专利名称：分离植物和动物来源的药理学活性成分的方法
分离植物和动物来源的药理学活性成分的方法本发明涉及从动物或植物来源分离和纯化药理学上令人关注的天 然化合物的方法。更具体地，本发明涉及以与无机酸轭合的形式例如硫酸酯形式或 以糖基化形式存在于所述来源中的亲水性和水溶性化合物的提取。该方法包括将含有所述化合物的来源吸附在高亲脂性树脂上，然后 解吸附并回收洗脱物。可通过本发明的方法获得的化合物的优选实例包括具有各种治疗 或预防性药理学活性如抗氧化和抗肿瘤活性的植物雌激素(异黄酮)、完 全与动物或植物来源的甾体、多酚结构轭合的雌激素。可通过本发明的方法以高纯度和重现性获得的化合物可用于制备 药物或食品补充剂，用于治疗原发性病变如子宫和前列腺肿瘤和急性或慢性炎症和源自异常生理状况(paraphysiological condition)的病变如经 前期综合征和与衰老和/或激素改变有关的紧张、骨质疏松和动脉粥样 硬化。技术背景存在许多基于植物治疗提取物的食品补充剂，根据所使用的提取技 术，其组成和重现性有显著变化。这些变化主要涉及与所需产物不同的 产物的存在。因而，所述提取物不能用作药物，因为它们不满足组成一 致和不存在其它组分的强制要求。WO 93/23069、 WO 99/43335和EP 1174144公开了含有染料木素、 大豆黄素、刺芒柄花素和鹰嘴豆芽素A混合物的大豆或三叶草提取物。EP 1174144要求保护提取异黄酮苷元(isoflavone aglycone)的方法， 特别是从红车轴草(7V7/o/Zww / r"^is&)中提取异黄酮苷元的方法，该方
法是在水中浸渍干燥的、粉碎细的植物原料，然后通过加入水可混溶 性溶剂(通常为乙醇)进行提取；分离植物残余物；用脂肪族烃处理水溶 液以除去蜡和脂肪；分离各相并取出烃相；在真空中蒸馏水可混溶性有 机溶剂，得到固体(水不溶性异黄酮苷元)，将其过滤并干燥。用HPLC 测定的苷元含量为19.5%至38% w/w,而基于起始原料的产率为0.6% 至2.2%,WO 93/23069公开了富集异黄酮植物雌激素的组合物，其是通过用 水:水溶性有机溶剂(例如乙醇)混合物提取干燥的植物原料、分离水-有 机提取液、蒸馏除去有机溶剂并浓缩水相而获得的。WO 99/43335公开了含有异黄酮的三叶草提取物的制备，该提取物 的特征在于存在"芳族生色团"(染料木素、大豆黄素、刺芒柄花素和鹰 嘴豆芽素A)。提取操作方法基本上与WO 93/2306中所述的相同，但是 含有用HPLC进一步纯化/分离异黄酮的步骤。在动物生理流体如来自妊娠动物的尿的情况下，描述的制备轭合雌 激素混合物的方法是使用不同的半极性的但是显著亲水的非离子吸附 树月旨如Amberlites 、 Diaion Sepabeads⑧或HPD-500 。例如，US 5723454公开了从妊娠母马尿中提取轭合雌激素的方法，其中预先通过 砂床过滤、通过离心或通过超滤被澄清的尿被暴露(通过在混悬液中接 触或通过在柱上渗滤)于具有中等极性(偶极矩为1.5至2.0德拜)和 400-500m2/g的比表面积的Amberlites⑧非离子树脂(交联聚丙烯酸酯， 例如Rohm & Haas的XAD-7)。将树脂用碱水反复洗涤，然后通过用碱 水:可混溶性有机溶剂混合物洗脱回收雌激素混合物，通过在真空中浓 缩并干燥以固体形式获得雌激素混合物。US 2005/0014738、 US 2003/0105344和US 2004/0072812 7>开了相 同的辄合雌激素的吸附/解吸附方法，也使用了中等极性、主要亲水的 树脂如Dowex XAD2、 Dowex 、 Optipore。 US 2002/0156303描述了 也具有中等极性的Diaion HP-20和Sepabeads SP-700 (Mitsubishi) 树脂的应用。CN 1308038利用了具有相似特性的Hebej CangzhouChemical Factory生产的半极性树脂HPD-500。吸附的物质的接触和提 取步骤也相似。所有所述方法均基于使用非离子的中等极性的主要亲水的树脂，其 具有差的吸附选择性，因此产生轭合和非轭合雌激素以及显著量的曱酚 衍生物的混合物。这涉及在吸附后的一系列纯化步骤，由于非轭合雌激 素或其它多酚杂质的含量不可接受，有时甚至淘汰掉已处理的批次。因此，显然需要具有重现性的方法以克服以上提及的问题，使得动 物和植物来源的轭合物的组成恒定且不含非轭合产物或其它杂质。发明内容现已令人惊奇地发现使用面积为600m2/g、体积为1.3ml/g(干重)、 孔大小约200埃、以两种聚合物组分中的一种的溴化为特征的高度多孔 的苯乙烯-二乙烯基苯聚合物可以以高产率纯化上文提及的化合物，并且发现了其在制药领域中的用途。获得的粗制起始液体或固体提取物的"初级提取物"，也可应用于生理流 体。植物来源的产物的实例包括以单糖-轭合的水溶性形式存在于各种 植物来源中的异黄酮或木脂素类，如染料木素、大豆黄素、刺芒柄花 素、鹰嘴豆芽素A、拟雌内酯、阿魏酸和异阿魏酸。可从生理流体提取的产物的实例包括甾体雌激素如妊娠雌性的尿 中存在的雌酮和雌二醇，其中它们与无机酸辄合。具体地，妊娠母马的 尿提供辄合雌激素盐的混合物，其包含雌酮、马烯雌酮、A"-脱氢雌酮、 17a-雌二醇；17a-二氢马烯雌酮、17p-二氢马烯雌酮、17p-雌二醇、马 萘雌酮、17a-二氢马萘雌酮；17p-二氢马萘雌酮，任选地还有一种或多 种来自17fi-A8，9-脱氢雌二醇；17 a-A8，9-脱氬雌二醇；6-OH 17a-二氩马 萘雌酮；6-OH马萘雌酮；6-OH 17(i-二氢马萘雌酮的轭合盐和/或其它 硫酸化的甾体代谢物。盐优选为钠盐，而辄合的主要是硫酸酯。
树脂溴化涉及微粒比重的增加(其尤其使得可在柱中通过直接渗滤 和膨胀床进行操作)，诱导更少的聚合物水合，因此诱导比迄今为止所 用的其它非溴化的苯乙烯-二乙烯基苯聚合物更低的极性电荷和高得多的亲脂性。具有这样特性的溴化树脂由Mitsubishi Chem. Co.生产，例 如Diaion SP 207 、 Diaion SP 205 、 Diaion SP 206 。鉴于待纯化产物的显著亲水性和降低的亲脂性特性，本发明获得的 结果是出乎意料的。因此，这些产物在对亲脂性分子更具特异性的主要 亲脂的树脂如上述树脂上的吸附方面的行为是令人惊奇的和出乎意料的。烯-二乙烯基苯聚合物上，结果导致活性成分或其混合物和任何杂质的 吸附；在散装处理的情况下，分离并挤压(通过在真空中过滤或离心)吸附 固相的液体，将其弃去；利用水:水可混溶性溶剂梯度(凹型或凸型)和任选地pH梯度在柱中 将吸附的产物、活性成分和杂质选择性解吸附；回收洗脱物并在真空中干燥；任选的将固体残余物进一步纯化和/或结晶的步骤。树脂与流体或初级提取物之间的接触可以将非均质物料保持在緩 慢搅拌下(以避免树脂粉碎)散装完成或通过渗滤或膨胀床技术在色谱柱 中完成。方法的选择取决于所处理的产物的类型和量。在散装技术的情况 下，优选的搅拌器是叶片式搅拌器(bladestirrer)。树脂的用量将取决于 待加工的流体或初级提取物的性质和通过常规分析(HPLC， GC)测定的 活性成分的含量，但是，通常生产性能(productionperformance)相同， 该量为上述半极性树脂的约60-75%。在散装处理的情况下，使用用于
柱的三-至四-倍的量。待吸附的溶液可以用已知技术澄清，例如通过在 砂床上过滤或在合适设备中离心来澄清，以便通过超滤回收流体。在散 装处理的情况下，回收吸附的树脂，通过在真空中过滤挤出过量的流体，放入配有多孔隔膜和冷却夹套的柱中。用水:可混溶性溶剂混合物(例如 70-30 v/v水-乙醇)洗脱被吸附物，用氢氧化钠调至11-13、优选11-12.5 的碱性pH。然后将任选浓缩的粗制洗脱物在用于初级提取物的相同的 溴化树脂上或在其它溴化树脂上通过色镨法进行纯化，然后进行针对色 语直接处理所描述的操作方法。散装方法对于制备植物来源的衍生物特 别有利。在用色谦技术处理的情况下(对于动物来源的流体优选用色镨技术 处理)，通过渗滤或膨胀床使任选浓缩的初级溶液在树脂床上通过。后 一技术对于高比重的溴化树脂微粒而言是有利的，其有利地将溶液暴露 于更大吸附表面，因为轻微的超压即可将多孔微珠相互分离，相反的是 当使用直接渗滤(direct percolation)时其形成更紧密的床。给提供的溶 液施加轻孩i的超压增加吸附产率并减少操作时间。可用在吸附过程中的 树脂是高度多孔的溴化的苯乙烯-二乙烯基苯聚合物，如Mitsubishi Chemical Co.生产的Diaion SP 207 、 Diaion SP 205@和Diaion SP 206 。优选Diaion SP207 。树脂与待处理溶液的比可以为1体积份树 脂/25份溶液至l份树脂/200份溶液，取决于所用的SP类型和待提取的 活性成分的性质。更具体地，在Diaion SP 207的情况下，所述比可以 为25至150。用270至280nm的UV检测监视洗脱。在柱的空间中用 于移除吸附溶液的洗涤液体的体积通常为1.8至2-倍柱床。洗涤液体的 组成根据杂质的性质和量以及吸附产物的类型而变化。温度为0°C至 35。C,优选0°C至5°C。优选的洗涤液体是水，但是还可以存在小量 (1-5%)的水-可混溶性溶剂(例如丙酮或乙醇)。用水:水-可混溶性溶剂(例如酮、低分子醇、水溶性醚或酯)混合物 洗脱吸附的产物，其组成可以为100%至0.10%水/溶剂，取决于杂质的 性质和原料的来源。用氢氧化钠将混合物调节至pH 11-13，优选11-12.5。
通过270至280nm的UV吸收监测洗脱。分析级分，将含有所需化合 物的那些级分合并并在真空中浓缩。下列实施例详细地举例说明本发明。实施例1通过直接提取红车轴草制备轭合异黄酮 在搅拌下，于室温下，将500g干燥的研细的红车轴草用2000ml蒸 馏水处理10小时。然后过滤固体，用HPLC分析溶液的轭合和非轭合 异黄酮的含量。轭合异黄酮的总含量为约500mg，基本上不存在游离苷 元。将溶液在真空中浓缩至250ml，进一步过滤，然后渗滤到直径l-1.5cm 装有10g S印abeads 207 Mitsubishi的柱上，收集级分并在270nm通过 UV监测洗脱。在完成渗滤后，将柱用约两倍空体积的蒸馏水洗涤，然 后用含有5%乙醇的水(2001111)洗涤。合并含有轭合异黄酮(HPLC分析) 的级分。过滤溶液，将残余物在真空中干燥(约420mg)，然后用千燥丙 酮吸收，得到固体残余物，基于起始的水性提取物的产率约84%。残余 物由鹰嘴豆芽素A、刺芒柄花素、大豆黄素和染料木素的糖苷组成，纯 度98%。实施例2通过提取红车轴草水性提取物制备异黄酮 将20g根据EP 1174144(实施例l)获得的游离异黄酮含量约20%且 轭合异黄酮含量约30。/。(HPLC)的千燥提取物分散在500ml水中；在真 空中过滤该混悬液。HPLC分析显示轭合苷元的含量为约28%,非轭合 苷元的含量为约1%,基于起始干重(由于它们不溶于水，除去非轭合苷 元以及其它组分)。通过在真空中蒸馏将溶液浓缩至200ml,用80g吸附 剂Sepabeads SP加7(Mitsubishi)处理。继续搅拌2小时。然后在真空 中过滤吸附的树脂，挤压，放在配有多孔隔膜的柱上。然后向1.8体积 的柱床中加入预先在0-5。C下冷却的蒸馏水。之后，向2.5倍床体积中 加入95/5水乙醇混合物，收集洗脱物，将其在不超过40。C的温度下真 空蒸馏至干。将固体残余物用丙酮吸收，然后用丙酮/乙醚吸收并研磨， 在真空中蒸馏除去溶剂，回收固体。HPLC分析显示产物由染料木素、 大豆黄素、芒柄花异黄酮和鹰嘴豆芽素A组成，并且基本上不含杂质 (轭合异黄酮的含量90-95%)。基于起始提取物，产率为80至85%。实施例3 从妊娠母马尿中提取轭合雌激素 将20L妞娠母马尿首先在约10cm的砂床上过滤，然后通过0.2n的膜 过滤。用HPLC或GC测定辄合雌激素的含量。通过加入浓氬氧化钠调节 pH至约12.5-13.5。将全部物料在氮气下保持在机械搅拌下约1-2小时。然 后用无机酸、优选HC1或三氟乙酸调节pH至中性(pH 7.5-8.5，优选8)。 将该溶液进一步在砂上真空过滤，然后在膜上过滤。通过渗滤或膨胀床使 澄清的滤液在装有150-180g Sepabeads 207 Diaion (Mitsubishi)的直径 7.5至10cm的柱上通过，施加轻微的超压以便在膨胀床的情况下树脂床高 度增加不超过3-5%和当使用直接渗滤时不诱导树脂结块。在膨胀床的情 况下，柱床必须至少30-50cm。在完成洗脱后，通过在0°-5。C下进行液体 冷却器循环冷却树脂，然后用在0°-5°C下的至少1.8-2/5空体积的蒸馏水 洗涤被吸附物。然后用通过加入浓NaOH使pH为11.5-13.0的温度5。-10。C 的水(2和4倍树脂体积)渗滤(或膨胀)柱床。然后用30:70最小比的水:水可 混溶性溶剂(丙酮、乙醇、THF)混合物洗脱轭合雌激素复合物，然后通过 加入氢氧化钠调节至pH 10-13，优选12.5-13。回收洗脱物，中和并在真空 中干燥，得到活性成分。
权利要求
1.从植物水性提取物或生理流体中回收和纯化轭合形式的天然亲水性水溶性产物的方法，该方法是通过将所述提取物或流体吸附在亲脂性树脂上、然后解吸附并回收洗脱物来实现的，该方法特征在于树脂是面积600m2/g、体积1.3ml/g(干重)、孔大小约200埃的在苯乙烯和/或二乙烯基苯部分上被溴化的多孔苯乙烯-二乙烯基苯聚合物。
2. 权利要求l所述的方法，其中天然产物包括异黄酮、抗氧化剂或 轭合雌激素或它们的混合物。
3. 权利要求2所述的方法，其中异黄酮是从大豆或红车轴草 (7>!7*。//"附/7fflZms7力中提取的。
4. 权利要求3所述的方法，其中异黄酮包括染料木素、大豆黄素、 刺芒柄花素、鹰嘴豆芽素A。
5. 权利要求1或2所述的方法，其用于从妊娠哺乳动物流体中纯化 和回收辄合雌激素。
6. 权利要求5所述的方法，生理流体的盐混合物是妊娠母马尿。
7. 权利要求6所述的方法，其用于制备轭合雌激素混合物盐混合 物，其包含雌酮、马烯雌酮、A"-脱氢雌酮、17a-雌二醇；17a-二氢马 烯雌酮、17|5-二氢马烯雌酮、17(J-雌二醇、马萘雌酮、17a-二氢马萘雌 酮；17p-二氢马萘雌酮。
8. 权利要求7所述的方法，其用于制备还含有一种或多种选自 17卩-A8，9-脱氢雌二醇、17a-A8，9-脱氢雌二醇、6-OH17a-二氢马萘雌酮、 6-OH马萘雌酮、6-OH 17 P-二氢马萘雌酮的轭合盐和/或其它硫酸化的 甾体代谢物的混合物。
9. 权利要求6-7中任意一项所述的方法，其中轭合物是硫酸酯，盐 是钠盐。
10. 权利要求1-8中任意一项所述的方法，其中树脂选自可以以商 品名Diaion SP 207 、 Diaion SP 205@和Diaion SP 206⑧商购获得的那 些。
全文摘要
从植物水性提取物或生理流体中回收和纯化轭合形式的天然亲水性水溶性产物的方法，该方法是通过将所述提取物或流体吸附在亲脂性树脂上、然后解吸附并回收洗脱物来实现的，该方法特征在于树脂是面积600m<sup>2</sup>/g、体积1.3ml/g(干重)、孔大小约200埃的在苯乙烯和/或二乙烯基苯部分上被溴化的多孔苯乙烯-二乙烯基苯聚合物。
文档编号B01D15/00GK101160160SQ200680012898
公开日2008年4月9日 申请日期2006年12月19日 优先权日2005年12月29日
发明者A·安扎尼, G·马佐拉 申请人:埃武尔蒂斯股份有限公司