专利名称：杂交方法、杂交微阵列和杂交试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及同时杂交多种样品生物聚合物和探针生物聚合物的杂交方法以及杂交微阵列和杂交试剂盒。
背景技术：
使具有已知序列的核酸或蛋白质探针与标记有荧光物质的样品DNA(通常是样品生物聚合物)杂交的方法通常被用来在体内鉴定/分离分子，尤其用于检测靶DNA或基因DNA的存在/缺失。更具体地说，该方法是用将探针DNA(通常是探针生物聚合物)固定到载玻片上形成的DNA芯片(通常是微阵列)进行的。
为在小量样品DNA溶液中有效杂交样品DNA和探针DNA，通常采用以下两种类型的方法在第一种方法中，将含有标记有荧光物质的样品DNA的溶液滴到固定有探针DNA的载玻片上，然后盖上盖玻片。将其和润湿剂一起储存在称为杂交室的密闭容器中然后在约65℃保温8-16小时进行杂交。当样品DNA结合探针DNA时样品DNA也被固定到探针DNA上，从而可通过光源发出的激发光激发标记在固定的样品DNA上的荧光物质并检测发出的荧光来检测杂交的样品DNA。
在第二种方法中，通过在固定有探针DNA的载玻片上预先形成能够容纳溶液的可分离容器、注入含有进行的标记有荧光物质的样品DNA的溶液、通过密封注射口将容器闭合、然后在约65℃保温8-16小时进行杂交。当样品DNA结合探针DNA时样品DNA也被固定到探针DNA上。开启容器、洗涤载玻片、然后用光源发出的激发光激发标记在固定的样品DNA上的荧光物质并检测发出的荧光来检测杂交的DNA。
在第一种现有技术方法中，将盖玻片放到滴加到载玻片上的含有样品DNA的溶液上时需要经验和技术，以免在盖玻片和载玻片之间的间隙中引入气泡。如果间隙中引入了气泡就不能正确进行杂交。
此外，放在载玻片上的盖玻片通过杂交液与载玻片紧密接触，因此探针DNA上的点可能会被损坏，而且如果取去盖玻片可能会检测到非正常的点。然而，盖玻片非常薄且非常轻，将其放在滴到载玻片上的含有样品DNA的溶液的中心位置需要经验和技术。
此外，盖玻片必需正确放到固定有探针DNA的载玻片上，因此不能使用可能会干扰操作的小的盖玻片。更具体地，极限是一片载玻片上有2片盖玻片。这就是说一片载玻片上只能杂交两种样片。此外，杂交液的体积可能随润湿剂的组成发生改变，从而导致污染载玻片上的两种样品。
在现有技术的第二种方法中，可分离的容器不能完全装满溶液，容器中通常会残留空气，从而导致不正确的杂交。
本发明的一个目的是提供一种简单且可靠地使样品生物聚合物与探针DNA相互杂交的方法，考虑到上述问题，该方法不使用盖玻片和密闭容器。
考虑到上述问题，本发明的另一个目的是提供一种简单且可靠地使多种样品生物聚合物和探针DNA相互杂交的方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明的杂交方法在含有与含有样品的溶液具有相同蒸气压的溶液的密闭容器中进行，使含有样品生物聚合物的溶液仅与固定有探针生物聚合物的载玻片接触，从而使样品生物聚合物和探针生物聚合物相互杂交。选择通过在饱和该密闭容器体积的水蒸气量中加入至少100μL获得的量和含有样品生物聚合物的溶液至少5倍量中的较大者，将其作为与含有所述样品生物聚合物的溶液具有相同蒸气压的溶液的量。
本发明的杂交方法宜在由亲水区和疏水区构成的载玻片上进行，亲水区表面固定有许多探针生物聚合物，而围绕亲水区的疏水区上未固定有探针生物聚合物。
此外，用于本发明的载玻片宜为通过排列多个固定有许多探针生物聚合物的亲水区和围绕该排列的多个亲水区形成的未固定有探针生物聚合物的疏水区形成的微阵列。
本发明还提供了用于本发明的上述杂交方法的杂交微阵列，该微阵列是通过排列多个固定有许多探针生物聚合物的亲水区和围绕该排列的多个亲水区形成的未固定有探针生物聚合物的疏水区形成的。
本发明还提供了用于本发明的上述杂交方法的杂交试剂盒，所述试剂盒中包含通过排列多个固定有许多探针生物聚合物的亲水区和围绕该排列的多个亲水区形成的未固定有探针生物聚合物的疏水区形成的微阵列，和具有能够储存所述微阵列的内部空间的密闭容器。
附图简述
图1显示了优选用于本发明杂交方法的示例性微阵列1。
图2显示了将含有样品生物聚合物的溶液5滴加到图1所示微阵列1亲水区2上时的状态。
图3显示了用于进行本发明杂交方法的示例性密闭容器。
实施本发明的最佳模式本发明杂交方法的一个特征在于，样品生物聚合物和探针生物聚合物在含有样品生物聚合物的溶液仅与固定有探针生物聚合物的载玻片接触的状态下相互杂交。“仅与载玻片接触”是指这样一种状态，其中含有样品生物聚合物的溶液不与杂交通常要求的盖玻片或者类似物体接触。根据本发明，不需要现有技术使探针生物聚合物与样品生物聚合物有效杂交所必需的盖玻片等结构便可进行杂交，因此可以非常简单可靠地进行杂交。
在本说明书中，术语“样品生物聚合物”指可通过杂交来鉴定/分离的生物聚合物，例如包括DNA、RNA、肽或蛋白质。
根据样品生物聚合物的类型，可选择该领域通常广泛采用的合适溶剂作为含有样品生物聚合物的溶液的溶剂。例如，当样品生物聚合物是DNA时可采用含去污剂和盐的水溶液，考虑到试剂的适应性和杂交反应的稳定性，特别优选采用SDS作为去污剂和SSC作为含盐的水溶液。例如，可采用含0.5％SDS的5×SSC。由于样品生物聚合物通常比较贵重，因此制备的样品生物聚合物溶液的浓度宜为1ng/μL至1μg/μL，但如果浓度足以检到测则没有特别限制。
样品生物聚合物通常被标记以便在杂交后检测。至于标记，有荧光标记、有机染料标记、化学发光标记、放射性标记或抗体标记等合适的熟知标记，考虑到检测的安全性和简易性，尤其优选荧光标记。
本说明书中，术语“探针生物聚合物”指可与样品生物聚合物杂交并可固定到载玻片上的生物聚合物，例如包括DNA、RNA、蛋白质或肽。
在本发明中，为将探针生物聚合物固定到载玻片上，可根据探针生物聚合物的类型适当选择通常广泛用于该领域的固定生物聚合物的试剂。聚-L-赖氨酸或氨基硅烷可作为这种试剂。
用于本发明的杂交方法的载玻片不限于由玻璃制成，也可由塑料或金属制成，更优选用不具有生化活性的材料制成。载玻片宜由玻璃制成，这是由于可以方便地在其表面形成下面所述的亲水区和疏水区。
本发明的杂交方法的另一个特征在于，上述杂交是在装有与含有样品生物聚合物的溶液具有相同蒸气压的溶液(该溶液以下称为“润湿剂”)的密闭容器中进行的。换句话说，杂交是将含有样品生物聚合物的溶液滴到载玻片上并将该载玻片放入装有与含有样品生物聚合物的溶液具有相同蒸气压的润湿剂的密闭容器(杂交室)中进行的。将微阵列放在密闭容器中，因此含有样品生物聚合物的溶液不与润湿剂接触。选择在饱和该密闭容器体积的水蒸气量中加入至少100μL所获得的量和含该样品生物聚合物的溶液至少5倍量中的较大者，将其作为与含有所述样品生物聚合物的溶液具有相同蒸气压的溶液的量。由于非挥发性溶质造成的蒸气压降低与该溶质的摩尔浓度成比例，因此，在本发明中，“相同的蒸气压”表示“相同的溶质摩尔浓度”。“相同的溶质摩尔浓度”指含有样品生物聚合物的溶液所含溶质的摩尔浓度与润湿剂所含溶质的摩尔浓度之间的差异为-10至+8％(更优选为-5到+5％)。
为采用蒸气压与上述含有样品生物聚合物的溶液相同的润湿剂，可采用与所述溶液具有相同组成但含有样品生物聚合物的溶液作为润湿剂。如果样品生物聚合物是DNA，则按照上文的描述，优选将含有0.5％SDS的5×SSC溶液用作含有样品生物聚合物的溶液，通过制备也含有0.5％SDS的5×SSC的润湿剂可使这些蒸气压相互一致。在含有样品生物聚合物的溶液中，样品生物聚合物的浓度(与该溶液的盐浓度相比非常低)也在上述相同的差异范围之内并可忽略。
无须干燥载玻片上的含有样品生物聚合物的溶液或者无须通过增加溶液体积以使其溢出，便可在储存有润湿剂的密闭容器内完成杂交，所述润湿剂具有与上述含有样品生物聚合物的溶液相同的蒸气压。在本发明的杂交方法中，如果润湿剂的蒸气压远低于含有样品生物聚合物的溶液的蒸气压，则含有样品生物聚合物的溶液的量显著减少或杂交过程中由于蒸气扩散导致该溶液干涸，从而不能正确进行杂交。另一方面，如果润湿剂的蒸气压远高于含有样品生物聚合物的溶液的蒸气压，则含有样品生物聚合物的溶液的量显著增加，从而导致溶液溢出而不能正确进行杂交。
在本发明的杂交方法中，所述载玻片宜由亲水区和疏水区构成，亲水区表面固定有多种探针生物聚合物，而围绕亲水区的疏水区上未固定有探针生物聚合物。因此，滴加到载玻片上固定有探针生物聚合物的亲水区的含有样品生物聚合物的溶液被保留在亲水区而不会流入疏水区。术语“亲水”指通过图象处理型接触角测定仪(KyowaInterface Science Co.，Ltd.的接触角测定仪CA-X)测得的液滴与水的接触角(放在某平面物体表面上的液滴与该物体表面的接触面之间的边界上的液滴表面切线与所述物体表面之间的角度)小于90°，术语“疏水”指所述液滴接触角至少为90°。
至于在载玻片上形成上述亲水区和疏水区的方法，例如，如果载玻片由玻璃制成，应为其表面本来就是亲水的，从而可在所需区域形成亲水区而形成疏水区。例如，可用印刷防水氟树脂墨水法形成疏水区。印刷有这种防水氟树脂墨水的载玻片可通过商业购得(商品名Matsunami Glass Ind.Ltd.制造的防水印刷载玻片)。形成疏水区的方法不限于上述使用防水氟树脂墨水的方法，也可通过例如施加有机硅树脂并使其硬化来形成疏水区。
至于本发明所用的载玻片，宜在亲水区表面形成用来固定生物聚合物的试剂，但不宜在围绕亲水区的疏水区上形成这种试剂。因此，只可将探针生物聚合物固定在亲水区。上述聚-L-赖氨酸或氨基硅烷可作为这种试剂的例子。
由于本发明所用的载玻片可具有至少一个上述亲水区和疏水区，宜采用通过排列多个亲水区和围绕这些亲水区形成的疏水区形成的微阵列。通过排列多个固定有探针生物聚合物的亲水区所形成的微阵列进行本发明的杂交方法可实现在同一载玻片上同时进行多种类型的样品生物聚合物的杂交。
图1显示了优选用于本发明杂交方法的示例性微阵列1。图1所示的微阵列1在其表面具有24个亲水区2和围绕这些亲水区2形成的疏水区3。将多种探针生物聚合物固定于各亲水区2上(在图1所示的例子中，24种探针生物聚合物被点在各亲水区2上)。根据本发明，优选采用由固定有探针生物聚合物的多个亲水区2和围绕亲水区2的疏水区3在载玻片表面上选择性形成的微阵列使样品生物聚合物和探针生物聚合物相互杂交。
图2显示了将含有样品生物聚合物的溶液5滴加到图1所示微阵列1亲水区2的状态。当将含有样品生物聚合物的溶液滴加到微阵列1的任一亲水区时，这些溶液在亲水区的铺展受到疏水区限制而不会进一步扩散到其它亲水区上，因此滴加到相邻亲水区上的含有样品生物聚合物的溶液便不会相互混合。因此，当将含有样品生物聚合物的溶液滴加到固定有探针生物聚合物的亲水区与图1所示的微阵列杂交时，这些溶液不会流出该亲水区，从而当将含有不同类型样品生物聚合物的溶液滴加到各亲水区时这些溶液也不会污染。因此，可在一个微阵列上选择性杂交含有多种类型(当使用图1所示的示例性微阵列时最多为24种)不同样品生物聚合物的溶液。
图3显示了用于进行本发明的杂交方法的示例性密闭容器(杂交室)。该密闭的室主要包括例如下盖7和上盖8，因此当将上盖和下盖8，7相互叠加在一起时在上盖和下盖8，7之间形成了可提供密闭状态的内部空间。如此构成了图3所示的示例性密闭容器，其中在下盖7上装有O形橡胶环9，当将上盖和下盖8，7相互叠加在一起时上盖和下盖8，7形成了一个内部空间。
例如，可按照以下程序进行采用这种密闭容器的杂交方法首先，将含有样品生物聚合物的溶液5滴加到上述微阵列的亲水区上。将微阵列1置于下盖7中。当如上所述将下盖7与上盖8叠加时下盖7的凹陷形成了内部空间的一部分，该凹陷部分存放有与上述含有样品生物聚合物的溶液5具有相同蒸气压的润湿剂6。上盖8叠加在下盖7之上，将微阵列1密封在内部空间中。在这种状态下，将此密闭容器在约65℃保温8-16小时，使样品生物聚合物与探针生物聚合物相互杂交。当样品生物聚合物结合探针生物聚合物时，样品生物聚合物和探针生物聚合物一起被固定到微阵列上。杂交后从密闭容器中取出微阵列，将微阵列浸入洗涤液(洗涤液的示例性组成为0.2×SSC溶液和0.5×SSC溶液，含有0.1％SDS)中洗涤，之后用光源发出的激发光激发标记在固定到微阵列上的样品生物聚合物上的荧光物质，并通过例如微阵列扫描仪等检测发出的荧光，以此来检测杂交的样品生物聚合物。
在本发明中，上述密闭容器，例如包括通过铝模压铸制成的上盖8和下盖7可以是能够密封微阵列的容器，并且，例如用来保存食物的Tupperware厨房塑料制品也可用作密闭容器。
本发明还提供通过排列多个固定有多种探针生物聚合物的亲水区和围绕该排列的多个亲水区形成的未固定有探针生物聚合物的疏水区形成的杂交微阵列。上述微阵列是一种新的微阵列，特别适用于本发明的上述杂交方法。
本发明还提供了一种杂交试剂盒，其装有通过排列多个固定有许多探针生物聚合物的亲水区和围绕该排列的多个亲水区形成的未固定有探针生物聚合物的疏水区形成的微阵列以及具有能够密封储存所述微阵列的内部空间的密闭容器。换句话说，优选适用于本发明的上述杂交方法的微阵列和密闭容器的组合可以试剂盒的形式提供。含有样品生物聚合物的溶液和润湿剂宜按上述方法相互混合，并且，使用这种试剂盒特别适合于本发明上述杂交方法。本发明的试剂盒也可将润湿剂预先存放在容器中，当然，也可将样品生物聚合物溶于这种润湿剂来适当制备含有样品生物聚合物的溶液。
虽然现在将更加具体地描述本发明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)制备了1×106个HeLa细胞的10μg总RNA。用Labelstar Array试剂盒(Qiagen)和Cy3-dUTP(Amersham Biosciences)从制得的10μgHeLa细胞总RNA制备Cy3标记的HeLa cDNA作为样品生物聚合物。用含有0.5％SDS的5×SSC溶液调节样品生物聚合物的量至120μL(含有样品生物聚合物的溶液的溶质摩尔浓度为1.67mol/L)。
将按上述方法制备的含有样品生物聚合物的溶液滴加到微阵列亲水区上，该微阵列表面有24个亲水区和围绕这些亲水区的疏水区，每个亲水区固定有4种探针生物聚合物，分别为具有序列表中序列1-4所示碱基序列的甘油醛-3-磷酸脱氢酶、内切核酸酶G、pU 18和λ噬菌体DNA的70聚体探针(在DNA合成仪中合成)，用作固定于亲水区的探针生物聚合物。
滴加含有样品生物聚合物的溶液之后，将微阵列置于图3所示的由下盖7和上盖8构成的密闭容器(杂交室)的下盖7上。在下盖7的凹陷处预先存放有600μL含0.5％SDS的5×SSC作为润湿剂(润湿剂的溶质摩尔浓度为1.67mol/L，含有样品生物聚合物的溶液的溶质摩尔浓度与其的差异为±0％)。将上盖8叠加在下盖7上以将微阵列1密封在内部空间内，65℃保温该密闭容器14小时，使样品生物聚合物与探针生物聚合物相互杂交。
杂交后从密闭容器中取出微阵列并测定含有样品生物聚合物的溶液的量，该量比滴加时减少了5.5μL，液体变化(liquid change)为4.6％。之后将微阵列浸在洗涤液(含有0.1％SDS的0.2×SSC溶液和0.5×SSC溶液)中进行洗涤，然后用光源发出的激发光激发标记在固定到微阵列上的样品生物聚合物上的Cy3，通过微阵列扫描仪检测激发的荧光，从而可检测杂交的生物聚合物。因此，使含有样品生物聚合物的溶液仅接触固定有探针生物聚合物的载玻片而无需干燥微阵列上含有样品生物聚合物的溶液，便可完成杂交。
实施例2类似于实施例1进行杂交，但采用600μL含有0.5％SDS的4.5×SSC(润湿剂的溶质摩尔浓度为1.50mol/L，含有样品生物聚合物的溶液的溶质摩尔浓度与其的差异为-10％)作为润湿剂。当杂交后测定含有样品生物聚合物的溶液的量时发现，相比滴加时该量增加了4.9μL，液体变化为4.1％。因此，使含有样品生物聚合物的溶液仅接触固定有探针生物聚合物的载玻片而无需增加含有样品生物聚合物的溶液的体积并而该溶液溢出亲水区，便可完成杂交。
实施例3类似于实施例1进行杂交，但采用600μL含有0.5％SDS的5.4×SSC(润湿剂的溶质摩尔浓度为1.80mol/L，含有样品生物聚合物的溶液的溶质摩尔浓度与其的差异为+8％)作为润湿剂。当杂交后测定含有样品生物聚合物的溶液的量时发现，相比滴加时该量减少了12.0μL，液体变化为10.0％。因此，使含有样品生物聚合物的溶液仅接触固定有探针生物聚合物的载玻片而无需干燥微阵列上含有样品生物聚合物的溶液，便可完成杂交。
对比实施例1类似于实施例1进行杂交，但采用600μL含有0.5％SDS的4×SSC(润湿剂的溶质摩尔浓度为1.33mol/L，含有样品生物聚合物的溶液的溶质摩尔浓度与其的差异为-20％)作为润湿剂。当杂交后测定含有样品生物聚合物的溶液的量时发现，相比滴加时该量增加了17.4μL(液体变化为14.5％)，含有样品生物聚合物的溶液的量显著增加以至于该溶液溢出而不能正常进行杂交。
对比实施例2类似于实施例1进行杂交，但采用600μL含有0.5％SDS的5.5×SSC(润湿剂的溶质摩尔浓度为1.83mol/L，含有样品生物聚合物的溶液的溶质摩尔浓度与其的差异为+10％)作为润湿剂。当杂交后测定含有样品生物聚合物的溶液的量时发现，相比滴加时该量减少了14.3μL(液体变化为11.9％)，含有样品生物聚合物的溶液的量在杂交过程中由于蒸气扩散而显著减少，从而不能正常进行杂交。
对比实施例3类似于实施例1进行杂交，但采用600μL含有0.5％SDS的6×SSC(润湿剂的溶质摩尔浓度为2.00mol/L，含有样品生物聚合物的溶液的溶质摩尔浓度与其的差异为+20％)作为润湿剂。当杂交后测定含有样品生物聚合物的溶液的量时发现，相比滴加时该量减少了21.9μL(液体变化为18.2％)，含有样品生物聚合物的溶液的量在杂交过程中由于蒸气扩散而显著减少，从而不能正常进行杂交。
表1显示了实施例1-3和对比实施例1-3的上述结果。
表1
工业适用性根据本发明的杂交方法，在载玻片上没有为有效进行杂交通常所需的诸如盖玻片等结构，因此可以特别简单可靠地进行杂交。此外，通过采用本发明的杂交微阵列和杂交试剂盒可简单可靠地同时检测多种类型样品生物聚合物的多种标本同时杂交。因此，相比现有技术可显著减少处理大量样品的时间以及必需的微阵列数目和所需试剂的用量。
序列表<110>仓敷纺绩株式会社(KURASHIKI BOSEKI KABUSHIKI KAISHA)<120>杂交方法、杂交微阵列和杂交试剂盒<130>904465<150>JP2004-056511<151>2004-03-01<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>70<212>DNA<213>人造的<220>
<223>甘油醛-3-磷酸脱氢酶的70聚体探针<400>1gctgagaacg ggaagcttgt catcaatgga aatcccatca ccatcttcca ggagcgagat60ccctccaaaa 70<210>2<211>70<212>DNA<213>人造的<220>
<223>内切核酸酶G的70聚体探针<400>2tggagcgctt cctggtgccc atcgagagca ttgagcgggc ttcggggctg ctctttgtgc60caaacatcct 70<210>3<211>70<212>DNA<213>人造的<220>
<223>pU18的70聚体探针<400>3cgactctaga ggatccccgg gtaccgagct cgaattcgta atcatggtca tagctgtttc60ctgtgtgaaa 70<210>4<211>70<212>DNA<213>人造的<220>
<223>λ噬菌体DNA的70聚体探针<400>4gtccttctcg gtgcatgcca ctgttgccaa tgacctgcct aggaattggt tagcaagtta60ctaccggatt 70
权利要求
1.一种使样品生物聚合物与探针生物聚合物杂交的方法，杂交在含有与含有样品生物聚合物的溶液具有相同蒸气压的溶液的密闭容器中进行，使含有样品生物聚合物的溶液仅与固定有探针生物聚合物的载玻片接触。
2.如权利要求1所述的杂交方法，其特征在于，杂交在载玻片上进行，所述载玻片由亲水区和疏水区构成，亲水区表面固定有多种探针生物聚合物，而围绕亲水区的疏水区上未固定探针生物聚合物。
3.如权利要求2所述的杂交方法，其特征在于，所述载玻片是通过排列多个固定有多种探针生物聚合物的亲水区和围绕该排列的多个亲水区形成的未固定有探针生物聚合物的疏水区形成的微阵列。
4.一种用于权利要求1所述杂交的杂交微阵列，该微阵列是通过排列多个固定有多种探针生物聚合物的亲水区和围绕该排列的多个亲水区形成的未固定有探针生物聚合物的疏水区形成的。
5.一种用于权利要求1所述杂交的杂交试剂盒，其中装有通过排列多个固定有多种探针生物聚合物的亲水区和围绕该排列的多个亲水区形成的未固定有探针生物聚合物的疏水区形成的微阵列；和具有能够存放所述微阵列的内部空间的密闭容器。
全文摘要
本发明提供了一种简单可靠的使样品生物聚合物与探针DNA相互杂交的方法，该方法不用盖玻片和密闭容器，而是在含有与含样品生物聚合物溶液蒸气压相同的溶液的密闭容器中只使含样品生物聚合物溶液与固定有探针生物聚合物的载玻片接触，从而使样品生物聚合物与探针生物聚合物相互杂交。还提供了用于本发明的杂交微阵列和试剂盒。
文档编号B01L3/00GK1926246SQ200580006198
公开日2007年3月7日 申请日期2005年2月25日 优先权日2004年3月1日
发明者宮川功, 砂川义彦, 森下笃 申请人:仓敷纺绩株式会社