专利名称：采用金属氧化物磁性微球分离富集磷酸化肽段的方法
技术领域：
本发明属无机材料及生化分析技术领域，具体涉及一种超顺磁性的具有核壳结构的金属氧化物包覆四氧化三铁磁性微球应用于分离富集磷酸化肽段的方法。
背景技术：
蛋白质的磷酸化在调节生命过程中发挥着重要的作用，因此研究复杂混合物样品中的磷酸化蛋白对于揭示生命过程的调节机制是非常有意义的。生物质谱是解析磷酸化肽段结构的有力手段，但是由于磷酸化肽段的离子化效率相对较差，因此样品中非磷酸化肽段信号严重干扰了磷酸化肽段的检测。因此，在质谱分析之前对磷酸化肽段进行预分离富集是非常必要的。目前，固定金属离子亲和色谱(IMAC)是广为采用的分离富集磷酸化蛋白和肽段的有效方法。然而，该技术采用的基体材料为大孔树脂，富集到孔中的磷酸化肽段无法被质谱检测到，即所谓的“孔洞效应”。但是固定金属离子亲和色谱材料中金属离子是螯合在基体材料上，对使用体系条件要求相对较高。
近年来，人们热衷于新的IMAC基体材料的研究。随着磷酸化肽段分离鉴定方法的快速发展，研究者们发现很多金属氧化物都能选择性地分离富集复杂样品中的磷酸化肽段。金属氧化物以其高选择性和较好的结果重现性成为分离富集磷酸化肽段的又一有力手段。金属氧化物可采用装填成柱子或是直接离心分离的方法用于分离富集磷酸化肽段。装柱使用相对复杂；使用高速离心，仍存在两点不足操作费时费力；高速离心可能造成“共沉淀效应”，即高质量的非磷酸化肽段和磷酸化肽段共沉淀下来。而采用磁性材料为基体，利用材料的超顺磁性就可以有效地解决以上存在的问题。将磁性分离和金属氧化物的选择性结合起来，可实现混合物中磷酸化肽段的快速简单富集。因此，合成结构紧密且具有完整核壳结构的包覆金属氧化物的磁性材料，更好地利用磁核的分离性能和金属氧化物外壳对于磷酸化肽段的选择性能，以便更好地实现对于磷酸化肽段的选择性富集是很有必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简单、效率高、效果好，能对痕量磷酸化肽段进行高选择性富集的方法。
本发明涉及的具有核壳结构的金属氧化物磁性微球，是在超顺磁性Fe3O4微球外部包覆碳层作为模板，进而包覆金属氧化物，然后灼烧去除碳层的方法制备而得，结构紧密。其核为Fe3O4，粒径为100-300nm，外壳为金属氧化物层，厚度为30-50nm。这里金属氧化物包括TiO2、Al2O3、Ga2O3、ZrO2、In2O3或Ce2O3等。
本发明中采用的具有核壳结构的金属氧化物磁性微球的制备方法为在Fe3O4微球外部包覆碳层作为模板，进而包覆金属氧化物，然后灼烧去除碳层。其合成路线如图1所示。
本发明提出的分离富集磷酸化肽段的方法，是将上述具有核壳结构的金属氧化物磁性微球直接放入含有磷酸化肽的复杂肽段混合物中，进行痕量磷酸化肽选择性富集，无需特殊处理；富集好后，采用磁场对富集的磷酸化肽和其他样品的分离，无需离心，所以可以克服传统离心造成的非磷酸化肽的共离心沉淀问题；然后对富集样品进行洗脱，也可不洗脱，直接进行分析，克服了样品洗脱过程造成的样品损失问题。并且该材料不存在传统材料的“孔洞效应”，可直接用于基质辅助激光解析离子化质谱分析，方法简单实用有效。
本发明中，上述富集体系的pH值为1-6，磷酸化肽样品浓度为0.05-5ng/μL，超顺磁性微球量是10-1000μg/1mL样品，富集时间在30秒-90分钟，富集温度为20-45℃，样品洗脱体系pH值为10-14，洗脱时间为5-60分钟。磁性微球的用量为10-1000μg/L样品。本发明可用任何一种合成的具有核壳结构的金属氧化物磁性微球，其溶液分散性非常好，体系均匀稳定，有利于溶液中的磷酸化肽在材料上的富集。
本发明的对磷酸化肽进行有效选择性富集的方法简单有效并具有很好的磁场感应性；富集过程无需离心分离，采用磁场作用就可实现材料和样品的分离；与基质辅助激光解析离子化质谱有很好的相容性，被具有核壳结构的金属氧化物磁性微球吸附后的样品也可无需样品洗脱步骤可直接进行基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱分析，避免了洗脱过程造成的样品损失；方法简单有效。本发明可对低至2fmol/μL级的复杂肽段混合物中的磷酸化肽实现高选择性富集，富集效率提高一个数量级以上。该磷酸化肽选择性富集方法在蛋白质组学翻译后修饰研究等领域有良好的实用价值和应用前景。
图1为本发明方法中采用的具有核壳结构的金属氧化物磁性微球的合成路线图。
图2为本发明方法中采用的具有核壳结构的金属氧化物磁性微球的透射电镜图。可见磁球外部均匀包覆了一层金属氧化物。
图3为10μg具有核壳结构的金属氧化物磁性微球富集2×10-8M(a和b)和2×10-9M(d和e)β-casein的胰蛋白酶酶解混合肽段的前后的MALDI-TOF MS谱图。比较a和b图，c和d图，可见磷酸化肽富集效率均超过一个数量级以上。
图4为10μg具有核壳结构的金属氧化物磁性微球富集2×10-8M(a和b)β-casein的胰蛋白酶酶解混合肽段前后的MALDI-TOF MS谱图。富集到材料上的磷酸化肽段采用10μL 0.5％的氨水洗脱。将洗脱的样品进行质谱分析。比较图3b和图4可见，将样品洗脱分析与直接点样法两者所得的磷酸肽信号强度相近，并没有表现出很大的差距，说明了利用具有核壳结构的金属氧化物磁性微球富集磷酸化肽段的方法具有较高的回收率，也显示出使用该方法富集分离磷酸化肽在实验操作上具有较强的灵活性。
图5为20μg具有核壳结构的金属氧化物磁性微球富集2×10-7M casein蛋白的胰蛋白酶酶解混合肽段前后的MALDI-TOF MS谱图(a和b)。比较a和b，可见肽段混合物中的磷酸化肽得到了选择性富集。富集到的磷酸化肽段如表1所示。
具体实施例方式
通过实施例是对本发明所提供的超顺磁性的具有核壳结构的金属氧化物磁性微球材料进行样品富集和基质辅助激光解吸离子化/质谱直接分析过程的进一步说明。
实施例1复杂肽段混合物中磷酸化肽的选择性富集和质谱测定取200μL浓度为2×10-8M β-酪蛋白胰蛋白酶酶解的肽段混合物，加入10μL的1mgmL-1的具有核壳结构的Fe3O4@TiO2磁性微球，用三氟乙酸调节体系pH值为2，在37摄氏度下振荡5分钟，对所述肽段进行富集；在磁场作用下，分离上清液和富集了磷酸化肽段的材料。用50％(体积比)的乙腈水溶液清洗材料两次，在沉淀中加入10μL的50％(体积比)的乙腈水溶液，振荡使之悬浮。悬浮液0.4μL与等体积30mg mL-12，5-DHB(50％乙腈水溶液，v/v)和1％(v/v)H3PO4水溶液，1∶1(v/v)混合点至MALDI靶板上，在MALDI-TOF MS(4700 Proteomics Analyzer，Applied Biosystems)上进行分析；激光器为Nd-YAG激光，波长355nm，激光脉冲频率200Hz；加速电压20KV；正离子模式，反射式TOF检测。由图3(b(所示，磷酸化肽段得到了有效选择性富集。
实施例2调整将富集到材料上的样品采用10μL 0.5％的氨水洗脱5min，将洗脱后得到的样品再进行MALDI-TOF MS分析。结果如图4所示，得到了选择性富集的磷酸化肽段被从材料上洗脱下来并得到了有效检测。
实施例3-5调整将富集到材料上的样品采用10μL 0.5％的氨水洗脱的时间为分别为5min、15min、60min，将洗脱后得到的样品再进行MALDI-TOF MS分析。实验结果表明富集到材料上的磷酸化肽段在5分钟内就能得到基本完全的洗脱。
实施例6调整β-酪蛋白胰蛋白酶酶解的肽段混合物的浓度为2×10-9M，其他条件同实施例1。结果如图3(c)和3(d)，对比两图可见，富集后磷酸化肽段得到了有效的选择性富集。
实施例7调整采用的混合肽段样品是200μL浓度为2×10-7M的Casein蛋白的胰蛋白酶酶解的肽段混合物，其他条件同实施例1，进行选择性富集浓缩和质谱实验。实验结果如图5(a)和图5(b)所示。复杂肽段混合物中的磷酸化肽段得到了选择性富集。
实施例8-10调整吸附时间为30秒，15分钟，60分钟，其他条件同实施例1，进行选择性富集浓缩和质谱实验。实验结果表明具有核壳结构的磁性微球在30秒的时间时就能实现对磷酸化肽段的有效富集。
实施例11-12调整吸附温度为25，45度，其他条件同实施例1，进行选择性富集浓缩和质谱实验。
实施例13-14调整吸附体系pH值为4，6，其他条件同实施例1，进行选择性富集浓缩和质谱实验。
实施例15-19调整采用的具有核壳结构的金属氧化物磁性微球材料其表面分别为包覆Al2O3、Ga2O3、ZrO2、In2O3、Ce2O3，其他条件同实施例1，进行选择性富集浓缩和质谱实验。
实施例20-24调整采用的具有核壳结构的金属氧化物磁性微球材料其表面分别为包覆Al2O3、Ga2O3、ZrO2、In2O3、Ce2O3，其他条件同实施例2，进行选择性富集浓缩和质谱实验。
实施例4-21的结果与实施例1，2，3相似。
表1 MALDI-TOF MS检测到的casein蛋白胰蛋白酶酶解肽段混合物中的磷酸化肽段
权利要求
1.一种采用金属氧化物磁性微球分离富集磷酸化肽段的方法，其特征在于直接将金属氧化物磁性微球加入含有磷酸化肽的复杂肽段混合物中，进行痕量磷酸化肽选择性富集，然后采用磁场对富集的磷酸化肽和其他样品分离；最后对富集样品进行洗脱；其中，富集体系pH值为1-6，样品浓度为0.05-5ng/μL，富集时间为30秒-90分钟，富集温度为20-45℃；样品洗脱体系pH值为10-14，洗脱时间为5-60分钟；磁性微球用量是10-1000μg/mL样品；上述金属氧化物微球为核壳结构，其核为Fe3O4，粒径为100-300nm，外壳为金属氧化物层，厚度为30-50nm，这里金属氧化物为TiO2、Al2O3、Ga2O3、ZrO2、In2O3或Ce2O3。
全文摘要
本发明属于无机材料和生化分析技术领域，具体为一种采用具有核壳结构的金属氧化物磁性微球分离富集磷酸化肽段的方法。本发明将上述磁性微球作为微吸附剂直接加入含有痕量磷酸化肽段混合溶液中，在一定条件下进行富集。操作简便，无需离心，避免了离心过程造成的“共沉淀效应”及传统固定金属离子亲和材料的“孔洞效应”，且具有更高的化学惰性和稳定性。本发明方法对于复杂体系中磷酸化肽段具有很好的选择性富集性能，富集效率可提高一个数量级以上；既可将富集的样品洗脱也可不洗脱直接进行基质辅助激光解析电离－飞行时间质谱分析，方法灵活。该方法在蛋白质组学翻译后修饰研究等领域具有良好的实用价值。
文档编号B01J20/06GK101054406SQ200710041168
公开日2007年10月17日 申请日期2007年5月24日 优先权日2007年5月24日
发明者邓春晖, 徐秀青, 李嫣, 张祥民 申请人:复旦大学