专利名称：获得抗体的方法
技术领域：
本发明涉及用于增加功能重组抗体，且特别是治疗抗体的生产或分离产率的方法。这些方法特别适合于大规模工业化生产治疗抗体。
背景技术：
重组DNA技术已经快速发展并且特别适用于生产抗体，特别是治疗抗体。所述用于表达重组基因的系统为本领域技术人员众所周知的。它们包括在哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞、细菌细胞和转基因动物和植物中表达。表达系统的选择依赖于编码的蛋白质的特征，例如翻译后修饰。其它考虑包括时间且特别是生产理想品质的所需量的物质所涉及的成本。后面这些考虑在生产管理部门批准所需的品质和治疗大量患者所需用量的治疗抗体中是特别重要的。
用于生产重组蛋白的最广泛使用的系统基于在大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)(大肠杆菌(E.coli))中的表达。使用大肠杆菌遇到的具体问题在于在生产疗法所需用量的所需品质的物质中的困难。特别地，可能因涉及的时间和成本而令人望而却步。值得注意的一个具体的问题在于在从大肠杆菌中提取抗体的过程中在抗体的产率方面蒙受的损失。部分解决这后一种问题并且能够生产对治疗应用而言可接受的抗体的方法描述在US 5,655,866中。该方法包括使用热处理以便有利于随后从非功能抗体中分离抗体的功能Fab′片段，其中的热处理可以在发酵或培养过程中的任何时间或在抗体的提取和纯化过程中的任何阶段进行。在高于室温的升高的温度下，功能抗体明显稳定，而许多其它蛋白质，包括宿主细胞蛋白质和抗体的游离轻链和重链种类或非功能片段，形成沉淀物和/或聚集物，后者易于在初步纯化操作步骤，诸如过滤或离心或流化床色谱过程中从功能抗体中得到分离。尽管按比例来说，纯化成本为治疗抗体产物的总成本的一部分，但是纯化成本的比例在上游生产成本变得低廉时会进一步增加。因此，抗体的回收和纯化方面的改善会驱使生产成本进一步下降，而与生产方式无关(Humphreys & Glover，Curr.Opin.Drug Discovery &Development，2001，4172-185)。因此，例如，对通过增加产物收率和/或改善产物流的品质将时间和/或成本节约引入治疗抗体生产且特别是纯化中的方法存在需求。
每次发酵或培养中的低产率通常是初步提取阶段时注意到的具体问题；抗体的表达在细胞内较高，但在初步提取阶段时的高回收百分比明显难以获得。US 5,665,866中描述了通过包括热处理步骤提高初始纯化产率，所述的热处理步骤通过除去非功能抗体而有助于纯化过程。
WO 2005019466(本申请的优先权日后公开的)中描述了通过在发酵后而在下游加工前包括中断步骤增加重组蛋白的产率。
发明内容
本文所述的本发明基于令人惊奇或出人意外的观察结果，即将非裂解处理与热处理联用使得初步提取阶段时功能抗体的产率增加达到50％，即使得功能抗体的产率高于单独采用热处理时的产率。这能够非常有益地节约治疗品质的功能抗体量的生产时间和成本。
因此，提供了用于生产重组抗体分子的方法，包括培养用编码重组抗体分子的表达载体转化的宿主细胞样品并且对所述的样品进行非裂解处理步骤。
在一个优选的实例中，重组抗体分子为至少部分抗体轻链和至少部分抗体重链，使得所表达的轻链和重链抗体分子中的至少某些能够组合成功能抗体。
在一个最优选的实施方案中，该方法进一步包括使样品经历30℃-70℃范围内的温度增加长达24小时。因此，本发明还提供了增加从包含功能抗体分子和非功能抗体分子的样品中分离的功能抗体分子的产率的方法，该方法包括使样品经历30℃-70℃范围内的温度增加长达24小时，其中使样品在经历温度增加前经历非裂解处理步骤。因此，使用本发明的方法可以实现分离或获得的功能抗体的产率增加。
特别地，该方法能够在可以根据需要或本领域技术人员可以理解的温度范围和处理条件下增加分离的功能抗体的产率，从而考虑到了产生的功能抗体和所用的表达系统的特定特征。
本文所用的“功能抗体”包括保持特异性识别或结合它们产生所针对的抗原(关联抗原)的抗体分子。根据相当于预计的抗体分子量的非还原SDS-PAGE上单一带的存在或通过使用BIACore的直接结合测定法或本领域技术人员已知的其它方法，例如但不限于ELISA证实功能抗体的产生。非功能抗体包括无法识别其关联抗原的片段，并且包括不正确折叠或不正确装配的抗体、游离重链和轻链及其片段，包括无法识别或结合其关联抗原的部分降解的抗体片段。
在本发明的方法中，样品可以为发酵(或培养)的产物，例如但不限于包含细菌，尤其是革兰氏阴性菌或酵母的发酵产物；细胞培养物，例如但不限于哺乳动物或昆虫细胞培养物。最优选样品为包含表达重组抗体的大肠杆菌的发酵产物，其中所述的抗体可以为功能或非功能抗体。如果需要，可以从发酵培养基中对宿主细胞进行收集，例如，可以通过离心、过滤或浓缩从样品中收集宿主细胞。特别地，本发明的方法适合于大规模工业化生产治疗品质的抗体。
在本发明的方法中使用非裂解处理除令人意外地增加获得的功能抗体的产率外的另外的优点在于易于大规模处理样品。裂解导致粘度增加，这可能在功能抗体的下游加工和纯化中产生问题。特别地，宿主细胞裂解导致宿主细胞蛋白释放，使得纯化更为昂贵和费时，因为可能需要更多的纯化步骤和/或需要更大量的色谱材料以便获得所需的纯度。宿主细胞DNA的大量释放增加了样品的粘度，从而导致过滤和离心困难，这是净化过程中蛋白质损失的主要原因。裂解的样品(即含有宿主细胞蛋白和DNA)还可能导致色谱材料阻塞。
在本文所述的本发明中，非裂解处理包括不引起大比例的细菌、哺乳动物细胞、酵母、昆虫细胞或用于重组抗体表达的其它生物体，例如大肠杆菌裂解的任何处理。在一个最优选的实施方案中，非裂解处理包括压力处理。或者，非裂解处理包括搅动或搅拌的预处理步骤。“大比例”包括80％或80％以上以完整形式存在的发酵或培养中的生物体比例，更优选85％以上，甚至更优选90％以上，且最优选95％或95％以上是完整的。
可以按照本领域中已知的任何方式判断裂解，包括通过在显微镜下观察；荧光激活细胞分选术(FACS)分析和相对于上清液和/或生物体(细胞)粒状沉淀中的蛋白质总蛋白质的测定。在一个实施方案中，可以通过比较在处理前与处理后样品中的总蛋白质判断裂解。如果处理导致裂解，那么经处理的样品上清液中存在的总蛋白质会比所述的未处理样品中存在的，例如使用Bradford测定法测定的总蛋白质增加。在一个优选的实施方案中，进行FACS分析，其中用荧光染料标记样品，随后进行非裂解处理和FACS分析。最优选在处理前进行FACS分析，从而得到用于比较的基线值。
因此，非裂解处理可以包括通过在一段时间内缓慢再悬浮，例如通过搅动或搅拌，或通过手动再悬浮，诸如通过在例如缓冲液中吸移进行预处理。在一个实施方案中，将预处理进行1小时-24小时，优选1小时-20小时，更优选2小时-18小时，4小时-16小时，6小时-16小时，且最优选12，14或16小时。因此，预处理的最短时间为1，2或4小时且最长时间为16，18或24小时。可以通过以50-250rpm，优选以60rpm-100rpm旋转进行预处理，且最优选进行14或16小时。在预处理过程中，将细胞维持在4℃-30℃的范围内，更优选4℃-20℃且最优选室温的温度下。
在一个优选的实施方案中，非裂解处理包括例如使用弗氏细胞压碎器或氮减压使宿主细胞经历增加的压力。在一个具体的实例中，样品为大肠杆菌发酵产物，所述的大肠杆菌表达重组抗体，使所述产物在弗氏细胞压碎器中经历压力处理。压力可以在750psi或其左右-5000psi或其左右范围内变动。在一个实施方案中，压力处理在1000psi或1250psi，1500psi，1750psi，2000psi，2250psi，2500psi，2750psi，3000psi，3250psi，3500psi，4000psi，4250psi，4500psi或4750psi下进行。更优选压力处理在1000psi-3000psi且最优选在2000psi下进行。可以根据缓冲液和包含细胞类型的样品和压力的不同，通过简单的实验确定基本上无裂解(即导致低于20％的裂解)的压力处理。
因此，提供了制备重组抗体分子的方法，包括培养用编码重组抗体分子的表达载体转化的宿主细胞样品并且对所述的样品进行压力处理。还提供了增加分离自样品的功能抗体分子的产率的方法，所述的样品包含可溶性功能抗体分子和非功能抗体分子，该方法包括使所述的样品经历30℃-70℃范围的温度增加长达24小时，其中使所述的样品经历非裂解处理步骤，包括使该样品在经历温度增加前经历增加的压力。
还提供了制备重组抗体分子的方法，包括培养用编码重组抗体分子的表达载体转化的宿主细胞样品并且对所述的样品进行预处理搅拌。本发明还提供了增加分离自样品的功能抗体分子的产率的方法，所述的样品包含可溶性功能抗体分子和非功能抗体分子，该方法包括使所述的样品经历30℃-70℃范围的温度增加长达24小时，该方法的特征在于使所述的样品经历非裂解处理步骤，包括使该样品在经历温度增加前经历预处理步骤。优选非裂解处理包括预处理搅拌14或16小时。
优选例如通过离心从发酵或培养物中收集宿主细胞并且将它们悬浮于使用缓冲盐，诸如，但不限于Tris、乙酸盐或磷酸盐的缓冲溶液中。该溶液的pH例如可以在pH2-pH10且最优选在pH6-pH8。在一个实施方案中，pH为6.8或在pH6.8的0.1个单位左右。最优选的缓冲液为pH7.4的Tris缓冲液，它可以任选进一步包含EDTA，例如但不限于含有10mM EDTA的pH7.4的100mM Tris。优选将宿主细胞悬浮于后一种缓冲液中，此后进行非裂解处理步骤。就发酵而言，可以根据所纯化的抗体的不同，在生长肉汤或培养基中进行非裂解处理，例如在生长肉汤中进行预处理。因此，在一个实例中，通过在生长肉汤中预处理的产率增加可以根据宿主细胞所表达的抗体的不同而改变。本领域技术人员可以通过实验确定在生长肉汤中预处理是否适合于任何特定的抗体。最优选，非裂解处理在如上所述的缓冲液中进行。
在一个最优选的实施方案中，使用表达重组抗体的大肠杆菌发酵样品实施本发明的方法。该样品包含pH6-pH8，优选pH7.4，更优选pH6.8的Tris/EDTA缓冲液并且使其在2000psi下的弗氏细胞压碎器中经历压力处理。
最优选，热处理步骤在30℃-70℃范围内进行。可以根据需要选择温度并且该温度可取决于用于纯化的抗体的稳定性。在另一个实施方案中，温度在40℃-65℃范围或优选在40℃-60℃范围，更优选在45℃-60℃范围，甚至更优选在50℃-60℃范围并且最优选在55℃-60℃。因此，最低温度为30℃，35℃或40℃并且最高温度为60℃，65℃或70℃。热处理的持续时间为优选1-24小时，更优选4-18小时，甚至更优选6-16小时且最优选10-14小时，例如12小时。因此，热处理的最短时间为1，2或3小时且最长时间为20，22或24小时。
在一个具体的实施方案中，热处理在50℃-60℃下进行12-16小时且更优选在50℃下进行14小时。本领域技术人员能够理解可以选择温度和时间以适合所述的样品和所生产的抗体的特征。
抗体生产还可以包括初步纯化操作步骤，诸如过滤和/或离心。还包括流化床色谱法。优选的下游纯化操作步骤包括离子交换色谱法、微过滤、超滤、渗滤和固定床俘获和膨胀床俘获和它们任何的组合。
本文所用的“抗体”包括功能活性片段、衍生物或类似物，并且可以为，但不限于多克隆、单克隆、二-、三-或四-价抗体；人源化或嵌合抗体；单链抗体，诸如单链Fv片段、Fab片段、Fab′和Fab′2片段；抗独特型(抗-Id)抗体；和任何上述的表位结合片段。这些抗体及其片段可以为天然存在的、人源化、嵌合或CDR嫁接的抗体，并且标准分子生物学技术可以根据需要用于改变，添加或缺失氨基酸或结构域。人源化抗体为来自非人物种的抗体分子，它们具有一个或多个来自非人物种的互补决定区(CDRs)和来自人免疫球蛋白分子的框架区(例如，参见US 5,585,089)。使用本发明方法纯化的抗体分子可以属于免疫球蛋白分子的任何种类(例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或亚类。
用于形成这些抗体分子的方法为本领域众所周知的(例如，参见Shrader等WO 92/02551；Ward等1989，Nature，341544；Orlandi等1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，863833；Riechmann等1988，Nature，322323；Bird等1988，Science，242423；Queen等US5,585,089；Adair，WO91/09967；Mountain和Adair，1992，Biotechnol.Genet.Eng.Rev，101-142；Verma等1998，Journalof Immunological Methods，216165-181)。
可以通过本领域中已知的任何方法制备单克隆抗体，诸如杂交瘤技术(Kohler & Milstein，1975，Nature，256495-497)、三源杂交瘤技术、人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor等1983，Immunology Today，472)和EBV-杂交瘤技术(Cole等Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，pp77-96，Alan R Liss，Inc.，1985)。
嵌合抗体为那些由免疫球蛋白基因编码的抗体，所述的免疫球蛋白基因已经被遗传改造，使得轻链和重链基因由属于不同物种的免疫球蛋白基因片段组成。这些嵌合抗体可能为较低抗原性的。可以通过本领域已知的方法制备二价抗体(Milstein等1983，Nature305537-539；WO 93/08829，Traunecker等1991，EMBO J.103655-3659)。二-、三-和四-价抗体可以包含多重特异性的或可以为单一特异性的(例如，参见WO 92/22853)。
还可以使用单淋巴细胞抗体方法产生抗体序列，所述的单淋巴细胞抗体方法基于由为生产特异性抗体选择的单淋巴细胞产生的免疫球蛋白可变区cDNA的分子克隆或表达，诸如Babcook，J.等1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(15)7843-7848和在WO 92/02551中所述。后面的方法依赖于分离各个产生抗体的细胞，然后使所述细胞克隆扩展，随后筛选那些产生识别其关联抗原的抗体的克隆，且如果需要，随后鉴定其可变重链(VH)和轻链(VL)基因的序列。或者，可以共同培养产生识别其关联抗原的抗体的细胞，随后进行筛选。
使用本发明方法制备的抗体最优选为人源化抗体，它们可以与毒素、药物、细胞毒性化合物或聚合物或在给予患者时延长抗体半衰期的其它化合物连接。
用于表达重组蛋白的方法为本领域众所周知的。用于表达重组抗体分子的宿主细胞的合适的实例包括细菌，诸如革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌，例如大肠杆菌；或酵母细胞，例如啤酒糖酵母(S.cerevisiae)；或哺乳动物细胞，例如CHO细胞和骨髓瘤或杂交瘤细胞系，例如NSO细胞。在本发明的方法中，最优选在细菌，例如大肠杆菌中生产重组抗体(参见Verma等1988，J.Immunol.Methods216165-181；Simmons等2002，J.Immunol.Methods 263133-147)。
大肠杆菌宿主细胞可以为能够产生重组蛋白的天然存在的大肠杆菌菌株或突变菌株。具体的宿主大肠杆菌菌株的实例包括MC4100、TG1、TG2、DHB4、DH5α、DH1、BL21、K12、XL1Blue和JM109。实例还包括修饰的大肠杆菌菌株，例如代谢突变体和蛋白酶缺乏菌株。一种优选的大肠杆菌宿主为大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)，即通常使用的用于重组蛋白发酵的宿主菌株。使用本发明的方法生产的重组抗体一般在大肠杆菌宿主细胞的周质中或在宿主细胞培养物上清液中表达，这取决于蛋白质的性质和生产规模。使蛋白质靶向至这些区室的方法为本领域众所周知的，就综述而言，参见Makrides，Microbiological Reviews，1996，60，512-538。将蛋白质导向大肠杆菌的周质中的合适的信号序列的实例包括大肠杆菌PhoA、OmpA、OmpT、LamB和OmpF信号序列。可以通过依赖于天然分泌途径或通过诱导外膜的有限渗漏而导致蛋白质分泌而将蛋白质靶向至上清液，其实例为使用pelB前导区、蛋白质A前导区；杆菌素释放蛋白、丝裂霉素诱导的杆菌素释放蛋白的共表达以及将甘氨酸添加到培养基中和用于膜渗透的kil基因的共表达。在本发明的方法中，最优选重组蛋白在宿主大肠杆菌的周质中表达。
重组蛋白在大肠杆菌宿主细胞中的表达还可以在诱导型系统控制下，由此重组抗体在大肠杆菌中的表达在诱导型启动子控制下。适用于大肠杆菌的许多诱导型启动子为本领域众所周知的，并且根据启动子的不同，可以通过改变诸如温度或生长培养基中特定物质的浓度这类因素来诱导重组蛋白的表达(Baneyx，Current Opinion inBiotechnology，1999，10411-421；Goldstein和Doi，1995，Biotechnol.Annu.Rev，105-128)。诱导型启动子的实例包括使用乳糖或非水解乳糖类似物异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)可诱导的大肠杆菌lsc、tac和trc启动子和分别由磷酸盐、色氨酸和L-阿拉伯糖诱导的pho A、trp和araBAD启动子。例如，可以通过添加诱导物或改变温度诱导表达，其中诱导为温度依赖性的。如果通过将诱导物添加到培养物中诱导重组蛋白表达，那么可以根据发酵系统和诱导物的不同通过任何合适的方法添加诱导物，例如，通过单次或多次散粒添加或由送料器逐步添加诱导物，可以理解在添加诱导物与实际诱导蛋白质表达之间存在延迟期，例如，如果诱导物为乳糖，那么在诱导蛋白质表达发生前可以存在延迟期，而在乳糖前可以利用任何预先存在的碳源。
可以在支持大肠杆菌生长和重组蛋白表达的任何培养基中培养大肠杆菌宿主细胞培养物(发酵)。所述的培养基可以为任何化学上确定成分培养基，诸如那些在Pirt S.J.(1975)Principles of Microbeand Cell Cultivation，Blackwell Scientific Publications中提供的培养基，其中做出了适合于如本文所述控制生长速率的改良。合适的培养基的实例为Humphreys等2002，Protein Expression andPurification，26309-320所述的“SM6E”。
大肠杆菌宿主细胞的培养可以在任何合适的容器，诸如摇瓶或发酵罐中进行，这取决于所需的生产规模。可以利用具有大于1,000升直到约100,000升容量的各种大规模发酵罐。优选使用1,000-50,000升，更优选1,000-10,000或12,000升的发酵罐。也可以使用具有0.5-1,000升容量的较小规模的发酵罐。
可以用任何合适的系统，例如连续、批量或补料分批方式进行大肠杆菌的发酵(Thiry & Cingolani，2002，Trends in Biotechnology，20103-105)，这取决于所需的蛋白质和产率。可以根据需要将分批方式与散粒添加营养物或诱导物联用。或者，可以使用补料分批培养并且可以使培养物在批量方式预诱导中以最大比生长速率生长，可以使用最初存在于发酵罐中的营养物维持这一生长速率，并且用于控制生长速率的一种或多种营养物进料方案是完整的。还可以使用补料分批方式进行预诱导以便控制大肠杆菌宿主细胞代谢并且能够达到较高的细胞密度(Lee，1996，Tibtech，1498-105)。
本发明各实施方案的优选特征就其它实施方案中间每一个而言可以在细节上做出必要的修改。将所有出版物，包括但不限于本说明书中引述的专利和专利申请引入本文作为参考，就如同将单独的出版物各自特别和分别完整地引入本文作为参考一样。
现在参照下列实施例描述本发明，这些实施例仅为例示性的并且不应以任何方式被认作限制本发明的范围。
图1为表示预处理(搅拌)对功能抗体A产率的影响的直方图。以小时表示预处理时间。每个条形图上方的数字表示以mg/升澄清的再混悬液计的功能抗体A的产率。
图2为表示压力处理对功能抗体A产率的影响的直方图条形图1为不使用压力处理的对照；条形图2、3、4和5分别表示在500psi、1000psi、2000psi和4000psi下处理。
图3a)和b)为表示在60℃(图3a)和30℃(图3b)下压力处理和预处理对功能抗体B产率的影响的直方图在每种情况中，条形图1为不使用非裂解处理的对照；条形图2、3和4分别表示在1000psi、2000psi和4000psi下处理。条形图5和6表示在室温(条形图5)或4℃(条形图6)下在Tris/EDTA中24小时的预处理。每个条形图上方的数字表示以mg/升澄清的再混悬液计的功能抗体B的产率。所有实验均按一式两份进行。
图4a)和b)为直方图，其中图a)表示在60℃下提取后压力处理对功能抗体C产率的影响，表示为g Fab′/升；图b)表示热处理后澄清的提取物中存在的总蛋白质。在图a)中，每个条形图上方的数字表示以g/升澄清的再混悬液计的功能抗体C的产率。
图5为表示在有碘化丙锭存在下使用对大肠杆菌的FACS分析的压力处理对细胞裂解的影响的直方图。
具体实施例方式
实施例1非裂解处理(预处理)的作用(a)使用插入了编码抗体A的DNA的载体pTT0D在大肠杆菌W3110细胞中表达抗体A(a Fab′)。在25℃下进行发酵(在DD53中)，直到OD600为111.6并且准备收集。离心在室温下的50ml收集培养物的等分部分并且将细胞粒状沉淀重新悬浮于5ml培养物上清液+29ml H20和5ml含有100mM EDTA的1M Tris，pH7.4中。以60rpm将重新悬浮的细胞粒状沉淀进行预处理搅拌如图1中所示的时间。在预处理后，使重新悬浮的细胞粒状沉淀经历50℃下的热处理，同时以170rpm搅拌14小时。在热处理后，通过在4℃下在Beckman J.6离心机中以4200rpm离心30分钟澄清重新悬浮的细胞粒状沉淀。使用蛋白质GHPLC分析在20mM磷酸盐缓冲液中测定含有功能抗体A的上清液中的Fab′。使用从注射时的pH7.4开始到降至pH2.5的pH梯度洗脱抗体A。通过与标准Fab′浓度比较计算功能抗体产率。
可以在预处理搅拌与未预处理搅拌相比较的所有时间点观察到功能抗体产率的增加(图1)。通过使用这种非裂解处理在所有时间点获得的功能抗体A产率的增加均在30％左右。
(b)如上所述使用插入了编码抗体B的DNA的载体pTT0D在大肠杆菌W3110细胞中表达抗体B(a Fab′)。离心在室温下的50ml收集培养物的等分部分并且将细胞粒状沉淀重新悬浮于5ml培养物上清液+29ml H20和5ml含有100mM EDTA的1M Tris，pH7.4中，此后在室温或4℃下以60rpm进行预处理搅拌24小时(参见图3a和b)。如上所述进行热处理和澄清，但在对图3a和3b的说明中所示的温度下进行。
对那些在Tris/EDTA中重新悬浮的情况而言，在室温和4℃下可以观察到功能抗体产率的增加。
实施例2非裂解处理(压力)的作用(a)如实施例1中所述在大肠杆菌中表达抗体A。如实施例1中所述，在培养物上清液、H20和Tris/EDTA中制备重新悬浮的细胞粒状沉淀，此后使用弗氏细胞压碎器在不同压力下进行压力处理。进行热处理并且如实施例1中所述计算功能抗体的产率。
与不使用压力的情况相比，在除500psi以外的所有压力下均可以观察到功能抗体产率的增加(图2)。通过使用这种非裂解处理，特别是在1000psi和2000psi下获得了功能抗体A产率的增加。在4000psi下看到一些细胞裂解，但这种情况并不显著(即低于20％)。
(b)使用插入了编码抗体B的DNA的载体pTT0D在大肠杆菌W3110细胞中表达抗体B(a Fab′)。如实施例1中所述进行发酵并且在培养物上清液、H20和Tris/EDTA中制备重新悬浮的细胞粒状沉淀，此后使用弗氏细胞压碎器在不同压力下进行压力处理。在(i)30℃(图3a)或(ii)60℃(图3b)下同时以170rpm搅拌14小时进行热处理。在热处理后，通过离心澄清细胞再混悬液并且如实施例1中所述计算功能抗体的产率。
通过使用这种非裂解处理，特别是在1000psi和2000psi下获得了功能抗体B产率的增加，但是在500psi下未获得这一结果(图3a和3b)。在4000psi下看到一些细胞裂解，但这种情况并不显著。
(c)使用含有插入了编码抗体C的DNA的载体pTT0D在大肠杆菌W3110细胞中表达抗体C(a Fab′)。如实施例1中所述进行发酵并且在培养物上清液、H20和Tris/EDTA中制备重新悬浮的细胞粒状沉淀，此后使用弗氏细胞压碎器在不同压力下进行压力处理。在60℃(图4)下同时以170rpm搅拌14小时进行热处理。在热处理后，通过离心澄清细胞再混悬液并且如实施例1中所述计算功能抗体的产率。
与不使用压力相比，在1000psi-4000psi的适度压力下可以观察到功能抗体产率的增加(图4a)，而正如通过Bradford测定法测定的，可以观察到总蛋白质(Fab′+任何的宿主细胞蛋白质)几乎没有增加(图4b)。通过对澄清的提取物进行SDS-PAGE分析证实了这一结果(未显示)。这些结果表明在1000-4000psi的压力下未发生宿主细胞的显著裂解。因此，通过使用这种非裂解处理获得了在60℃热处理后功能抗体C产率的增加。
(d)使用插入了编码抗体D的DNA的载体pTT0D在大肠杆菌W3110细胞中表达抗体D(a Fab′)。进行发酵并且通过离心收集。在提取缓冲液(100mM Tris/10mM EDTA，pH7.4)中制备重新悬浮的细胞浆液至原始体积并且通过MG匀化器(单程)在不同压力下进行压力处理。在60℃下同时以170rpm搅拌14小时进行热处理。在热处理后，通过离心澄清细胞再混悬液并且如实施例1中所述计算功能抗体产率。
与不使用压力相比，在1000psi-4000psi的适度压力下可以观察到功能抗体产率的增加，而正如通过Bradford测定法测定的，可以观察到总蛋白质(Fab′+任何的宿主细胞蛋白质)几乎没有增加(表1)。
表1使用非裂解处理抗体产率的增加
实施例3使用FACS分析对细胞裂解的测定使用插入了编码抗体A的DNA的载体pTT0D在大肠杆菌W3110细胞中表达抗体A(a Fab′)。如实施例1中所述在tris/EDTA提取缓冲液中制备细胞浆液至原始体积并且在不同压力下使其通过MG匀化器(单程)(参见图5)。
收集来自匀化器的原料流并且在磷酸盐缓冲盐水中稀释至OD600为0.2。向各样品(500μl)中加入荧光染料碘化丙锭(200μg/ml)(2μl)。碘化丙锭结合DNA，但不能穿过完整的细胞质膜。使用BectonDickinson FACSCalibur评价每次反应以便确定裂解和未裂解的细胞。包括收集的培养物和0psi对照并且表明压力处理前的总的完整细胞。图5中所示的数据表明压力处理至多并且包括4000psi与收集的培养物和0psi对照相比不会导致细胞裂解。相反，将压力增加至8000psi会导致碘化丙锭的摄取增加且由此导致一些细胞裂解。
权利要求
1.制备重组抗体分子的方法，包括培养用编码重组抗体分子的表达载体转化的宿主细胞样品并且对所述的样品进行非裂解处理步骤。
2.权利要求1所述的方法，其中所述的表达载体编码至少部分抗体轻链和至少部分抗体重链，使得轻链和重链抗体分子中的至少某些得到分泌并且组合成功能抗体。
3.权利要求1或权利要求2所述的方法，其中非裂解处理步骤包括对样品进行压力处理。
4.权利要求3所述的方法，其中所述的压力处理在750psi-5000psi下进行。
5.权利要求4所述的方法，其中所述的压力处理在1000psi-4000psi下进行。
6.权利要求5所述的方法，其中所述的压力处理在2000psi下进行。
7.权利要求1或2所述的方法，其中非裂解处理步骤包括对样品进行预处理搅拌。
8.权利要求1-7中任一项所述的方法，进一步包括对样品进行30℃-70℃范围内的增温持续长达24小时。
9.上述权利要求中任一项所述的方法，还包括至少一个纯化步骤，所述纯化步骤在所述方法之后进行。
10.上述权利要求中任一项所述的方法，其中重组抗体分子为单克隆、人源化或嵌合抗体或其片段。
全文摘要
本发明涉及制备治疗品质的重组抗体的方法。特别地，本发明涉及由大规模发酵增加功能抗体的产率的方法，由此对培养的宿主细胞样品进行非裂解处理。
文档编号B01D15/00GK101065402SQ200580039523
公开日2007年10月31日 申请日期2005年11月16日 优先权日2004年11月19日
发明者M·塞迪夫, M·斯皮塔利 申请人:Ucb医药有限公司