专利名称：一种表面固定肝素配基的多孔膜材料、制备方法和应用的制作方法
技术领域：
该发明提供了一种新型表面固定肝素配基的聚合物多孔膜载体材料、制备方法及其在血浆脂质成份吸附分离中的应用。本发明所提供的聚合物多孔膜材料涉及临床高血脂症病人血液净化灌流治疗应用中的血浆脂质成份选择性吸附分离载体材料，属于有机生物医用材料以及医疗器械辅助材料领域。该发明所涉及的一种新型表面固定肝素配基的聚合物多孔膜载体材料，是由不同平均孔径尺寸的医用等级聚合物无纺布作为制备出发材料，经过60Co γ-射线共辐照接枝共聚合丙烯酸改性以及后续表面偶联固定肝素吸附配基等系列制备过程得到。
背景技术：
当前心脑血管系统疾病已经威胁人类健康最重要的三大疾病之一，全球每年有800～1000万人死于心血管疾病。2006年12月1日发布的《中国心血管病报告2005》揭示我国每年死于心血管系统相关疾病的人数已达300万，累计已达现有各种临床疾病所导致死亡人数的45％左右，并且这些死亡的心脑血管疾病患者导致死亡的直接诱因绝大部分是高血脂症伴生动脉硬化。临床医学研究表明，高脂血症诱发动脉硬化乃至冠心病和心肌梗塞的重要病理因素[New Eng.J.Med.，1990，322，1700]。同时研究发现临床冠心病与患者血浆脂质成份中低密度脂蛋白(LDL)异常、浓度过高有着密切相关[Mayo Clin.Proc，1999，74，466]，通过临床治疗降低患者血浆脂质成份中过高的低密度脂蛋白(LDL)含量能够显著改善心脑血管系统的血液流变性和状况[New Eng.J.Med.，1995，333，1301]。因此美国国家胆固醇教育计划最新指南指出，降低血浆脂质成份中过高的低密度脂蛋白(LDL)含量已成为有效降低冠心病发病率的重要预防措施。特别是对于在临床治疗中，单纯通过患者的膳食控制或者药物治疗没有取得明显效果的严重遗传性高胆固醇血症患者，如何开发更为有效的降低血浆脂质有害成份的临床治疗方法显得非常紧迫。
最近几十年来的临床医学与生物医疗器械的研究发展表明，研究、开发血液相容性良好、血浆脂质成份吸附选择性优异、水基介质中稳定、易于在血液净化器械中使用并且制造成本低的净化生物材料成为主要技术发展方向。为了快速降低高血脂症患者血液中过高的低密度脂蛋白LDL含量，血液净化技术发展早期经常采用血浆交换(PlasmaExchange)与双重滤过法(Double-Filtration Plasma Pheresis)。在此基础上，后来继续发展出现了免疫吸附(Immuno adsorption)、肝素诱导沉淀法(HELP)等新的临床医学治疗方法。但是在血液净化应用中发现可能诱导患者的免疫反应以及严重的过敏反应，带来治疗风险，同时存在净化过程操作复杂、净化载体材料与相关辅助器械制造成本过高等原因，因此这些技术逐渐也从临床治疗中淘汰。目前在临床上较为成熟广泛应用的是磺化葡聚糖纤维素吸附法，但依然存在吸附分离载体材料纤维素微珠强度低、耐压不足、使用费用昂贵等现实缺点，促使生物材料研究者继续研究探索新的吸附分离载体材料和相关配套器械。
作为重要的血液净化载体材料，最为广泛的是高分子凝胶体系、表面改性聚合物微球体系以及多孔聚合物纤维体系，利用多孔膜吸附分离的技术报道不多。美国专利报道了系列经过聚丙烯酸表面改性修饰的微孔纤维聚砜膜生物分离低密度脂蛋白LDL的吸附载体材料以及相关应用方法[US Patent 5496637、5187010、5236644、5258149]。但是上述专利所提供的微孔纤维聚砜膜的过程很复杂，制备条件要求高，并且制备过程中需要大量使用有机溶剂。同时为了更好地表面固定丙烯酸，制备过程中需要加入的致孔剂，这些存在在血浆灌流净化应用时产生意外不良反应的风险。日本专利(特开平6-178807，特开平6-237997，特开平5-301043)报道了采用涤纶(PET)无纺布为制备血液净化载体的出发原材料，通过后续高能电子射线辐射在无纺布表面接枝共聚合丙烯酸，继续借助一定长度的手臂试剂偶联对血浆脂质成份低密度脂蛋白LDL具有特异性亲和力的小分子，如某些短链的寡肽、葡聚糖硫酸酯等，从而制备成功系列低密度脂蛋白的LDL吸附剂。上述血液净化吸附分离材料尽管动态灌流吸附实验结果良好，但客观上制备所采用的高能电子辐射设备昂贵，普遍表面接枝共聚合丙烯酸的接枝率偏低，亲和性吸附配基的合成以及在无纺布表面的偶联固定反应过程复杂，所得载体材料的血液相容性、生物毒性没有提及，因此离作为临床血液净化材料实际应用要求尚存在较大差距。
为了提高血液净化中血浆脂质成份的吸附分离效果，早在1983年Wieland和Seidel等人已在在离体实验中首次采用生物活性肝素，在酸性条件下，选择性沉淀分离血浆低密度脂蛋白LDL[J.Lipid Res.1983，24，904]，他们的实验尝试直接导致导致了肝素体外LDL沉淀分离血液净化技术(HELP)在1987年诞生[KlinWochenschr 1987，65，161-168]。1993年Bosch等对原有的肝素体外LDL沉淀分离系统进行改进，建立了一种称为″反向流动滤过″的新系统。新系统主要是通过改变含有肝素-LDL沉淀的血浆在沉淀滤器中的滤过方向，而使沉淀均匀地沉积在滤过膜的两侧，这样可避免跨膜压过早地升高，达到有效地去除LDL的目的[Int.J.Artif.Organs，1993，16(2)，75285]。HELP系统加上饮食、药物治疗，可将LDL胆固醇降低80％，对于曾被归类为难治性高胆固醇血症有显效。然而在实际应用中，此系统需要过滤器、透析装置、肝素、缓冲液及熟练的操作人员才能高效运转，且部分对肝素敏感的患者不能使用。最近西安交通大学以过氧化二苯甲酰(BPO)为引发剂，对苯乙烯为交联剂得到无规共聚的丙烯腈树脂颗粒，再依次通过浓硫酸和氢氧化钠进行水解，得到表面带有羧基和酰胺基的树脂，然后将其浸在十六烷基三甲基溴化铵溶液中，使树脂表面带上正电荷，然后继续浸泡于戊二醛溶液中，使得肝素通过静电吸附和共价两种作用固定在丙烯腈树脂颗粒表面[Polymer Bulletin，2006，57，261-267]。从应用效果来看，尽管静态吸附结果良好，但是吸附颗粒制备过程比较复杂，而且制备过程使用的许多有毒试剂(如戊二醛)可能存在残留在树脂中，另外该法使用静电吸附机理固定的肝素并不牢固。
发明内容
本发明的目的是提供一种表面固定肝素配基的多孔膜材料；本发明的目的还提供上述表面固定肝素配基的多孔膜材料的制备方法；本发明的另一目的是提供一种上述表面固定肝素配基的多孔膜材料的用途。以应用于血液净化动态灌流中选择性地吸附分离有害脂质成份低密度脂蛋白(LDL)、极低密度脂蛋白(VLDL)以及过高的总胆固醇(TC)与甘油三酯(TG)。
本发明是以水不溶性、生物稳定性良好的系列平均孔径的医用聚合物无纺布为出发载体材料，通过60Co γ-射线共辐照接枝共聚合聚丙烯酸表面导入亲水性、负电性羧基官能团以后，通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)偶联肝素吸附配基，从而最终制备得到基于上述吸附载体表面负电性羧基以及肝素配基的血浆脂质成份吸附分离材料。本发明所提供的新型聚合物多孔膜材料的吸附机制在于综合利用基于低密度脂蛋白(LDL)生物结构模型的静电吸引力(LDL的表面正电性载脂蛋白B结构部分与吸附载体的负电性丙烯酸羧基基团以及肝素配基上的羧基、硫酸根等负电性基团)，也就是偶联的肝素的羧基、硫酸根以及聚合物无纺布多孔膜载体剩余的负电性羧基基团能够促进吸附载体与LDL载脂蛋白B所带正电荷的静电相互吸引作用，提高综合吸附分离能力以及多种脂蛋白(高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白)的吸附选择性。由于该发明所提供的一种新型血浆脂质成份吸附分离多孔膜材料载体制备中采用丙烯酸与肝素配基已经被大量实验证明具有良好生物相容性、血液相容性及血浆脂质成份选择性结合亲和力，并且采用了比较便利的60Co γ-射线共辐照接枝共聚合载体改性技术，因此本发明将提供一种生物安全、血浆脂质成份分离有效、生物相容性良好、制造成本价廉的载体材料。本发明提供的新型载体材料将有可能应用于由于血浆脂质成份如低密度脂蛋白LDL等异常偏高所诱发的冠心病、动脉粥样硬化等临床患者的血液净化治疗。
本发明所提供的一种表面固定肝素配基的多孔膜材料是辐照接枝共聚合聚丙烯酸的医用聚合物无纺布的表面共价偶联固定肝素吸附配基。所述的多孔膜表面的亲和性吸附配基肝素的效价100～180U/mg，从材料经济考虑优选100～160U/mg。
所述的一种血浆脂质成份选择性吸附分离聚合物多孔膜载体材料，其特征是所述的辐照接枝共聚合聚丙烯酸的医用聚合物无纺布是以平均孔径为0.05～100μm水不溶性医用聚合物无纺布经过60Co γ-射线共辐照接枝共聚合聚丙烯酸，丙烯酸的接枝率为5～150重量％，膜表面羧基的含量为10～200μmol/cm2。
所述的医用聚合物无纺布是医用涤纶无纺布或者医用聚丙烯无纺布，平均孔径为0.05～100μm，材质为每平方厘米5～30毫克。
其中，原材料医用聚合物无纺布经过60Co γ-射线共辐照接枝共聚合聚丙烯酸表面亲水改性，特征在于60Co γ-射线共辐照接枝共聚合聚丙烯酸改性过程中，丙烯酸单体水溶液的重量为5～20％，阻聚剂硫酸亚铁重量为0.5～2.5％，催化剂硫酸用量为[H+]＝0.1～0.2M。
其制备过程中以水不溶性、生物微环境稳定、无毒性的不同平均孔径尺寸规格的医用聚合物无纺布为出发材料。
上述制备过程中所采用的无纺布出发材料可以是医用涤纶无纺布或者是聚丙烯无纺布，其应用可能的材质规格为每平方厘米5～30毫克，比较理想的为每平方厘米5～20毫克，最理想的为每平方厘米8～15毫克。
根据本发明所提供的一种表面固定肝素配基的多孔膜材料的制备方法，从合成出发采用医用聚合物无纺布的平均孔径可能的范围为0.05～100μm，比较理想的平均孔径尺寸为0.05～20μm，比较适合吸附应用的平均孔径是0.1～10.0μm。
上述系列不同平均孔径的医用无纺布出发材料，首先经过预先裁剪、加工成5.0cm×5.0cm2尺寸的实验样品。然后依次顺序在丙酮溶液、高纯水溶液中运用超声波清洗15～30分钟，取出真空干燥至恒重备后续制备工序使用。
根据本发明所提供的一种表面固定肝素配基的多孔膜材料的制备方法，将上述经过超声波清洗、干燥以后的不同材质规格、不同平均孔径尺寸的医用聚合物无纺布试样浸泡于一定浓度的丙烯酸溶液中，采用60Co γ-射线共辐照接枝共聚合方法，制备表面接枝共聚合丙烯酸改性的系列聚合物多孔膜吸附载体材料。
上述60Co γ-射线共辐照接枝共聚合丙烯酸过程中，丙烯酸水溶液单体浓度的可能范围是1～50wt％，可以避免溶液中丙烯酸发生明显竞争性均聚反应的比较理想的丙烯酸水溶液浓度为1～30wt％，应用最理想的丙烯酸水溶液单体浓度为5～20wt％。
根据本发明所提供的一种表面固定肝素配基的多孔膜材料的制备方法，采用60Co γ-射线共辐照接枝共聚合丙烯酸制备改性试样过程中，为了有效地防止水溶液中丙烯酸单体的自聚合，提高载体材料表面的接枝率，因此需要加入合适的阻聚剂。以常用的硫酸亚铁盐为例，丙烯酸水溶液中可能的阻聚剂用量范围是0.1～5.0wt％，相对接枝共聚合效果比较理想的阻聚剂用量为0.5～2.5wt％。上述wt表示重量。
同时上述共辐照接枝共聚合过程中，催化剂能够促进该发明所提供的一种表面固定肝素配基的多孔膜材料的60Co γ-射线共辐照表面接枝共聚合丙烯酸的效率。以常用硫酸催化剂为例，可能有效的用量是0.1～5％，比较理想的用量为0.5～1.0％。
上述不同材质规格、不同平均孔径的医用聚合物无纺布出发原材料，在60Co γ-射线共辐照接枝共聚合过程中，经过含有上述浓度丙烯酸单体、阻聚剂、催化剂的水溶液浸泡16～24小时后，置于60Co γ-射线辐射场中，通过辐照剂量的控制，制备系列接枝率的共聚丙烯酸改性多孔膜载体材料。60Co γ-射线共辐照接枝共聚合制备过程发现，上述60Coγ-射线应用可能的辐照总剂量范围是10～50kGy，比较理想的辐照总剂量为20～50kGy。
根据本发明所提供的一种表面固定肝素配基的多孔膜材料的制备方法，上述不同材质规格、不同平均孔径的医用聚合物无纺布出发原材料试样在60Co-射线辐照接枝共聚合丙烯酸后，从溶液中取出，用纯水反复洗净后真空干燥至恒重后得到系列规格、平均孔径以及接枝程度的聚丙烯酸改性聚合物多孔膜载体材料。通过接枝共聚合反应前后载体材料重量的变化，可以定量计算相应接枝率5～150wt％，通过酸碱滴定可以定量地测定羧基含量为10～200μmol/cm2。
根据本发明所提供的一种表面固定肝素配基的多孔膜材料的制备方法，为了有效提高制备所得吸附载体的选择性与吸附分离效率，将在上述经过60Co γ-射线共辐照接枝共聚合丙烯酸改性的系列多孔膜载体材料表面进一步固定具有通过正负静电引力作用增强吸附分离效果的肝素吸附配基，并且上述肝素吸附配基在多孔载体膜材料表面的固定是采用共价偶联的方法实现。
根据本发明所提供的一种表面固定肝素配基的多孔膜材料的制备方法，为了在60Coγ-射线共辐照接枝共聚合丙烯酸改性的系列多孔膜载体材料表面羧基上共价偶联固定肝素配基，因此需要预先将所得无纺布表面的羧基进行活化，其具体方法是将已接枝共聚合丙烯酸的无纺布浸入含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)的磷酸盐缓冲溶液中，调节pH＝4.7，4℃下搅拌1～5小时，然后用高纯水超声波反复洗涤2～3次。
上述羧基活化方法中使用的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)浓度为1～20mg/ml，比较理想的范围是2～10mg/ml；磷酸盐缓冲溶液pH可能的范围为2～6，比较理想的范围是3～5。
根据本发明所提供的一种表面固定肝素配基的多孔膜材料的制备方法，为了在60Co γ-射线共辐照接枝共聚合丙烯酸改性的系列多孔膜载体材料表面羧基上共价偶联固定肝素配基，因此需要将上述表面羧基活化的丙烯酸接枝共聚合无纺布与肝素配基进行共价偶联反应。其制备方法是将已羧基活化的无纺布浸入含有1～10mg/ml肝素(试剂活性≥120U/mg)的磷酸盐缓冲液(pH＝7.6)中，4℃下搅拌12～24小时，用高纯水超声波反复洗涤2～3次，真空干燥。
上述偶联固定肝素反应中，可能使用的肝素试剂活性效价是100～180U/mg，比较理想的效价范围是120～180U/mg；肝素溶液的浓度可能范围为1～50mg/ml，比较理想的范围是5～20mg/ml，磷酸盐缓冲溶液pH可能的范围为6～12，比较理想的范围是6～9。
本发明的优点本发明是一种简便、安全、有效、造价低适于血液净化灌流应用的选择性生物分离载体材料。它制备方法简单、材料来源广泛、生产成本低、易于大规模生产、血液相容性好。
(1)制备方法简单，工艺条件容易控制，生产重复性很好。整个生产工艺中几个关键参数是辐射总剂量、单体溶液浓度、肝素溶液的浓度和pH，结果对其它参数不敏感，而这几个参数很容易被精确控制，所以试验重复性好，容易规模化生产。
(2)材料来源广泛，生产成本低。本发明涉及的主要材料是无纺布与丙烯酸，它们价格十分低廉，而且来源广泛，十分容易获得；其它材料如肝素10元/克、EDC(6元/克)等用量很少，而且价格也都很普通。
(3)本发明所提供的一种表面固定肝素配基的多孔膜材料，其血液相容性好、浸提液无毒、适合紫外等常规医用消毒方法。
(4)根据本发明所提供的一种表面固定肝素配基的多孔膜材料，其血浆脂质成份低密度脂蛋白LDL、总胆固醇TC和甘油三酯TG的静态吸附能力达到比吸附分离前最高下降37.3％、41.0％、63.4％。
(5)本发明所提供的一种表面固定肝素配基的多孔膜材料应用前景广泛。不仅可能应用于临床高血脂症患者血液净化，同时可能应用于血液制品加工产业，从不符合输血标准废弃血浆中通过该发明所提供的吸附分离载体材料以及相关分离辅助设备回收血浆，加工血液制品。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明进行具体说明，将有助于对本发明的理解，但并不限制本发明的内容。实施例中所采用的化学分析方法具体说明如下(1)多孔吸附分离膜表面羧基含量的定量分析方法取经过60Co-射线共辐照接枝共聚合丙烯酸制备改性所得试样一块(5×5cm2)，放入100ml容积的锥形瓶中，然后加入50mol/L浓度的NaOH溶液50ml，室温下静止浸泡24小时。提取浸泡液10ml，用已经标定浓度的盐酸溶液滴定，记录滴定终点时所用盐酸溶液的体积，并且每个试样滴定分析三次，取平均值。因此，多孔膜表面接枝丙烯酸羧基的含量可以通过以下公式计算得到[COOH]=n(Vi-V0)25×5]]>其中n为盐酸的浓度，Vi为试样滴定所用盐酸溶液的体积，V0为未经丙烯酸接枝共聚合改性的多孔膜载体空白参照滴定所用盐酸溶液的体积。
(2)血浆低密度脂蛋白LDL浓度的分析方法采用一步法(即酶法)分析，其原理为人血清与试剂R1中的聚阴离子及聚离子反应，在表面活性剂的作用下，除低密度脂蛋白LDL以外的其它脂蛋白与胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶等发生化学反应而被消除。当加入试剂R2后，其中的表面活性剂迅速发生作用，并释放LDL，并在酶作用下单一催化LDL-C反应，发生现色反应，其显色程度与血清中LDL-C含量成正比。
测定所用试剂的规格及成份(试剂盒购自上海荣盛生物技术有限公司沪食药监械(准)字2005第2401199号)R12*40ml R22*10ml，校准液1*1ml(使用时1ml蒸馏水复溶)。
R1由聚阴离子及胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、酚、过氧化氢酶、表面活性剂等组成。
R2由过氧化物酶、4-氨基安替比林、缓冲液及表面活性剂等组成。
工作液配制试剂R14ml与试剂R21ml混匀。
工作液在2～8℃可稳定3天。(最好使用前临时配制)。
测试程序将待测样品10μl加入1ml工作液中充分混匀，37℃水浴10分钟后，以空白管(10μl蒸馏水加入1ml工作液)调零，分别读取样本管和校准管(10μl标准液加入1ml工作液)的在546nm处紫外吸光度值，计算低密度脂蛋白LDL的含量 (3)高密度脂蛋白HDL浓度测定方法采用一步法(即酶法)测定，其原理人血清与试剂R1中的聚阴离子及聚离子反应，在表面活性剂的作用下于脂蛋白周围形成稳定的保护层，当加入试剂R2后，表面活性剂迅速释放HDL，并在酶作用下单一催化HDL-C反应，其显色程度与血清中高密度脂蛋白HDL-C含量成正比。
测定所用试剂的规格及成份(试剂盒购自上海荣盛生物技术有限公司 沪食药监械(准)字2005第2401199号)R12*40ml R22*10ml，校准液1*1ml(使用时1ml蒸馏水复溶)R1聚阴离子及胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、酚、过氧化氢酶、表面活性剂等组成。
R2过氧化物酶、4-氨基安替比林、缓冲液及表面活性剂等组成。
工作液配制4ml R1与1ml的R2试剂混匀，可在2～8℃下可稳定3天。(最好使用前临时配制)。
测试程序将待测试样10μl加入1ml工作液中充分混匀，37℃中水浴10分钟后，以空白管(10μl蒸馏水加入1ml工作液)调零，分别读取样本管和校准管(10μl标准液加入1ml工作液)的在546nm处的紫外吸光度值，由此计算高密度脂蛋白HDL的浓度 (4)血浆总胆固醇TC浓度的测定方法采用CHOD-PAP法，其原理待测试样中游离及脂化的胆固醇，经下述反应产生醌亚胺，可用紫外分光光度计在500nm处测定其吸光度，根据吸光度的变化，计算血浆胆固醇的含量。
测定所用试剂的规格及成份(上海荣盛生物技术有限公司 沪食药监械(准)字2005第2401199号)R1(缓冲液)2×25ml R2(酶试剂)2×25ml
校准液(5.16mmol/l或200mg/dl)1×1mlPiPes35mmol/L，胆酸钠0.5mmol/L胆固醇脂酶＞0.2U/ml，胆固醇氧化酶＞0.1U/ml酚28mmol/l，过氧化物酶＞0.8U/ml4-氨基安替比林0.5mmol/l，pH7.0工作液配制缓冲液1份与酶试剂1份等量混匀，储存于2～8℃可稳定30天。
测试程序将待测10μl加入1ml工作液中，充分混匀，37℃水浴10分钟后，以空白管(10μl蒸馏水加入1ml工作液)调零，分别读取样本管和校准管(10μl标准液加入1ml工作液)在500nm处的紫外吸光值，由此计算 总胆固醇mmol/l＝mg/dl×0.0258(5)三酯TG浓度的测定方法采用TRIGLYCERIDES KIT(酶比色法)法，其原理待测样品中的甘油三酯经下述反应产生红紫色色素，可用紫外分光光度计定量测定。
测定所用试剂的规格及成份(上海荣盛生物技术有限公司 沪食药监械(准)字2005第2401199号)2×25mlPipes45mmol/L；氯化镁5mmol/L；过氧化物酶＞0.8U/ml；脂蛋白酯酶＞100U/ml；ESBmT 3mmol/l；4-氨基安替比0.75mmol/L；3-磷酸甘油氧化酶＞4U/ml；甘油激酶＞1.5U/ml；ATP0.9mmol/l，pH7.5.
测试程序将待测样品10μl加入1ml工作液中充分混匀，37℃水浴10分钟后，以空白管(10μl蒸馏水加入1ml工作液)调零，分别读取样本管和校准管(10μl标准液加入1ml工作液)在500nm处紫外分光光度计吸光度值，由此计算甘油三酯TG的浓度 甘油三酯mg/dl＝甘油三酯mmol/L×88.5(6)表面全反射红外光谱ATR-FITR分析将待测样品预剪成10mm×80ml的长条在付里叶变换红外光谱仪AVATAR-360上进行测试。
(7)多孔膜材料表面肝素固定量的测定方法将25mg甲苯胺蓝(TB)溶解于含0.02wt％NaCl的盐酸水溶液500ml中，2ml已知量的肝素(HEP)水溶液加入到3ml TB溶液中，搅拌均匀。然后将正己烷3ml加到混合物中，振荡彻底使TB-HEP复合物完全萃取进入有机相。水相中未被萃取的TB可以通过检测631nm处的吸光度来确定，将水相中TB残留量与HEP浓度之间的线性关系制成标准曲线。
将3mlTB溶液与2ml含0.02wt％NaCl的0.01molL-1盐酸水溶液混合，然后再将所得肝素固定的多孔膜材料浸入其中30分钟，其后加入3ml正己烷、摇匀，取出取出多孔膜，以剩余水层作为样品，测631nm处的紫外吸光值，根据标准曲线计算肝素的表面固定量。
实施例1将平均孔径0.1μm的医用聚丙烯无纺布裁剪成5cm×5cm2的试样，依次在丙酮和水中超声波清洗15～30分钟，真空干燥备用。然后，将上述试样浸泡于含丙烯酸单体10％(质量百分比)的水溶液中，溶液中另含有1.0％硫酸亚铁阻聚剂、0.5％硫酸催化剂，浸泡24小时后，将样品置于60Co γ-射线源辐射场中，控制累计辐照总剂量30kGy。取出上述辐照处理试样后，洗净、干燥、称重并计算得到丙烯酸的共聚接枝率为30wt％，相应所得多孔膜载体材料的表面羧基含量为25μmol/cm2，ATR-FITR红外光谱分析发现该试样在1700cm-1处新出现一个很强的吸收带，是羧基吸收的特征信号，表明丙烯酸已被成功接枝共聚合引入聚丙烯无纺布表面，得到聚丙烯酸改性的聚丙烯无纺布多孔膜载体材料。
实施例2将0.45μm的医用聚丙烯无纺布裁剪成5cm×5cm2的试样，依次在丙酮和水中超声波清洗15～30分钟，真空干燥备用。然后将上述试样浸泡于含有15％丙烯酸单体的水溶液中。溶液中同时含有0.5％的硫酸亚铁阻聚剂、1.0％的硫酸催化剂，浸泡24小时候后，将样品置于60Co γ-射线源辐射场中，控制累计辐照总剂量为20kGy。取出上述辐照处理试样后，洗净、干燥、称重并计算得到丙烯酸的共聚合接枝率为84wt％，定量滴定表面羧基含量为70μmol/cm2。ATR-FITR红外光谱分析发现在1700cm-1处出现一个很强的吸收峰，对应于羧基的特征吸收信号，表明84wt％接枝率、0.45μm平均孔径的聚丙烯酸改性的聚丙烯无纺布多孔膜载体材料。
实施例3将1.0μm的医用聚丙烯无纺布裁剪成5cm×5cm2的试样，依次在丙酮和水中超声波清洗15～30分钟，真空干燥备用。然后将上述试样浸泡于含有15％丙烯酸单体的水溶液中。溶液中同时含有0.5％的硫酸亚铁阻聚剂、0.5％的硫酸催化剂，浸泡24小时候后，将样品置于60Co γ-射线源辐射场中，控制累计辐照总剂量为30kGy。取出上述辐照处理试样后，洗净、干燥、称重并计算得到丙烯酸的共聚合接枝率为75wt％，定量滴定表面羧基含量为96μmol/cm2。ATR-FITR红外光谱分析发现在1700cm-1处出现一个很强的吸收峰，对应于羧基的特征吸收信号，表明75wt％接枝率、1.0μm平均孔径的聚丙烯酸改性的聚丙烯无纺布多孔膜载体材料。
实施例4将5.0μm的医用聚丙烯无纺布裁剪成5cm×5cm2的试样，依次在丙酮和水中超声波清洗15～30分钟，真空干燥备用。然后将上述试样浸泡于含有15％丙烯酸单体的水溶液中。溶液中同时含有0.5％的硫酸亚铁阻聚剂、1.0％的硫酸催化剂，浸泡24小时候后，将样品置于60Co γ-射线源辐射场中，控制累计辐照总剂量为30kGy。取出上述辐照处理试样后，洗净、干燥、称重并计算得到丙烯酸的共聚合接枝率为115％，定量滴定表面羧基含量为118μmol/cm2。ATR-FITR红外光谱分析发现在1700cm-1处出现一个很强的吸收峰，对应于羧基的特征吸收信号，表明115％接枝率、5.0μm平均孔径的聚丙烯酸改性的聚丙烯无纺布多孔膜载体材料。
实施例5将实例1无纺布浸入含有EDC1mg/ml的磷酸盐缓冲溶液中pH＝4.7，4℃下搅拌2小时，用蒸馏水超声波反复洗涤2～3次。将样品置于另一含有肝素(≥160U/mg)5mg/ml的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.0)中，4℃下搅拌24小时，用蒸馏水超声波反复洗涤2～3次，真空干燥，得到表面偶联固定肝素吸附配基的多孔膜材料，用甲苯胺蓝比色法测定肝素的固定率4～10μg/cm2。所得多孔膜载体材料血液相容性结果良好，3小时浸提液注射动物实验未见明显毒性反应。
实施例6将实例2无纺布浸入含有EDC1mg/ml的磷酸盐缓冲溶液中pH＝4.7，4℃下搅拌2小时，用蒸馏水超声波反复洗涤2～3次。将样品置于另一含有肝素(≥160U/mg)5mg/ml的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)中，4℃下搅拌24小时，用蒸馏水超声波反复洗涤2～3次，真空干燥，得到表面偶联固定肝素吸附配基的多孔膜材料，用甲苯胺蓝比色法测定肝素的固定率5～25μg/cm2。所得多孔膜载体材料血液相容性结果良好，3小时浸提液注射动物实验未见明显毒性反应。
实施例7将实例3无纺布浸入含有EDC1mg/ml的磷酸盐缓冲溶液中pH＝4.7，4℃下搅拌2小时，用蒸馏水超声波反复洗涤2～3次。将样品置于另一含有肝素(≥160U/mg)5mg/ml的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)中，4℃下搅拌24小时，用蒸馏水超声波反复洗涤2～3次，真空干燥，用甲苯胺蓝比色法测定肝素的固定率15～50μg/cm2。所得多孔膜载体材料血液相容性结果良好，3小时浸提液注射动物实验未见明显毒性反应。
实施例8将实例4无纺布浸入含有EDC1mg/ml的磷酸盐缓冲溶液中pH＝4.7，4℃下搅拌2小时，用蒸馏水超声波反复洗涤2～3次。将样品置于另一含有肝素(≥160U/mg)5mg/ml的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.6)中，4℃下搅拌24小时，用蒸馏水超声波反复洗涤2～3次，真空干燥，用甲苯胺蓝比色法测定肝素的固定率为32～73μg/cm2。所得多孔膜载体材料血液相容性结果良好，3小时浸提液注射动物实验未见明显毒性反应。
实施例9将上述实施例5、6、7、8制备所得多孔膜载体材料剪成碎片，装入10ml样品瓶中，吸取6ml模拟生理溶液(pH＝7.4)将其充分溶胀，然后用注射器将样品瓶中的模拟生理溶液彻底抽干，加入2ml人血浆。然后密封在37℃下振荡3小时后，检测等温吸附前后LDL、HDL、TG、TC的变化情况，结果如下表所示(其中空白对照样是孔径为0.45μm，未接枝丙烯酸的聚丙烯无纺布)。
实施例10将采样于高血脂症患者的分离血浆5ml动态灌流经过装有6层实施例4所得的多孔膜载体材料吸附分离器，动态灌流速度1ml/min，灌流2小时后，血浆中的LDL的浓度由111.64mg/dl降低为13.34mg/dl、HDL的浓度由51.77mg/dl降低为5.2mg/dl、TC的含量由160.31mg/dl下降为16.03mg/dl、TG的含量由522.80mg/dl下降为52.28mg/dl。
权利要求
1.一种血浆脂质成份选择性吸附分离用表面固定肝素配基的多孔膜材料，其特征在于所述的多孔膜载体材料是辐照接枝共聚合聚丙烯酸的医用聚合物无纺布的表面共价偶联固定肝素吸附配基，所述的多孔膜表面的亲和性吸附配基肝素的效价100～180U/mg。
2.如权利要求1所述的一种血浆脂质成份选择性吸附分离用表面固定肝素配基的多孔膜材料，其特征在于所述的多孔膜表面的亲和性吸附配基肝素的效价120～180U/mg。
3.如权利要求1所述的一种血浆脂质成份选择性吸附分离聚合物多孔膜载体材料，其特征是所述的辐照接枝共聚合聚丙烯酸的医用聚合物无纺布是以平均孔径为0.05～100μm水不溶性医用聚合物无纺布经过60Coγ-射线共辐照接枝共聚合聚丙烯酸，丙烯酸的接枝率为5～150重量％，膜表面羧基的含量为10～200μmol/cm2。
4.如权利要求2所述的一种血浆脂质成份选择性吸附分离聚合物多孔膜载体材料，其特征是所述的医用聚合物无纺布是医用涤纶无纺布或者医用聚丙烯无纺布，平均孔径为0.05～100μm，材质为每平方厘米5～30毫克。
5.如权利要求1所述的一种血浆脂质成份选择性吸附分离用表面固定肝素配基的多孔膜材料，其特征在于在60Coγ-射线共辐照接枝共聚合聚丙烯酸表面亲水改性的基础上，再通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)活化多孔膜表面羧基后共价偶联固定上述肝素吸附配体于聚合物多孔膜载体材料的表面。
6.一种如权利要求1所述的血浆脂质成份选择性吸附分离用表面固定肝素配基的多孔膜材料的制备方法，其特征采用以下步骤(1)60Coγ-射线共辐照表面接枝共聚合丙烯酸将清洗过的医用聚合物无纺布中浸泡于含丙烯酸重量为5～20wt％、阻聚剂重量0.5～2.5％、催化剂浓度[H+]＝0.1～0.2M的水溶液中，浸泡16～24小时；将样品置于60Coγ-射线辐射场中，控制辐照总剂量10～50kGy，取出、洗净、干燥，得到丙烯酸表面接枝共聚改性的聚合物多孔膜载体；(2)丙烯酸接枝共聚合改性多孔膜表面偶联固定肝素配基将步骤(1)获得的丙烯酸表面接枝共聚改性的聚合物多孔膜载体浸入含有1～10mg/ml 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、pH＝2～6的磷酸盐缓冲溶液中，4℃下搅拌1～5小时进行羧基活化，用蒸馏水超声波洗涤；然后置于另一含有1～10mg/ml和效价120～180U/mg的肝素配基、pH＝7.6的磷酸盐缓冲溶液中，4℃下搅拌12～24小时，用蒸馏水超声波洗涤、干燥。
7.如权利要求6所述的血浆脂质成份选择性吸附分离用表面固定肝素配基的多孔膜材料的制备方法，其特征是步骤(1)中医用聚合物无纺布的清洗是将0.05～100μm的医用聚合物无纺布依次在丙酮和水中超声波清洗15～30分钟，干燥。
8.如权利要求6所述的表面固定肝素配基的多孔膜材料的制备方法，其特征是步骤(2)中所述的羧基活化中使用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺浓度为2～10mg/ml、pH＝3～5的磷酸盐缓冲溶液。
9.如权利要求6所述的表面固定肝素配基的多孔膜材料的制备方法，其特征是步骤(2)中所述的含有肝素配基的磷酸盐缓冲溶液是含有1～10mg/ml和效价120～180U/mg的肝素配基、pH＝7.6的磷酸盐缓冲溶液。
10.一种如权利要求1所述的表面固定肝素配基的多孔膜材料的用途，主要应用于血浆脂质成份的吸附分离、临床高血脂症病人的血液动态灌流净化材料或废弃血浆分离再生利用辅助材料。
全文摘要
本发明旨在提供一种表面固定肝素配基的多孔膜载体材料、制备方法与应用。该聚合物多孔膜载体材料是以平均孔径为0.05～100μm医用聚合物无纺布为出发原材料，通过
文档编号B01J20/26GK101024150SQ20071003640
公开日2007年8月29日 申请日期2007年1月12日 优先权日2007年1月12日
发明者曹阿民, 侯小东, 张涛 申请人:中国科学院上海有机化学研究所