的基础培养基;2g (NH4)2S04、0. 2g M拆〇4、0.0 lg CaCl2、0. 005g FeS〇4、0. 002g MnCl2、10. 5g馬册〇4、4. 5g K&PO"蒸觸水1000 mL,调整培养基的抑为7. 7。
[0019] 在菌株的液体培养基中加入高效氯氯菊醋进行菌株PAOl降解高效氯氯菊醋的实 验,应用高效液相色谱法(HPLC)测定菌株PA01对高效氯氯菊醋的降解率。
[0020] 实施例1单因素考察实验 选取温度、pH值、菌种接种量、装液量、振荡速率作为影响农药降解率的主要因素,并依 次改变上述各个因素,考察降解菌皿was aerwiniosa PA01 (铜绿假单胞菌PA01)对 高效氯氯菊醋的降解效果,结果发现,温度、抑值和菌种接种量该H个因素对高效氯氯菊醋 的降解率影响显著。
[0021] 实施例2响应曲面优化实验 根据单因素实验结果,选取温度、抑值和菌种接种量该H个因素进行响应曲面优化设 计,利用SAS 9. 0统计软件根据Box-Behnken设计原则进行试验设计(表1),W温度U;)、 抑值Op和菌种接种量(名)为自变量,W高效氯氯菊醋的降解率为响应值(巧,建立多元 二次回归方程: K = 92. 53 + 1. 48Zi + 1. 46^2 + 1. 89名-6. 37杳-0. 43术乂2 + 0. 13Zi名-4. 29杳 -0. 35^2名-2. 09名2
【主权项】
1. 一种利用铜绿假单胞菌高效降解高效氯氰菊酯的方法,其特征在于,将铜绿假单胞 菌PAOl在温度30.6 ° C、pH 7. 7和接种量为0.2 g/L的条件下降解高效氯氰菊酯,所述铜 绿假单胞菌PAOl于2014年12月5日保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC M 2014630。
2. 根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述铜绿假单胞菌PAOl降解高效氯氰菊 酯的工艺条件由响应曲面优化设计得到。
3. 根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述铜绿假单胞菌PAOl降解高效氯氰菊 酯的时间为5 d。
4. 根据权利要求1至3任一项所述的方法,其特征在于,所述铜绿假单胞菌PAOl的 基础培养基组分为:2g (NH4)2S04、0.2g MgS04、0.01g CaCl2、0.005g FeS04、0.002g MnCl2、 10. 5g K2HP04、4. 5g KH2PO4,蒸馏水 1000 mL,调整培养基的 pH 为 L 7。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域,具体公开了一种利用铜绿假单胞菌高效降解高效氯氰菊酯的方法,即将铜绿假单胞菌PAO1在温度30.6℃、pH7.7和接种量为0.2g/L的条件下降解高效氯氰菊酯,利用上述降解条件,菌株PAO1对100μg/mL的高效氯氰菊酯的降解率达90%以上;本发明所述方法可为以后大规模工业应用提供理论实践依据,具有广泛的意义。CCTCC NO:M201463020141205
【IPC分类】C02F101-38, C12N1-20, C02F3-34, C12R1-385, B09C1-10
【公开号】CN104671430
【申请号】CN201410774236
【发明人】陈少华, 廖立胜, 崔紫宁, 周佳暖, 贺飞
【申请人】华南农业大学
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2014年12月16日
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