专利名称：一种超大孔连续床晶胶介质及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种超大孔连续床晶胶介质及其制备方法，属于生物分离与医药技术领域。
背景技术：
超大孔连续床层析分离方法是继扩张床吸附层析后的又一重要的新型生物层析分离技术，可在高流速下实现从复杂料液系统中直接提取和分离目标物。超大孔连续床内有尺寸达数微米至数百微米的超大孔隙，可以使原料液中的细胞、细胞碎片等固相顺利通过，并可实现与扩张床可比拟的高速处理，其成本较低。该方法综合了扩张床和传统固定床的优点，将离心、过滤、浓缩和层析分离几个步骤集为一体，其操作压力低，目标物在床内的停留时间短，选择性强，在重组蛋白、酶、基因治疗用质粒DNA等重要生物大分子物质以及医学领域对抗体、特殊目标细胞(如癌细胞)、微生物细胞的分离纯化方面有广阔应用前景。
晶胶介质的制备方法是超大孔连续床的关键技术。国外对超大孔连续床技术及介质制备方法的研究始于近两年，主要是欧洲的研究小组，尚处于起步阶段。国内尚没有相关研究报道。目前，晶胶介质吸附容量低(例如对溶菌酶的吸附容量约0.2mg/ml介质)是急需解决的问题，需要相关的制备方法与技术。纳米级吸附介质颗粒比表面积巨大，活性高，对蛋白质、酶等生物大分子的吸附容量较常规微米级介质的吸附容量高出1～2个数量级。最近，基于纳米级吸附介质发展起来的生物质纳米介质磁分离技术，具有吸附迅速、吸附容量大的优点，还可以直接处理含有细胞或细胞碎片的复杂料液。但是，将这些纳米级吸附介质从料液中分离出来所需要的磁场强度高，而实际规模化应用时所需的磁场强度不易达到，且强磁场产生的热效应影响目标物的稳定性，对生物质的分离不利，大规模产业化有困难。
发明内容本发明综合利用纳米级吸附介质高吸附容量的优点，以及超大孔连续床集成化分离的优势，避免了外场分离的不利方面，提供了一种具有高吸附容量和分离效率的超大孔连续床晶胶介质。
本发明还提供了一种所述超大孔连续床晶胶介质的制备方法。
本发明所述的超大孔连续床晶胶介质内嵌有尺寸为1～500nm的吸附介质颗粒，所述的吸附介质颗粒优选为1～100nm的纳米粒，如纳米Fe3O4、TiO2、SnO2、Fe2O3以及外裹磷脂类分子膜的复合纳米粒(如外裹1，2-肉豆蔻酰磷脂酰胆碱DMPC、2-肉豆蔻酰磷脂酰甘油DMPG等的内核为金属的复合纳米粒)等，优选为下列之一Fe3O4磁性纳米粒、DMPG复合纳米粒、DMPC复合纳米粒。
所述的晶胶介质具有如下物化性能孔隙率70～95％，孔径范围5～200μm；流速在0.2～15cm/min范围内，晶胶床柱内等板高度小于0.1mm；吸附容量1～50mg BSA/ml床层介质。
本发明所述超大孔连续床晶胶介质的制备方法，包括如下步骤(1)制备稳定剂稳定并分散的吸附介质颗粒混合液，所述颗粒的尺寸在1～500nm；(2)将床层骨架聚合物单体、交联剂、配基材料、吸附介质颗粒混合液、水混合均匀，形成含单体、交联剂、配基材料、吸附介质颗粒总浓度2～15w/v％的混合液，加入引发剂聚合并置入冷却系统中进行冷却结晶，然后升温至室温使晶体融化形成超大孔隙，即得内嵌吸附介质颗粒的超大孔连续床晶胶介质。
所述的步骤(2)中各组分用量优选的百分含量为聚合物单体占混合液的2～14w/v％，聚合物单体∶交联剂∶配基材料∶吸附介质颗粒∶催化剂的重量比为1∶0.05～0.4∶0.05～0.2∶0.01～0.5∶0.01～0.05。
步骤(1)中所述的稳定剂如羟丙基纤维素、短链脂肪酸(异戊酸、己酸、辛酸、癸酸等)，长链脂肪酸(C12、C14、C16、C18等)和不饱和脂肪酸等，优选为C8-C12的脂肪酸，稳定剂的用量为吸附介质颗粒质量的0.1-5倍。
所述的床层骨架聚合物单体如丙烯酰胺(AAm)、N，N-二甲基丙烯酰胺(DMAAm)、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)等，优选为下列之一AAm、DMAAm；所述的吸附介质颗粒优选为1～100nm的纳米级颗粒，如纳米Fe3O4、TiO2、SnO2、Fe2O3以及外裹磷脂类分子膜的复合纳米粒(如外裹1，2-肉豆蔻酰磷脂酰胆碱DMPC、2-肉豆蔻酰磷脂酰甘油DMPG等的内核为金属的复合纳米粒)等，优选为下列之一Fe3O4磁性纳米粒、DMPG复合纳米粒、DMPC复合纳米粒；所述的交联剂如N，N′-亚甲基双丙烯酰胺(MBAAm)、N，N′-双烯丙酰基乙二胺等，优选为MBAAm；所述的配基材料如烯丙基缩水甘油醚(AGE)、1，4-丁二醚等，优选为AGE；所述的催化剂为聚合反应的引发剂、加速剂等，如硫酸铵(APS)、四甲基乙二胺(TEMED)、三乙醇胺、二甲氨基丙睛(DMPN)等，优选为过硫酸铵(APS)和四甲基乙二胺(TEMED)。
步骤(2)中所述的反应液在0～-50℃范围内冷却结晶，多次反复的降温、升温能促使晶胶介质的生成。适宜的变化历程为(A)降温1～3小时内，由0℃下降到-10～-30℃；(B)恒温恒温3～18小时；(C)升温1～5小时内，升温至0℃以上，当达-5～5℃时加入介质体积的25％～90％的水，以减少介质的收缩。
再优选的变化历程为(A)降温1～3小时内，由0℃下降到-10～-30℃；(B)升温1～3小时内，升温至5～10℃；(C)恒温恒温0.5～3小时；(D)降温1～3小时内，重新降温至-5～-20℃；(E)恒温恒温5～18小时；(F)升温1～5小时内，升温至1～10℃，当达-5-5℃时加入介质体积的25％～90％的水，以减少介质的收缩。
步骤(2)中所述的反应液冷却结晶的温度变化历程再优选为(A)线性降温1.5小时内，由0℃下降到-20℃；(B)线性升温1.5小时内，升温至5℃；(C)恒温恒温1小时；(D)线性降温1.5小时内，重新降温至-15℃；(E)恒温恒温12小时；(F)线性升温2小时内，升温至4℃，当达0℃时加入介质体积的50％的水，以减少介质的收缩。
为了得到更纯的晶胶介质，还可以对制得的晶胶介质进行清洗以除去稳定剂、未聚合的单体、交联剂、及未固载的吸附介质颗粒等。如具体方法可以是用蠕动泵在低流速下向晶胶介质内泵入有机溶剂(如丙酮、乙醇、甲醇、异丙醇等的水溶液)，使得吸附介质颗粒周围的稳定剂溶解洗脱；然后向其中注入水或者缓冲液，除去介质孔隙内未聚合的单体、交联剂、稳定剂及未固载的吸附介质颗粒，得到可用于生物大分子物质的吸附分离的晶胶介质。
本发明所述的晶胶介质，具有如下特性1)晶胶介质的物理性能孔隙率70～95％，孔径范围5～200μm，连通性好；水流速1cm/min时，柱压降梯度小于0.05atm/cm；流速在0.2～15cm/min范围内，介质的结构不变。
2)晶胶介质的吸附分离性能流速在0.2～15cm/min范围内，晶胶床柱内等板高度小于0.1mm，分离性能良好；吸附容量1～50mg BSA/ml床层介质，适于分子量10000～100000范围的蛋白质、酶、尺寸10～1000nm质粒DNA等生物大分子的直接分离。
3)晶胶介质的寿命可方便地再生，重复使用20次以上。
本发明所述的晶胶介质具有如下优点1)采用结晶致孔方法，单体材料易得，工艺简单迅速，成本低，规模化生产十分容易；2)晶胶介质超大孔隙尺寸较均匀，连通性好，晶胶介质与床柱壁面间没有“短路”孔；3)吸附容量大，可再生，便于在生物、医学、药物等领域的规模化分离过程中应用。
(四)
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。
实施例1将4.5g FeCl2·4H2O和12.3g FeCl3·6H2O溶于230ml去离子水中，加热到84℃，向其中加入40ml含0.8g癸酸的乙醇溶液和18ml 28％的NH4OH，搅拌；然后，继续加入癸酸19g，恒温搅拌60min，冷却至室温，得到尺寸在10～15nm的Fe3O4磁性纳米粒吸附介质。用分子量截留值MWCO 10000的半透膜透析48小时以除去小分子杂质，制备得到稳定分散的Fe3O4纳米粒吸附介质混合液。
将1.4g丙烯酰胺单体，0.17g交联剂MBAAm和0.27g配基材料AGE溶于12ml去离子水中，加入10ml含260mg Fe3O4磁性纳米粒吸附介质的混合液，搅拌均匀后，迅速加入10mg TEMED和23mg APS，将所得混合液装入内径16mm、长200mm的玻璃层析柱内，密封后，在可程序控温的恒温冷却系统中，进行冷却结晶致孔。温度变化历程为(A)线性降温1.5小时内，由0℃下降到-20℃；(B)线性升温1.5小时内，升温至5℃；(C)恒温恒温1小时；(D)线性降温1.5小时内，由0℃重新降温至-15℃；(E)恒温恒温12小时；(F)线性升温2小时内，升温至4℃，当达0℃左右时加入10ml的水，以减少介质的收缩；然后，在室温下融化晶体，形成超大孔隙，得到内嵌纳米粒超大孔连续床晶胶介质。用扫描电子显微镜SEM和透射电子显微镜TEM，分别对介质的超大孔及纳米粒内嵌情况进行了分析。制备得到的介质外观呈褐色，孔隙率89％，SEM显示其孔径范围10～50μm，连通性好；水流速1cm/min时，柱压降梯度小于0.03atm/cm；流速在0.2～15cm/min范围内，介质的结构不变，晶胶床柱内等板高度0.09mm，分离性能良好；吸附容量10mg BSA/ml床层介质，适于生物大分子的直接分离，可再生。介质经干燥后，结构不变，重新置于水中，1～2秒内即恢复原状，弹性和耐压性能很好。
实施例2将2.9g DMAEMA单体，0.15g交联剂MBAAm和0.16g配基材料AGE溶于15ml去离子水中，加入7ml十二酸稳定的含60mg TiO2纳米粒(450nm)吸附介质的混合液，搅拌均匀后，迅速加入12mg TEMED和25mg APS，将所得混合液装入内径16mm、长200mm的玻璃层析柱内，密封后，在可程序控温的恒温冷却系统中，进行冷却结晶致孔。温度变化历程为(A)线性降温1.8小时内，由0℃下降到-25℃；(B)线性升温2小时内，升温至3℃；(C)恒温恒温2小时；(D)线性降温3小时内，由0℃重新降温至-17℃；(E)恒温恒温18小时；(F)线性升温4小时内，升温至5℃，当达0℃左右是加入15ml的水，以减少介质的收缩；在室温下融化晶体，形成超大孔隙。这样，得到内嵌纳米粒超大孔连续床晶胶介质，其孔隙率72％，孔径范围5～40μm，连通性好；水流速1cm/min时，柱压降梯度小于0.028atm/cm；流速在0.2～13cm/min范围内，介质的结构不变，晶胶床柱内等板高度0.07mm，分离性能良好；吸附容量2.2mgBSA/ml床层介质，适于生物大分子的直接分离，可再生。
实施例3将2.5g DMAAm单体，0.25g交联剂MBAAm和0.27g配基材料AGE溶于50ml去离子水中，加入19ml十二酸稳定的含750mg Fe2O3纳米粒(32nm)吸附介质的混合液，搅拌均匀后，迅速加入27mg TEMED和72mgAPS，将所得混合液装入内径26mm、长300mm的玻璃层析柱内，密封后，在可程序控温的恒温冷却系统中，进行冷却结晶致孔。温度变化历程为(A)线性降温2.4小时内，由0℃下降到-23℃；(B)线性升温2小时内，升温至4℃；(C)恒温恒温1小时；(D)线性降温5小时内，由0℃重新降温至-12℃；(E)恒温恒温18小时；(F)线性升温4小时内，升温至10℃，当达0℃左右是加入15ml的水，以减少介质的收缩；在室温下融化晶体，形成超大孔隙。这样，得到内嵌纳米粒超大孔连续床晶胶介质，其孔隙率94％，孔径范围15～120μm，连通性好；水流速1cm/min时，柱压降梯度小于0.028atm/cm；流速在0.1～15cm/min范围内，介质的结构不变，晶胶床柱内等板高度0.1mm，分离性能良好；吸附容量38mg BSA/ml床层介质，适于生物大分子的直接分离，可再生。
实施例4将含有SnO2混合液与含DMPC的溶液混合，经超声波乳化分散，制备得到稳定分散的复合纳米粒混合液。将5.8g DMAAm单体，1.2g交联剂MBAAm和0.48g配基材料AGE溶于23ml去离子水中，加入26ml含2300mgDMPC复合纳米粒吸附介质的混合液，搅拌均匀后，迅速加入27mg TEMED和39mg APS，将所得混合液装入内径26mm、长200mm的玻璃层析柱内，密封后，在可程序控温的恒温冷却系统中，进行冷却结晶致孔。温度变化历程为(A)线性降温1.5小时内，由0℃下降到-20℃；(B)恒温恒温14.5小时；(C)线性升温3小时内，升温至5℃，当达0℃左右时加入20ml的水，以减少介质的收缩；然后，在室温下融化晶体，形成超大孔隙，得到内嵌纳米粒超大孔连续床晶胶介质，孔隙率83％，孔径范围10～120μm，连通性好；水流速1cm/min时，柱压降梯度0.012atm/cm；流速在0.2～15cm/min范围内，介质的结构不变，晶胶床柱内等板高度0.069mm，分离性能良好；吸附容量49mgBSA/ml床层介质，适于生物大分子的直接分离，可再生。
实施例5将十二酸稳定的Fe3O4混合液与含DMPG的溶液混合，经超声波乳化分散，制备得到稳定分散的DMPG复合纳米粒混合液。将1.1g AAm单体，0.4g交联剂MBAAm和0.21g配基材料AGE溶于33ml去离子水中，加入6ml含120mg DMPC复合纳米粒(20nm)吸附介质的混合液，搅拌均匀后，迅速加入9mg TEMED和20mg APS，将所得混合液装入内径16mm、长300mm的玻璃层析柱内，密封后，在可程序控温的恒温冷却系统中，进行冷却结晶致孔。温度变化历程为(A)线性降温1小时内，由0℃下降到-12℃；(B)恒温恒温18小时；(C)线性升温5小时内，升温至4℃，当达0℃左右时加入5ml的水，以减少介质的收缩；然后，在室温下融化晶体，形成超大孔隙，得到内嵌纳米粒超大孔连续床晶胶介质，孔隙率95％，孔径范围10～180μm，连通性好；水流速1cm/min时，柱压降梯度0.01atm/cm；流速在0.1～15cm/min范围内，介质的结构不变，晶胶床柱内等板高度0.097mm，分离性能良好；吸附容量17mg BSA/ml床层介质，适于生物大分子的直接分离，可再生。
实施例6将7.8g丙烯酰胺，2.4g交联剂MBAAm和1.2g配基材料AGE溶于60ml去离子水中，加入30ml含670mg DMPC与DMPG(质量比1∶1.5)复合纳米粒(22nm)吸附介质的混合液，搅拌均匀后，迅速加入110mg TEMED和251mg APS，将所得混合液装入内径26mm、长300mm的玻璃层析柱内，密封后，在可程序控温的恒温冷却系统中，进行冷却结晶致孔。温度变化历程为(A)线性降温3小时内，由0℃下降到-42℃；(B)线性升温2小时内，升温至3℃；(C)恒温恒温0.5小时；(D)线性降温3小时内，由0℃重新降温至-12℃；(E)恒温恒温18小时；(F)线性升温2小时内，升温至5℃，当达0℃左右是加入20ml的水，以减少介质的收缩；然后，在室温下融化晶体，形成超大孔隙，得到内嵌纳米粒超大孔连续床晶胶介质，孔隙率86％，孔径范围10～70μm，连通性好；水流速1cm/min时，柱压降梯度0.03atm/cm；流速在0.1～15cm/min范围内，介质的结构不变，晶胶床柱内等板高度0.069mm，分离性能良好；吸附容量28mg BSA/ml床层介质，适于生物大分子的直接分离，可再生。
权利要求
1.一种超大孔连续床晶胶介质，其特征在于所述的晶胶介质内嵌有尺寸为1～500nm的吸附介质颗粒。
2.如权利要求1所述的超大孔连续床晶胶介质，其特征在于所述的吸附介质颗粒为1～100nm的纳米粒，晶胶介质具有如下物化性能孔隙率70～95％，孔径范围5～200μm；流速在0.2～15cm/min范围内，晶胶床柱内等板高度小于0.1mm；吸附容量1～50mg BSA/ml床层介质。
3.一种权利要求1所述超大孔连续床晶胶介质的制备方法，包括如下步骤(1)制备稳定剂稳定并分散的吸附介质颗粒混合液，所述颗粒的尺寸在1～500nm；(2)将床层骨架聚合物单体、交联剂、配基材料、吸附介质颗粒混合液、水混合均匀，形成含单体、交联剂、配基材料、吸附介质颗粒总浓度2～15w/v％的混合液，加入催化剂聚合并置入冷却系统中进行冷却结晶，然后升温至室温使晶体融化形成超大孔隙，即得内嵌吸附介质颗粒的超大孔连续床晶胶介质。
4.如权利要求3所述的超大孔连续床晶胶介质的制备方法，其特征在于所述的步骤(2)中聚合物单体占混合液的2～14w/v％，所述的聚合物单体∶交联剂∶配基材料∶吸附介质颗粒∶催化剂的重量比为1∶0.05～0.4∶0.05～0.2∶0.01～0.5∶0.01～0.05。
5.如权利要求3所述的超大孔连续床晶胶介质的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的稳定剂为C8～C12的脂肪酸，稳定剂用量为吸附介质颗粒质量的0.1～5倍。
6.如权利要求3所述的超大孔连续床晶胶介质的制备方法，其特征在于所述的床层骨架聚合物单体为下列之一丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、2-二甲氨基甲基丙烯酸乙酯；所述的交联剂为N，N′-亚甲基双丙烯酰胺，所述的配基材料为烯丙基缩水甘油醚，所述的催化剂为过硫酸铵和四甲基乙二胺。
7.如权利要求3所述的超大孔连续床晶胶介质的制备方法，其特征在于所述的吸附介质颗粒为下列之一Fe3O4磁性纳米粒、外裹1，2-肉豆蔻酰磷脂酰胆碱DMPC复合纳米粒或2-肉豆蔻酰磷脂酰甘油DMPG复合纳米粒。
8.如权利要求3～7之一所述的超大孔连续床晶胶介质的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的反应液在0～-50℃范围内冷却结晶。
9.如权利要求8所述的超大孔连续床晶胶介质的制备方法，其特征在于反应液冷却结晶的温度变化历程为(A)降温1～3小时内，由0℃下降到-10～-30℃；(B)恒温恒温3～18小时；(C)升温1～5小时内，升温至0℃以上，当达-5～5℃时加入介质体积的25％～90％的水，以减少介质的收缩。
10.如权利要求9所述的超大孔连续床晶胶介质的制备方法，其特征在于所述的反应液冷却结晶的温度变化历程为(A)线性降温1.5小时内，由0℃下降到-20℃；(B)线性升温1.5小时内，升温至5℃；(C)恒温恒温1小时；(D)线性降温1.5小时内，重新降温至-15℃；(E)恒温恒温12小时；(F)线性升温2小时内，升温至4℃，当达0℃时加入介质体积的50％的水，以减少介质的收缩。
全文摘要
本发明提供了一种超大孔连续床晶胶介质及其制备方法。所述的超大孔连续床晶胶介质内嵌有尺寸为1～500nm的吸附介质颗粒，所述的制备方法包括如下步骤(1)制备稳定剂稳定并分散的吸附介质颗粒混合液；(2)将床层骨架聚合物单体、交联剂、配基材料、吸附介质颗粒混合液、水混合均匀，形成混合液，加入引发剂聚合并置入冷却系统中进行冷却结晶，然后升温至室温使晶体融化形成超大孔隙，即得内嵌吸附介质颗粒的超大孔连续床晶胶介质。本发明所述的晶胶介质超大孔隙尺寸较均匀，连通性好，晶胶介质与床柱壁面间没有“短路”孔；吸附容量大，可再生，便于在生物、医学、药物等领域的规模化分离过程中应用。
文档编号B01D15/08GK1736579SQ200510060269
公开日2006年2月22日 申请日期2005年8月2日 优先权日2005年8月2日
发明者贠军贤, 姚克俭, 沈绍传 申请人:浙江工业大学