专利名称：固定了生物物质的芯片及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及固定了生物物质的芯片、制造它们的方法、及其用途。具体而言，本发明涉及包含导电性支持物和生物物质，如经由金属原子固定在支持物上的蛋白的固定了生物物质的芯片。
背景技术：
蛋白芯片用于分析蛋白结合物质等。为了达到这种目的，应以同一方向稳定固定蛋白。已知截留方法(Journal of ElectroanalyticalChemistry，vol.347，pp293-301(199))和聚合方法(Journal ofElectroanalytical Chemistry，vol.511，pp128-133(2001))是典型的蛋白固定技术。然而，任何一种方法都存在不能控制固定化蛋白的方向的问题。已知自积累方法(Sensors and Actuator B，vol.24-25，pp113-116(1995))利用半胱氨酸的硫原子与金属，如具有高结晶性的金的表面的巯基-键。然而，自积累方法存在蛋白活性降低和方向杂乱的问题，这是由于半胱氨酸残基存在于蛋白结构的许多部分中，且反应在每个半胱氨酸残基中进行。此外，上述固定方法是不可逆的，不能使固定化蛋白再次解离，因而很难再次使用基质和蛋白，且很难分析与固定化蛋白结合的少量样品。
另一种技术，其中通过使用结合金属的多肽，如与蛋白融合的聚组氨酸。使蛋白与金属离子结合，从而控制固定化蛋白的方向(JP2001-083155A)。然而，结合金属的多肽与金属离子之间的键易解离，这是因为配位键的竞争反应，因此该方法不适于稳定的固定。
发明内容
本发明的目的是提供一种固定了生物物质的芯片，其中生物物质如蛋白以恒定的方向被稳定固定在导电性支持物上。本发明另一目的是提供使用固定了生物物质的芯片的分析方法；和生物物质的纯化方法。
本发明的发明人发现通过使具有能够与金属离子形成配位键的部分的蛋白与金属离子形成配位键；使所得配合物接近导电性支持物；并向导电性支持物施加还原电位，可将蛋白稳定固定在导电性支持物上。本发明的发明人还发现其中蛋白以恒定的方向被稳定固定在导电性支持物上的蛋白芯片可利用固定化技术制备。此外，本发明的发明人发现通过向其上固定了蛋白的导电性支持物施加氧化电位，可再次解离该蛋白。基于这些发现，本发明人完成了本发明。
即，本发明如下。
(1)一种固定了生物物质的芯片，其中所述芯片包含导电性支持物和经由金属原子固定在导电性支持物上的生物物质，且其中所述生物物质具有能够与金属离子形成配位键的部分，且所述金属原子是通过还原金属离子产生的。
(2)根据(1)所述的固定了生物物质的芯片，其中所述导电性支持物具有尖顶，且所述生物物质经由金属原子而被固定在导电性支持物的尖顶上。
(3)根据(1)或(2)所述的固定了生物物质的芯片，其中所述导电性支持物载于基质上。
(4)根据(1)-(3)任何一项所述的固定了生物物质的芯片，其中所述能够与金属离子形成配位键的部分是聚组氨酸。
(5)根据(1)-(4)任何一项所述的固定了生物物质的芯片，其中所述导电性支持物是金属。
(6)根据(1)-(4)任何一项所述的固定了生物物质的芯片，其中所述导电性支持物是选自金、银、铜、铝和铂的一种或多种金属。
(7)根据(1)-(6)任何一项所述的固定了生物物质的芯片，其中所述金属原子是通过还原二价金属离子产生的。
(8)根据(1)-(7)任何一项所述的固定了生物物质的芯片，其中所述生物物质是蛋白。
(9)一种制造固定了生物物质的芯片的方法，其包括下列步骤使具有能与金属离子形成配位键部分的生物物质与金属离子形成配位键；使所得配合物接近导电性支持物；并向导电性支持物施加还原电位，并由此将具有能够与金属离子形成配位键部分的生物物质固定在导电性支持物上。
(10)一种分析生物物质或样品中的物质的方法，包括使固定在(1)-(8)任何一项的固定了生物物质的芯片上的生物物质与含有能够特异性结合该生物物质的物质的样品反应；检测通过结合固定化的生物物质而与芯片间接结合的物质，并分析在固定了生物物质的芯片上固定的生物物质或样品中的物质。
(11)一种分析生物物质或样品中的物质的方法，包括使固定在(1)-(8)任何一项的芯片上的生物物质与含有能够特异性结合固定化的生物物质的物质的样品反应；通过向导电性支持物施加氧化电位，而从芯片的导电性支持物上将反应获得的含固定化的生物物质和特异性结合生物物质的物质的配合物解离下来。
(12)一种纯化生物物质的方法，包括下列步骤将导电性支持物浸在含有金属离子和具有能够与金属离子形成配位键的部分的生物物质的溶液中；向导电性支持物施加还原电位，而使生物物质固定在导电性支持物上；将上步获得的、其上固定了生物物质的导电性支持物浸在解离溶液中；并向导电性支持物施加氧化电位，而使生物物质从导电性支持物上解离下来。
(13)一种固定物质的方法，包括下列步骤使具有能够与金属离子形成配位键的部分的物质与金属离子形成配位键；使所得配合物接近导电性支持物；并向导电性支持物施加还原电位，从而使物质固定在导电性支持物上。
(14)根据权利要求(13)所述的方法，其中所述物质是蛋白。
附图简述
图1是固定化方法原理的示意图。
图2是表示发光值的曲线图。
图3是用CDD照相机拍摄的发光图像(照片)。
图4是从大肠杆菌溶解产物中纯化与聚组氨酸融合的蛋白A的示意图。
优选实施方案的描述此后，将详细说明本发明。
<1>本发明的固定了生物物质的芯片本发明的固定了生物物质的芯片是包含导电性支持物；和经由金属原子而被固定在导电性支持物上的生物物质的固定了生物物质的芯片，其中生物物质具有能够与金属离子形成配位键的部分；且金属原子是通过还原金属离子产生的。固定了生物物质的芯片的例子包括其上固定了蛋白的蛋白芯片和固定了核酸的芯片，如其上固定了核酸的DNA芯片。
此后，将说明蛋白芯片。
对具有能够与金属离子形成配位键部分的蛋白长度没有限制，且该蛋白可以是肽。
对能够与金属离子形成配位键的部分的类型没有限制，且该蛋白的例子包括能够与金属形成配位键的、含有原子如氮原子、硫原子和氧原子的分子链和分子骨架。这种分子链或分子骨架可以是肽或除肽之外的化合物。具体而言，能够与金属离子形成配位键的分子链和分子骨架的例子包括含聚组氨酸(聚组氨酸标记)、polyfilin的肽，和含硫醇的肽或化合物。它们之中，聚组氨酸标记是特别优选的。这里，聚组氨酸标记是指含有两个或多个组氨酸残基的多肽。肽中组氨酸残基数为2或更多，且该数不会不利地影响所固定蛋白的功能，但组氨酸残基数优选6。肽中的聚组氨酸残基无需连续，且可在肽的组氨酸残基之间插入除组氨酸外的一个或若干氨基酸。能够与金属离子形成配位键的部分，如聚组氨酸标记，可与所固定蛋白的任何位点融合，但优选与蛋白的氨基-末端或羧基-末端融合。
本发明的蛋白芯片可用于，例如，筛选结合靶蛋白的药物；使用抗体等诊断；通过使用固定化的酶而生产有用物质；纯化蛋白；和通过SPM分析蛋白结构。用于这些目的的本发明蛋白芯片中的、经由能够与金属离子形成配位键的部分而被固定的蛋白的具体例子包括下述蛋白。即，所述蛋白包括蛋白激素或肽激素如胰岛素、促肾上腺皮质激素(ACTH)、和催产素；酶如胆碱酯酶、淀粉酶和胃蛋白酶及其前体；识别抗原如HBs抗原和HIV抗原的抗体；和结合抗体的蛋白，如蛋白A。还可使用任意蛋白作为蛋白文库。本发明的固定化蛋白可以是非-天然蛋白，如化学合成的蛋白，且本发明的固定化蛋白还包括肽。
本发明蛋白芯片中的、通过还原金属离子产生的金属原子优选是通过还原能够与蛋白中结合金属离子的部分形成配位键的金属离子而产生的金属原子。当把与聚组氨酸-融合蛋白用作具有能够与金属离子形成配位键部分的蛋白时，优选通过还原二价阳离子，如Cu2+、Zn2+、Ni2+、Ca2+、Co2+或Mg2+而产生金属原子。构成本发明蛋白芯片的导电性支持物是指可向其施加电位的支持物。导电性支持物的例子包括金属构成的支持物；半导体如铟锡氧化物(ITO)、GaAs、或硅构成的支持物；和碳构成的支持物。它们之中，优选金属构成的支持物，且特别优选金、银、铜、铝或铂构成的支持物。
本发明还提供一种蛋白芯片，其中具有能够与金属离子形成配位键的部分的蛋白经由金属原子而被固定在具有尖顶的导电性支持物的尖顶上。这里，具有尖顶的导电性支持物的例子包括其本身具有尖顶的支持物，如具有尖顶的铂棒。这种导电性支持物的例子还包括其中将蛋白固定在通过将导电性支持物与基质如具有尖顶的硅连接获得的导电性支持物尖顶上。这种导电性支持物的例子包括扫描探测显微镜(SPM)(JP 05-026614A)、或原子探测显微镜(JP 05-018742)所用悬臂的探针，其中导电性支持物如铂连接在基质如硅上。当蛋白被固定在导电性支持物的尖顶上时，可以一个导电性支持物上一个或若干分子的比例固定蛋白。特别是，这种蛋白芯片可用作SPM和原子探测显微镜的样品，且可通过向导电性支持物的尖顶施加电位而制备。当向导电性支持物的尖顶施加电位，可固定单个或若干蛋白分子，这是因为电位通过边缘效应而被集中在尖顶上(Pure Appl.Chem.Vol.72No.8，pp1483-1492(2000))。
本发明的蛋白芯片包括其中具有能够与金属离子形成配位键的部分的蛋白经由金属原子结合在导电性支持物上的芯片。然而，优选其中导电性支持物载于基质上的蛋白芯片。这里，术语“导电性支持物载于基质上”是指芯片中的导电性支持物顺序结合在基质整个表面上、或芯片中的多个导电性支持物与基质结合，使多个导电性支持物以恒定的间隔排列在基质上。当多个蛋白被固定在本发明的蛋白芯片上时，无需所有蛋白都经由金属原子而被固定在导电性支持物上，且至少一部分蛋白可经由金属原子而被固定在导电性支持物上。换句话说，一部分蛋白可在没有金属原子的情况下被固定，例如某些蛋白可经由金属离子结合。
可用作基质的材料的例子包括塑料、无机聚合物、天然聚合物、和陶瓷。塑料的具体例子可包括聚乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、聚酰胺、酚树脂、环氧树脂、聚碳二亚胺树脂、聚氯乙烯、聚偏二氟乙烯、聚氟乙烯、聚酰亚胺和丙烯酸树脂。无机聚合物的具体例子包括玻璃、水晶、碳、硅胶和石墨。天然聚合物的具体例子包括纤维素、纤维素衍生物、壳多糖、脱乙酰壳多糖、藻酸和藻酸盐。陶瓷的具体例子包括矾土、硅石、碳化硅、氮化硅和碳化硼。
基质形状的例子包括膜片、平板、颗粒、模塑片(珠、带、多孔平板的孔或带、管、网、连续发泡的形式、膜、纸、针、纤维、平板、玻片、和细胞培养皿)、胶乳、和悬臂的探针。对基质的大小没有特别限制。
上述实施方案用于说明蛋白芯片，然而，可将与上述相同种类的、能够与金属离子形成配位键的部分，导电性支持物，金属原子，基质等用于其上固定了其它生物物质的芯片。
<2>制造固定了生物物质的芯片的方法本发明固定了生物物质的芯片可通过下列方法制造，该方法包括使具有能够与金属离子形成配位键的部分的生物物质与金属离子形成配位键，使所得配合物接近导电性支持物并向导电性支持物施加还原电位，而使具有能够与金属离子形成配位键部分的生物物质固定在导电性支持物上的步骤。
下面说明蛋白芯片的制造方法。
固定在本发明蛋白芯片上、具有能够与金属离子形成配位键的部分的蛋白可通过，例如，在网状细胞溶解产物、或宿主细胞如大肠杆菌细胞或昆虫细胞中体外表达含DNA的载体，其中该DNA编码具有能够与金属离子形成配位键的肽的融合蛋白，并纯化所表达的蛋白而获得。这种蛋白还可通过化学合成获得。蛋白可单独制备并和能够与金属离子形成配位键的部分化学结合。含聚组氨酸标记的蛋白，其是本发明的优选蛋白，可通过，例如，将编码目标蛋白的DNA插入到已知的聚组氨酸-融合蛋白表达载体(例如，pET系列，由Novagen制造)中，通过用该载体转化大肠杆菌等而表达融合蛋白，并利用亲和柱等纯化融合蛋白而生产。此外，这种蛋白可通过下列步骤获得合成包括编码聚组氨酸标记的核苷酸序列的寡核苷酸和寡核苷酸的互补链，使两个链杂交，将所得DNA插入到含编码目标蛋白的DNA的表达载体中，以便表达融合蛋白，通过用所得载体转化大肠杆菌等而表达融合蛋白，并纯化所表达的蛋白。
在本方法中，用于固定的、具有能够与金属离子形成配位键的部分的蛋白并非必需是纯化蛋白，这是因为具有该部分的蛋白可被特异性固定在蛋白芯片上。即，含有该蛋白的来源于大肠杆菌的溶解产物、提取物等或网状细胞的溶解产物可直接用于固定。在这种情况下，具有省略纯化过程的优点。
在本发明的制造方法中，与具有能够与金属离子形成配位键的部分的蛋白形成配位键的金属离子是指能够与蛋白的这种部分形成配位键的金属离子。在将聚组氨酸-融合蛋白用作具有结合金属离子部分的蛋白时，优选使用二价阳离子如Cu2+、Zn2+、Ni2+、Ca2+、Co2+或Mg2+作为金属离子。各金属离子和具有能够与金属离子形成配位键的部分的蛋白之间的配位键可通过在含该蛋白的缓冲液中加入与金属离子相对应的盐如NiCl2而形成。优选在没有金属离子的缓冲液中透析金属离子和蛋白的配位键配合物，从而在配位键形成反应后，除去游离金属离子。
本发明制造方法中的术语“使接近导电性支持物”是指使金属离子和具有能形成配位键的部分的蛋白之间的配位键配合物接近导电性支持物，且优选是指将导电性支持物浸在含配位键配合物的溶液中。对浸没导电性支持物的溶液没有特别限制，只要可施加电位，且可使用磷酸盐缓冲溶液等。
在制造方法中，向导电性支持物施加电位可通过下列进行例如，将导电性支持物和参比电极浸在含金属离子与蛋白的配位键配合物的电解液中；并通过使用标准电力供给而施加电位。参比电极的例子包括银-氯化银电极。施加的电位是还原电位，其相对于参比电极是负电位。作为还原电位的优选电位根据导电性支持物的类型而有所不同；且当使用铂作为导电性支持物时，电位相对于参比电极为-10mV或更低，更优选相对于参比电极为-100mV或更低；且特别优选相对于参比电极为-200mV或更低。
在制造其中导电性支持物载于基质上的蛋白芯片时，导电性支持物可按照常规方法结合在基质上，方法的实例包括溅射、蒸汽沉积方法、和离子-喷镀方法、电镀方法、和非-电镀方法。
上述实施方案用于说明制造蛋白芯片的方法，然而，可将与上述相同的过程用于制造其中固定其它生物物质的芯片。
<3>本发明的分析方法本发明的分析方法是分析生物物质或样品中的结合物质的方法，包括使在本发明固定了生物物质的芯片上固定的生物物质与所含物质特异性结合生物物质的样品反应，并检测经由与固定化的生物物质结合而与芯片间接结合的物质。
下面说明使用蛋白芯片的分析方法。
含有能够特异性结合固定在蛋白芯片上的蛋白的、蛋白-结合物质的样品例子包括含蛋白(包括肽)、抗原物质、核酸及医药化合物的样品。那些蛋白-结合物质可以是一类物质，或作为蛋白文库的任意蛋白的混合物，此外，任意化合物的混合物可被用作化合物文库。含那些蛋白-结合物质的各样品可以是溶液，该溶液是通过将那些物质溶于适宜缓冲溶液中制备的，或是生物样品如血液或细胞提取物。
本发明的分析方法可用于各种应用。当把涉及特定疾病的医药靶蛋白用作固定化蛋白并把医药化合物文库用作蛋白-结合物质时，该方法可用于筛选结合靶蛋白的医药化合物。此外，当把可能含有抗原的样品如血液用作含蛋白-结合物质的样品并把特异性识别该抗原的抗体用作固定化的蛋白时，该分析方法可根据是否存在该抗原而诊断疾病。在将任意蛋白的混合物固定并用作蛋白文库，并将特定蛋白或特定化合物用作蛋白-结合物质时，该分析方法可用于研究特异性结合特定蛋白或特定化合物的蛋白的功能分析。
测量对象可以是固定化蛋白或蛋白-结合物质。通过与固定化蛋白结合而间接结合支持物的蛋白-结合物质的检测可如下进行。优选在固定蛋白后，通过使它与过量牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、鲑鱼精子DNA等接触而阻断导电性支持物，以阻止蛋白-结合物质与导电性支持物或基质在反应过程中非-特异性结合。
在固定化蛋白与含蛋白-结合物质的样品反应后，可进行与标准固相免疫测定相同的过程，以检测与固定化蛋白结合的蛋白-结合物质。当固定化蛋白是测量对象时，例如，已经用标记物质标记过的蛋白-结合物质与蛋白芯片反应，然后检测或量化结合在导电性支持物上的标记物质，由此检测或量化蛋白-结合物质，从而检测或量化固定化蛋白。
当蛋白-结合物质是测量对象时，在蛋白芯片与蛋白-结合物质反应过程中，在反应系统中进一步加入用标记物质标记的蛋白-结合物质，样品中蛋白-结合物质的量可通过测量与固定化蛋白结合的标记物质的量而间接测定(抑制技术)。
与固定化蛋白结合的蛋白-结合物质可通过能够特异性结合基质的抗体的反应而检测。例如，当蛋白-结合物质是抗原且固定化蛋白是针对该抗原的抗体(第一抗体)时，蛋白-结合物质可通过其它标记抗体(第二抗体)与导电性支持物-第一抗体-抗原的配合物反应，形成导电性支持物-第一抗体-抗原-第二抗体的配合物，并基于配合物中第二抗体的量检测(三明治技术)。
标记物质可以并不总是自身可检测的物质。例如，当把生物素用作标记物质时，蛋白-结合物质可通过使用与特异性结合生物素的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白偶联的酶而间接检测。
本发明提供分析样品中固定化蛋白或蛋白-结合物质的方法，包括使固定在蛋白芯片上的蛋白与含有能够特异性结合固定化蛋白的蛋白-结合物质的样品反应，并通过向导电性支持物施加氧化电位而将反应所得的固定化蛋白与蛋白-结合物质的配合物从导电性支持物上解离下来。
可通过向固定了蛋白的支持物上施加氧化电位而从导电性支持物上将蛋白解离下来。具体而言，固定在蛋白芯片上的配合物可通过将用于与蛋白-结合物质反应的蛋白芯片浸在电解液中，并相对于参比电极，向蛋白芯片的导电性支持物上施加氧化电位而解离。这里，所施加的电位相对于参比电极是正电位。在使用铂作为导电性支持物的情况下，氧化电位优选相对于参比电极为+10mV或更高，更优选相对于参比电极为+100mV或更高。在本发明的分析方法中，从导电性支持物上解离下来的配合物可直接分析或在将蛋白-结合物质从固定化蛋白分离之后分析。此外，除了上述本发明分析方法中的定量分析外，样品中固定化蛋白或蛋白-结合物质的分析包括定性分析，如各种色谱法和质谱法。
<4>本发明纯化生物物质的方法本发明还提供使用本发明固定了生物物质的芯片纯化生物物质的方法。所述生物物质优选蛋白。本发明的蛋白纯化方法包括下列步骤将导电性支持物浸在含金属离子和具有能够与金属离子形成配位键的部分的蛋白的溶液中，向导电性支持物施加还原电位从而将该蛋白固定在支持物上，将上步获得的、其上固定了蛋白的支持物浸在解离溶液中，并向导电性支持物施加氧化电位，从而将蛋白从支持物上解离下来。在本发明的纯化方法中，洗涤操作可在固定化步骤和解离步骤之间进行，从而减少外源性蛋白的污染。
上述那些相同种类的金属离子、蛋白、导电性支持物等可用于纯化方法，且还可使用与上述那些相同的反应条件，如相同的施加电位。此外，对解离溶液没有特别限制，只要可施加该电位。例如，可使用磷酸盐缓冲溶液，且纯化可在成批-系统或流动-系统中进行。纯化所用的导电性支持物可具有任何一种形状，但优选它所具有形状的表面积较大，例如，优选可提高纯化效率的扫帚或海绵状的导电性支持物。根据本发明的方法，无需使用吸附缓冲溶液和用于标准纯化的蛋白洗脱液，且目标蛋白可在没有稀释的情况下被纯化。
<5>本发明的固定化方法本发明还提供一种将物质固定的方法，包括下列步骤使具有能够与金属离子形成配位键的部分的物质与金属离子形成配位键；使所得配合物接近导电性支持物；并向导电性支持物施加还原电位，从而将具有该部分的物质固定在导电性支持物上。对所固定的物质没有特别限制，可以是生物物质如蛋白或核酸，或可以是非-生物物质如低分子量的聚合物。该固定化方法可按照与上述“Method of manufacturingbiological substance-immobilized chip”相同的方式进行。
实施例之后，将参考实施例详细说明本发明。然而，本发明不限于实施例。
(1)用于与聚组氨酸融合的蛋白A的表达质粒的构造，和与聚组氨酸融合的蛋白A在大肠杆菌中的表达及其纯化用于固定的蛋白是通过将聚组氨酸与蛋白A的5个重复B亚基串(氨基酸序列SEQ ID NO4)连接而制备的。编码蛋白A的B亚基的DNA是通过PCR扩增的。将化学合成的多核苷酸(SEQ ID NO3)及其互补链多核苷酸(SEQ ID NO5)的混合物用作模板。使用具有pstI和AccI位点的5’侧引物(SEQ ID NO1)和具有KpnI和AccI位点的3’侧引物(SEQ ID NO2)作为引物，进行PCR，其中95℃60秒、60℃30秒、72℃30秒，循环30次。
用AccI消化所得PCR产物，并使用连接试剂盒(Takara Bio Inc.)将编码蛋白A的B亚基的各DNA相互连接起来。编码蛋白A的产物可利用AccI以一个方向连接，这是因为AccI识别序列是非-回文序列。随后该连接产物经过琼脂糖凝胶电泳，并将具有蛋白A的5个重复B亚基长度的那些从凝胶上切除下来。使用平端化试剂盒(Takara BioInc.)，将该产物平端化并插入到pBluescript II SK(STRATAGENE)的EcoRV位点中。该质粒用于转化大肠杆菌并从所得菌落中分离出来，根据常规方法用核苷酸测序仪测定所述核苷酸序列。所得质粒被称为pBluescript II SK-蛋白A。
如下，使用合成DNA(SEQ ID NOS6和7)将编码含聚组氨酸的多肽(氨基酸序列SEQ ID NO8)的DNA与编码蛋白A的DNA的羧基末端连接。在相同的试管中，将SEQ ID NOS6和7的合成DNA溶于10mM Tris-EDTA缓冲液中，并在64℃加热1分钟。加热后，将溶液冷却至室温，由此杂交形成双链DNA。将与含聚组氨酸的多肽相对应的DNA序列插入到用Hind II和KpnI消化的pBluescript II SK-蛋白A中。按照与上述相同的方式证实该核苷酸序列。所得质粒被称为pBluescript II SK-蛋白A-His。
通过电穿孔将pBluescript II SK-蛋白A-His质粒引入到大肠杆菌M15的感受态细胞中，并基于氨苄西林抗性获得重组大肠杆菌。通过37℃在LB肉汤中培养所得重组大肠杆菌，并在600nm波长下的吸光度(细菌细胞的浓度)变为0.8时，以0.1mM的终浓度向LB肉汤中加入异丙基-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷，再培养大肠杆菌4小时。超声波处理后，从细菌细胞获得可溶性级分，并上样到IgG-琼脂糖凝胶柱(Pharmacia K.K.)上，从而纯化表达蛋白，由此获得与聚组氨酸融合的蛋白A。
(2)与聚组氨酸融合的蛋白A的电化学固定将上面部分(1)获得的与聚组氨酸融合的蛋白A溶于0.1M磷酸钠缓冲溶液(pH 5.8)中，终浓度达到0.3mg/ml，并以200mM终浓度加入NiCl2。4℃反应2小时后，使与聚组氨酸融合的蛋白A与Ni2+形成配位键。为了除去游离的Ni2+离子，将1ml含有与聚组氨酸融合的蛋白A-Ni2+配合物的溶液倒在透析盒(Slide-A-Lyzer，PierceBiotechnology，Inc)中，并每20分钟在1,000ml没有Ni2+的磷酸钠缓冲溶液(pH5.8)中透析一次，共透析两次。Ni2+离子的配位键合是利用原子吸收分光光度计AA-670(Shimazu Corporation)，通过原子吸收分析加以证实的。
将作为固定化支持物的铂微电极浸在含有与Ni2+离子结合的聚组氨酸融合的蛋白A的溶液中。使用三电极系统施加电位，其中包括作为工作电极的铂电极，作为对电极的铂线圈，作为参比电极的银-氯化银电极，由此进行固定化反应。施加+300mV的初始电位5秒后，施加-100mV的恒定电位5分钟。铂微电极是通过将具有50μm外径的铂丝插入到钠玻璃管(外径1.2mm)中，用加热器密封起来，并用金刚石纸(0.1μm筛目)将边缘抛光而制备的。
通常，当施加电位时，通过基于电荷的非-法拉第电流。然而，在出现还原反应的情况下，观察到非-法拉第电流和法拉第电流。由于施加还原电位而使二价镍离子变为零价镍原子可通过测量法拉第电流加以证实。法拉第电流值是通过在不含Ni2+离子的反应系统中测量实际电流值与非-法拉第电流值之间的差值测定的。观察到320μA/cm2的法拉第电流，其证实通过固定化反应，二价镍离子变为了零价镍原子。
(3)与聚组氨酸融合的蛋白A的固定化状态的评价结合Ni、与聚组氨酸融合的蛋白A的固定化状态的评价是利用蛋白A与IgG抗体蛋白之间的特异性结合进行的。将上述部分(2)中获得的固定了与聚组氨酸融合的蛋白A的微电极浸在含0.5mg/ml辣根过氧化物酶偶联的IgG(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)的0.1M磷酸钠缓冲溶液(pH7.0)中。室温温育1小时后，利用超声清洁器W-113(Honda)在0.1M不含辣根过氧化物酶偶联的IgG的磷酸钠缓冲溶液(pH7.0)中超声清洗微电极。随后，将微电极浸在过氧化物酶发光基质溶液(Duolux，由Pierce Biotechnology，Inc.制造)中。用发光计Gene Light 55(Microtec Co.，Ltd)测量发光量，并利用高灵敏度CCD-照相机L-1100(KEYENCE CORPORATION)观察发光状态。
图2表示发光量的测量。当没有向电极施加电位且只浸在含有与Ni2+离子结合的聚组氨酸融合的蛋白A的溶液中时，没有出现发光反应。另一方面，当把微电极浸在含有与Ni2+离子结合的聚组氨酸融合的蛋白A的溶液中，并向微电极施加-100mV的还原电位时，检测到发光反应。用光电倍增器测量发光量为1.4×1010cps(计数/秒)。虽然图2中没有显示，但在按照与上述相同的方式，向含有未与Ni2+结合的聚组氨酸融合的蛋白A的溶液施加电位的情况下，没有检测到发光反应。
图3表示用高灵敏度的CCD照相机给其上进行发光反应的电极拍摄的照片。当电极上的电化学固定化是使用含有未与Ni2+结合的聚组氨酸融合的蛋白A的溶液进行时，没有检测到发光反应(A)。此外，当没有向电极施加电位且只将电极浸在含有与Ni2+离子配位键合的聚组氨酸融合的蛋白A的溶液中时，没有检测到发光反应(B)。另一方面，当把微电极浸在含有与Ni2+离子配位键合的聚组氨酸融合的蛋白A的溶液中，并向微电极施加-100mV还原电位时，检测到发光反应(C)。虚线表示电极在图3的(A)和(B)中的位置，因为没有观察到发光。如上所述，证实了通过将组氨酸融合的蛋白A配位键合的Ni2+还原为Ni原子，可稳定固定聚组氨酸融合的蛋白A。
此外，为了测定固定化所需的电位范围，通过施加约+200mV--400mV范围的电位进行固定化，并使用与辣根过氧化物酶偶联的IgG评价所得固定化电极的发光。结果证实了可实现固定化，只要电位为-100mV或更高(未给出数据)。
(4)固定化的聚组氨酸融合的蛋白A的解离通过施加250mV电位，将通过上述过程固定的聚组氨酸融合的蛋白A从铂电极上解离下来。聚组氨酸融合的蛋白A自电极上的解离是通过使用辣根过氧化物酶偶联的IgG的发光方法加以证实的(未给出数据)。测定能够解离的电位范围，发现施加+100mV或更高电位可实现解离。
(5)将聚组氨酸融合的蛋白A固定在具有尖顶的铂支持物上使用具有探针的悬臂作为电极，其由硅基质构成且它的尖顶用铂涂覆(Micro Cantilever with platinum coat，由Olympus Corporation制造)。通过下列过程固定聚组氨酸融合的蛋白A。即，将悬臂浸在5％牛血清白蛋白溶液中用于阻断。按照与上述相同的方式，将悬臂浸在含有与Ni2+离子结合的聚组氨酸融合的蛋白A的溶液中，并相对于银-氯化银参比电极，施加-50mV电位5分钟。使用电子显微镜证实固定化。
(6)从大肠杆菌溶解产物中纯化聚组氨酸融合蛋白A37℃，将上述用pBluescript II SK-蛋白A转化的大肠杆菌在6孔平板的LB肉汤中，以15ml/孔培养4小时，然后向肉汤中加入IPTG，并进一步温育转化体4小时。温育完成后，用平板离心机使细菌细胞沉淀，然后用含Ni2+离子的磷酸盐缓冲溶液(组成与上述相同)替换LB肉汤的上清液。随后，如图4所示，利用探针型超声处理器使平板各孔中的细菌细胞破裂，然后将用于纯化的扫帚型支持物浸在溶液中。通过向支持物施加-100mV电位，将溶液中聚组氨酸融合的蛋白A固定在支持物上。
然后，将用于纯化的扫帚型支持物从溶液中取出，并浸在制备于不同的六孔平板中的解离缓冲溶液中(0.1M KH2PO4-K2HPO4和0.1MKCl(pH7.0))。然后，向支持物施加+250mV电位，且由此，固定化的聚组氨酸融合的蛋白A在解离缓冲溶液中解离。结果，纯化0.45mg聚组氨酸融合的蛋白A/孔。最后，在没有用洗脱缓冲液在柱上稀释的情况下，快速且简便地获得了蛋白的纯化。
工业实用性本发明固定了生物物质的芯片优选用于筛选药物等，这是因为可以恒定的方向稳定固定生物物质如蛋白。此外，固定了生物物质的芯片优选用于研究目的，这是因为它可使生物物质从导电性支持物上解离下来，从而在反应后再次使用基质和生物物质，并分析生物物质。此外，它对于生物物质的快速且简便的纯化是有用的。
序列表<110>Kitakyushu Foundation for the Advancement of Industry Science and Technology<120>固定了生物物质的芯片及其用途<130>OP-C4005-PCT<150>JP 2003/69924<151>2003-03-14<150>JP 2003/207081<151>2003-08-11<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>1gctgcagtag acaacaaatt caacaaagaa c 31<210>2<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>2cggtaccgtc tacttttggt gcttgagcat c 31<210>3<211>177<212>DNA<213>金黄色葡萄球菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(177)<223>
<400>3gac aac aaa ttc aac aaa gaa caa caa aat gct ttc tat gaa att tta 48Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu1 5 10 15cat tta cct aac tta act gaa gaa caa cgt aac ggc ttc ate caa agc 96His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Set20 25 30ctt aaa gac gat cct tca gtg agc aaa gaa att tta gca gaa gct aaa144Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala GLu Ala Lys35 40 45aag cta aac gat gct caa gca cca aaa gct aga177Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Arg50 55<210>4<211>59<212>PRT<213>金黄色葡萄球菌
<400>4Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu1 5 10 15His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn G1y Phe Ile Gln Ser20 25 30Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys35 40 45Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Arg50 55<210>5<211>177<212>DNA<213>人工的<220>
<223>互补的<400>5tctagctttt ggtgcttgag catcgtttag ctttttagct tctgctaaaa tttctttgct 60cactgaagga tcgtctttaa ggctttggat gaagccgtta cgttgttctt cagttaagtt120aggtaaatgt aaaatttcat agaaagcatt ttgttgttct ttgttgaatt tgttgtc 177<210>6<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物
<400>6ccatcatcac caccatcact a 21<210>7<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>7agcttagtga tggtggtgat gatgggtac 29<210>8<211>8<212>PRT<213>人工的<220>
<223>聚组氨酸<400>8Gly Thr His His His His His His1 权利要求
1.一种固定了生物物质的芯片，其中所述芯片包含导电性支持物和经由金属原子固定在导电性支持物上的生物物质，且其中所述生物物质具有能够与金属离子形成配位键的部分，且所述金属原子是通过还原金属离子产生的。
2.根据权利要求1所述的固定了生物物质的芯片，其中所述导电性支持物具有尖顶，且所述生物物质经由金属原子而被固定在导电性支持物的尖顶上。
3.根据权利要求1或2所述的固定了生物物质的芯片，其中所述导电性支持物载于基质上。
4.根据权利要求1-3任何一项所述的固定了生物物质的芯片，其中所述能够与金属离子形成配位键的部分是聚组氨酸。
5.根据权利要求1-4任何一项所述的固定了生物物质的芯片，其中所述导电性支持物是金属。
6.根据权利要求1-4任何一项所述的固定了生物物质的芯片，其中所述导电性支持物是选自金、银、铜、铝和铂的一种或多种金属。
7.根据权利要求1-6任何一项所述的固定了生物物质的芯片，其中所述金属原子是通过还原二价金属离子产生的。
8.根据权利要求1-7任何一项所述的固定了生物物质的芯片，其中所述生物物质是蛋白。
9.一种制造固定了生物物质的芯片的方法，其包括下列步骤使具有能够与金属离子形成配位键部分的生物物质与金属离子形成配位键；使所得配合物接近导电性支持物；并向导电性支持物施加还原电位，并由此将具有能够与金属离子形成配位键部分的生物物质固定在导电性支持物上。
10.一种分析生物物质或样品中的物质的方法，包括使固定在权利要求1-8任何一项的固定了生物物质的芯片上的生物物质与含有能够特异性结合该生物物质的物质的样品反应；检测通过结合固定化的生物物质而与芯片间接结合的物质，并分析在固定了生物物质的芯片上固定的生物物质或样品中的物质。
11.一种分析生物物质或样品中的物质的方法，包括使固定在权利要求1-8任何一项的芯片上的生物物质与含有能够特异性结合固定化的生物物质的物质的样品反应；通过向导电性支持物施加氧化电位，而从芯片的导电性支持物上将反应获得的含有固定化的生物物质和特异性结合生物物质的物质的配合物解离下来。
12.一种纯化生物物质的方法，包括下列步骤将导电性支持物浸在含有金属离子和具有能够与金属离子形成配位键的部分的生物物质的溶液中；向导电性支持物施加还原电位，从而使生物物质固定在导电性支持物上；将上步获得的、其上固定了生物物质的导电性支持物浸在解离溶液中；并向导电性支持物施加氧化电位，从而使生物物质从导电性支持物上解离下来。
13.一种固定物质的方法，包括下列步骤使具有能够与金属离子形成配位键的部分的物质与金属离子形成配位键；使所得配合物接近导电性支持物；并向导电性支持物施加还原电位，从而使物质固定在导电性支持物上。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述物质是蛋白。
全文摘要
具有可与金属离子配位键合的部分的生物物质与金属离子配位键合。该生物物质接近导电性支持物，并向导电性支持物施加还原电位。如此，生物物质被固定在导电性支持物上，从而制造出固定了生物物质的芯片。
文档编号B01J19/00GK1761878SQ20048000696
公开日2006年4月19日 申请日期2004年2月27日 优先权日2003年3月14日
发明者春山哲也 申请人:财团法人北九州产业学术推进机构