专利名称：亲和性的明胶-氨基硅烷-阳极氧化铝复合膜的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于蛋白分离的亲和膜的制备方法，尤其是具有亲和性的明胶一氨基硅烷一阳极氧化铝复合膜的制备方法。
技术背景传统柱亲和分离使用的颗粒状吸附剂具有"死端"式孔结构，目标蛋白与配基的结合受 到表面液膜扩散、孔扩散以及吸附动力学三方面速度的限制，其中主要传质阻力来自孔扩散。 亲和膜分离与其相比具有"通孔"或"对流孔"，则只受表面液膜扩散及吸附动力学的影响， 消除了孔扩散这一速度控制过程，从而可在较低的操作压力和较高的流速下对目标蛋白进行 快速分离和纯化，縮短操作时间、提高纯化效率，减少分离能耗。亲和膜分离技术要求膜基质具有亲水性，物理、化学性质稳定，机械稳定性好，孔径和孔隙率分布均匀，可利用的化学基团(如-OH基、-NH2基、-COOH基等)多，非特异性吸附低等特点[Ge DT, Shi W， Ren L, et al., Journal of Chromatography A, 2006, 1114: 40-44〗。阳极氧化铝膜具有孔径均一、排列有序、分布均匀等特点，常作为模板用于"纳米复制"技术来制备各种功能材料的纳米管、纳米线、纳米结构阵列体系及量子点阵等。阳极氧化铝膜具有理想的孔径和孔隙率分布以及较好的化学和机械稳定性，具有作为亲和膜基质膜的潜力，但由于阳极氧化铝膜上活性基团含量少，很难固载大量的配基，必须对其进行化学改性，使其满足作为亲和分离介质的要求，然而目前尚未见有关阳极氧化铝膜改性的相关报导。 发明内容本发明的目的在于提供一种具有较多的活性基团(-NH2基、-COOH基)，良好的亲水性 和生物相容性，可广泛应用于亲和分离，以氨基硅烷偶联剂为活化剂的亲和性的明胶一氨基 硅烷一阳极氧化铝复合膜的制备方法。本发明的具体步骤如下1) 阳极氧化铝膜的活化以阳极氧化铝膜为基膜，将基膜浸置于10% 20 %氮基硅烷溶液中，于20 7(TC下反应0.5 2h ，取出膜清洗、干燥，得带有环氧基的阳极氧化铝膜；2) 明胶一环氧基硅垸一阳极氧化铝复合膜的制备将带有氨基的阳极氧化铝膜浸于含有l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDOHC1)的明胶HC1水溶液中于20 4(TC下 反应12 36h ,取出复合膜清洗、干燥，即得明胶一氨基硅烷一阳极氧化铝复合膜；或将带有氨基的阳极氧化铝膜浸于浓度为0.5% 4.0%的羰基二咪唑的丙酮溶液中于 20 5(TC下反应0.5 2h ，然后再将膜置于浓度为2 8mg/ml的明胶水溶液中于20 40 °C 下反应2 8h ，取出复合膜清洗、干燥，即得明胶一氨基硅垸一阳极氧化铝复合膜。阳极氧化铝膜的孔径最好为0.1 0.8 pm，厚度最好为30 200 pm，孔隙率最好为40% 85 o/o。环氧基硅垸溶液的溶剂为无水乙醇和pH5.0乙酸钠一冰醋酸缓冲液的混合溶液，无水乙 醇与乙酸钠一冰醋酸缓冲液的体积比为(10 15) : 1。氨基硅烷可为Y-氨丙基三乙氧基硅垸、Y-氨丙基三甲氧基硅垸、，氨丙基甲基二甲氧基硅 垸或Y-氨丙基甲基二乙氧基硅垸。含有EDOHC1的明胶HC1水溶液中EDOHC1的浓度最好为5 20 mg/ml。明胶HC1水溶 液中明胶的浓度最好为2 8 mg/ml。明胶HC1水溶液的pH最好为3.0 5.0。本发明将明胶通过共价键偶联在阳极氧化铝膜上。选用的活化试剂为氨基硅烷偶联剂，氨基硅烷作为连接两种不同性质材料的"分子桥"已经在复合材料、涂料、胶粘剂等行业中得到了广泛的应用。由于其无毒性、无污染、适用广泛、成本低、优异的粘接性能等优点，目前逐渐应用于生物医学领域，作为一种活化或交联试剂修饰药物载体或生物材料基质。另外，所选用的改性材料明胶是一种热水可溶的多肽化合物，由动物的皮、骨等结缔组织中的胶原蛋白质水解而成，由于它具有来源丰富、亲水性佳、生物相容性好和具有大量活性官能团(-NH2基、-COOH基)等优点，使其作为改性材料能够弥补单一阳极氧化铝膜材质在应用于亲和膜时的缺陷。所制备的明胶一氨基硅垸-阳极氧化铝复合膜具有活性官能团多、生物相容性好、孔径和孔隙率分布均匀以及传质阻抗小等优点，可有效提高亲和分离的溶质回收率和配基利用率，进而提高亲和分离效能。可广泛用于亲和纯化分离。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明。 实施例11. 阳极氧化铝膜的活化将8ml，氨丙基三乙氧基硅垸、30ml无水乙醇和3ml乙酸钠 -冰醋酸缓冲液(pH5.0)混合，取一片孔径为0.15 ^m、厚度为200 pm、孔隙率为85 %的阳 极氧化铝膜置于上述混合溶液中在7(TC反应0.5h 。膜取出用乙醇清洗后，150。C加热lh ， 即得带有氨基的阳极氧化铝膜。2. 明胶一氨基硅垸一阳极氧化铝复合膜的制备将160mg明胶溶于20mlpH3.0盐酸溶 液中，加入400 mg EDOHCl，获得含有EDOHC1的明胶盐酸溶液。取一片步骤1制备的带 氨基的阳极氧化铝膜置于上述溶液中在2(TC下振荡反应36h ，反应结束后用大量蒸馏水振荡清洗膜24h ，于40'C烘箱中干燥lh ，即得明胶一氨基硅烷一阳极氧化铝复合膜。 3.明胶一氨基硅垸一阳极氧化铝复合膜上偶联明胶量的确定(1) 标准曲线的绘制取400mg茚三酮、50mgSnCl2溶于10ml二甲亚砜中，加入2ml 2 mol/L的乙酸钠溶液，配制成茚三酮显色液。取100 mg明胶溶于5 ml pH3.0柠檬酸水溶液 中，在9CTC水浴条件下水解24h ，冷却至室温加入5 ml pHll.O NaOH溶液使体系呈中性。 依次用移液管准确量取Oml， 0.2ml， 0.4ml， 0.6 ml， 0.8 ml ， 1.0 ml的该溶液置于比色管中， 分别加入1 ml茚三酮显色液，用蒸馏水补加至10ml，充分摇匀，在9(TC水浴加热15min后， 冷却至室温，于570nm下比色。所得数据绘制标准曲线。(2) 样品含量的测定取制备所得的明胶一氨基硅烷一阳极氧化铝复合膜，用分析天平 精密称重后剪碎置于含2mlpH3.0柠檬酸水溶液的比色管中，在9(TC水浴条件下水解24h ， 冷却至室温加入2mlpH11.0NaOH溶液使体系呈中性。放置5-10min后，加入1 ml茚三酮显 色液，在9(TC水浴加热15min后，冷却至室温，于570 nm下比色。测得所制备的明胶一氨 基硅烷一阳极氧化铝复合膜上偶联明胶的量为70±4 (mg明胶)/(g膜)。实施例21. 阳极氧化铝膜的活化将3.5mlr氨丙基三甲氧基硅烷、30ml无水乙醇和2ml乙酸 钠-冰醋酸缓冲液(pH5.0)混合，取一片孔径为0.7nm、厚度为80pm、孔隙率为55 %的阳 极氧化铝膜置于上述混合溶液中，在6(TC反应lh 。膜取出用乙醇清洗后，15(TC加热lh ， 即得带有氨基的阳极氧化铝膜。2. 明胶—氨基硅烷一阳极氧化铝复合膜的制备将40 mg明胶溶于20 ml pH5.0盐酸溶 液中，加入100 mg EDOHC1,获得含有EDOHC1的明胶盐酸溶液。取一片步骤1制备的带 氨基的阳极氧化铝膜置于上述溶液中在35'C下振荡反应30h ，反应结束后用大量蒸馏水振荡 清洗膜24h ，于40。C烘箱中真空千燥lh ,即得明胶一氨基硅烷一阳极氧化铝复合膜。3. 明胶一氨基硅垸一阳极氧化铝复合膜上偶联明胶量的确定按照实施例1步骤3的方 法确定膜上偶联明胶的量为53±6(mg明胶)/(g膜)。实施例31. 阳极氧化铝膜的活化将5ml，氨丙基甲基二甲氧基硅垸、28ml无水乙醇和2ml乙 酸钠-冰醋酸缓冲液(pH5.0)混合，取一片孔径为0.4pm、厚度为30)tmi、孔隙率为65 %的 阳极氧化铝膜置于上述混合溶液中在20。C反应2h 。膜取出用乙醇清洗后，15(TC加热lh ， 即得带有氨基的阳极氧化铝膜。2. 明胶—氨基硅烷一 阳极氧化铝复合膜的制备将200 mg明胶溶于20 ml pH 4.0盐酸溶液中，JnA0.25gEDOHCl，获得含有EDOHCl的明胶盐酸溶液。取一片步骤1制备的带氨 基的阳极氧化铝膜置于上述溶液中在2(TC下振荡反应24h ，反应结束后用大量蒸馏水振荡清 洗膜24h ，于4(TC烘箱中干燥lh ，即得明胶一氨基硅垸一阳极氧化铝复合膜。3.明胶一氨基硅烷一阳极氧化铝复合膜上偶联明胶量的确定按照实施例1步骤3的方 法确定膜上偶联明胶的量为65±8 (mg明胶)/(g膜)。实施例41. 阳极氧化铝膜的活化将5.5ml 氨丙基甲基二乙氧基硅垸、30ml无水乙醇和2ml 乙酸钠-冰醋酸缓冲液(pH5.0)混合，取一片孔径为O.l pm、厚度为120 pm、孔隙率为40 % 的阳极氧化铝膜置于上述混合溶液中在40。C反应1.2 h 。膜取出用乙醇清洗后，15(TC加热 lh ，即得带有氨基的阳极氧化铝膜。2. 明胶一氨基硅烷—阳极氧化铝复合膜的制备将130 mg明胶溶于20 ml pH 3.5盐酸溶 液中，加入0.35gEDOHCl，获得含有EDOHCl的明胶盐酸溶液。取一片步骤1制备的带氨 基的阳极氧化铝膜置于上述溶液中在4(TC下振荡反应12h ，反应结束后用大量蒸馏水振荡清 洗膜24h ，于40'C烘箱中干燥lh ，即得明胶一氨基硅烷一阳极氧化铝复合膜。3. 明胶一氨基硅垸一阳极氧化铝复合膜上偶联明胶量的确定按照实施例1步骤3的方 法确定膜上偶联明胶的量为67±5 (mg明胶)/(g膜)。实施例51. 阳极氧化铝膜的活化取一片孔径为0.4 pm、厚度为30^m、孔隙率为80 %的阳极 氧化铝膜按照实施例1步骤1的方法进行活化，即得带有氨基的阳极氧化铝膜。2. 明胶一氨基硅烷一阳极氧化铝复合膜的制备将步骤1制备的带有氨基的阳极氧化铝 膜浸于1.5%的羰基二咪唑的丙酮溶液中，于20 。C下，振荡反应lh ，用丙酮清洗3次，并 置于4(TC烘箱中真空干燥30min。将羰基二咪唑活化后的膜置于2 mg/ml的明胶水溶液中。 于室温下，振荡反应5h 。取出该膜置于40'C烘箱中真空干燥2h ，即得明胶一氨基硅烷一 阳极氧化铝复合膜。3. 明胶一氨基硅垸一阳极氧化铝复合膜上偶联明胶量的确定按照实施例1步骤3的方 法确定膜上偶联明胶的量为65±8 (mg明胶)/(g膜)。
权利要求
1.亲和性的明胶-氨基硅烷-阳极氧化铝复合膜的制备方法，其特征在于其具体步骤如下1)阳极氧化铝膜的活化以阳极氧化铝膜为基膜，将基膜浸置于10％～20％氨基硅烷溶液中，于20～70℃下反应0.5～2h，取出膜清洗、干燥，得带有环氧基的阳极氧化铝膜；2)明胶-环氧基硅烷-阳极氧化铝复合膜的制备将带有氨基的阳极氧化铝膜浸于含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)的明胶HCl水溶液中于20～40℃下反应12～36h，取出复合膜清洗、干燥，即得明胶-氨基硅烷-阳极氧化铝复合膜；或将带有氨基的阳极氧化铝膜浸于浓度为0.5％～4.0％的羰基二咪唑的丙酮溶液中于20～50℃下反应0.5～2h，然后再将膜置于浓度为2～8mg/ml的明胶水溶液中于20～40℃下反应2～8h，取出复合膜清洗、干燥，即得明胶-氨基硅烷-阳极氧化铝复合膜。
2. 如权利要求l所述的亲和性的明胶一氨基硅烷一阳极氧化铝复合膜的制备方法，其特 征在于阳极氧化铝膜的孔径为0.1 0.8 pm。
3. 如权利要求1或2所述的亲和性的明胶一氨基硅烷一阳极氧化铝复合膜的制备方法， 其特征在于阳极氧化铝膜的厚度为30 200 )Lim。
4. 如权利要求1或2所述的亲和性的明胶一氨基硅垸一阳极氧化铝复合膜的制备方法， 其特征在于阳极氧化铝膜的孔隙率为40% 85 %。
5. 如权利要求l所述的亲和性的明胶一氨基硅烷一阳极氧化铝复合膜的制备方法，其特 征在于环氧基硅烷溶液的溶剂为无水乙醇和pH5.0乙酸钠一冰醋酸缓冲液的混合溶液，无水 乙醇与乙酸钠一冰醋酸缓冲液的体积比为10 15 : 1。
6. 如权利要求l所述的亲和性的明胶一氨基硅烷一阳极氧化铝复合膜的制备方法，其特 征在于氨基硅烷为Y-氨丙基三乙氧基硅烷、Y-氨丙基三甲氧基硅烷、Y-氨丙基甲基二甲氧基硅 垸或Y-氨丙基甲基二乙氧基硅垸。
7. 如权利要求1所述的亲和性的明胶一氨基硅烷一阳极氧化铝复合膜的制备方法，其特 征在于含有EDC'HC1的明胶HC1水溶液中EDOHC1的浓度为5 20 mg/ml。
8. 如权利要求l所述的亲和性的明胶一氨基硅垸一阳极氧化铝复合膜的制备方法，其特 征在于明胶HC1水溶液中明胶的浓度为2 8mg/ml。
9. 如权利要求1所述的亲和性的明胶一氨基硅垸一阳极氧化铝复合膜的制备方法，其特 征在于明胶HC1水溶液的pH为3.0 5.0。
全文摘要
亲和性的明胶—氨基硅烷—阳极氧化铝复合膜的制备方法，涉及一种用于蛋白分离的亲和膜的制备方法。提供具有较多活性基团(-NH<sub>2</sub>基、-COOH基)，良好亲水性和生物相容性，可应用于亲和分离，以氨基硅烷偶联剂为活化剂的亲和性的明胶—氨基硅烷—阳极氧化铝复合膜的制备方法。以阳极氧化铝膜为基膜，将基膜浸于氨基硅烷溶液中反应，取出膜清洗干燥得带有环氧基的阳极氧化铝膜，再浸于含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)的明胶HCl水溶液中反应，取出复合膜清洗干燥即得；或将带有氨基的阳极氧化铝膜浸于羰基二咪唑的丙酮溶液中反应，将膜置于明胶水溶液中反应，取出复合膜清洗干燥即得。
文档编号B01D69/00GK101254416SQ20071000996
公开日2008年9月3日 申请日期2007年12月7日 优先权日2007年12月7日
发明者张其清, 沈雨青, 巍 石, 葛东涛 申请人:厦门大学