专利名称：8,8’-二-苯氨基-5,5’-二-萘基-1,1’-二-磺酸盐合成方法
技术领域：
本发明涉及一种生物工程技术领域的蛋白质荧光探针的合成方法，具体涉及 一种8， 8' -二一苯氨基一5， 5' —二一萘基一l， 1' 一二一磺酸盐合成方法。
技术背景荧光探针技术是利用物质的光物理和光化学特性，在分子量级上研究溶液中 蛋白质高灵敏度的分析方法。蛋白质分子荧光探针按荧光波长可分为发射在紫外 可见区的荧光探针和近红外荧光探针。8-苯胺基-l-萘磺酸盐(ANS)—直是蛋白质分子紫外可见区探针中应用最广 泛的。研究表明，ANS在人血红蛋白中心空腔2DPG2结合位点与蛋白质非共价结合， 其结合方式是基于蛋白质分子的疏水作用机理以非共价键结合到蛋白质分子的 非极性区域中，使得蛋白质荧光强度大为加强，在一定范围内，荧光强度与蛋白 质的浓度呈线性关系。后来研究发现，ANS的双环化合物8， 8' _二_苯氨基— 5， 5， 一二一萘基一1， 1， 一二一磺酸盐(bis-ANS)与蛋白质分子结合的更牢 固稳定，且结合物具有更宽泛的荧光吸收光谱。因此，对于bis-ANS在蛋白质分 子荧光探针领域的研究应用一直是生物及有机化学领域的热点。从20世纪80年代以来，文献中报道过的关于bis-ANS合成方法很多。有较 早期的氯化铝、氯化铜催化偶联法，硝酸、盐酸/亚硝酸钠催化合成法，铊金属 催化氧化去氢偶联法，及在此基础上发展的电化学氧化法等。 一般认为该反应的 机理为芳香环化合物的自耦合反应(self-couple reaction),涉及到自由基反 应机理。经对现有技术的文献检索发现，F J Farris等在《Journal of the American Chemical Society》上发表的文章"Preparation, Crystalline Structure, and Spectral Properties of the Fluorescent Probe4,4， —Bis-l-phenylamino-8—n即hthalenesulfonate'，，(美国化学会志，1978年第100期第14巻第4469页，"荧光探针4， 4， -二-l-苯氨基-S-萘磺酸盐的 制备，晶体结构及光谱性质")。该文中提出用盐酸/亚硝酸钠催化合成荧光探 针4， 4' -二-l-苯氨基-8-萘磺酸钾的方法)，具体方法为8-苯胺基-l-萘磺 酸(ANS)为原料与氢氧化钾反应制得8-苯胺基-1-萘磺酸钾；在浓盐酸和亚硝酸 钠催化下，以盐酸作为反应溶剂，在酸性环境下进行反应，反应结束后经过硅胶 柱分离得到产物8， 8' -二一苯氨基一5， 5' —二一萘基一1， 1' 一二一磺酸盐， 产率最高为10%。其不足在于在一般有机溶剂中该反应原料8-苯胺基-l-萘磺 酸盐的溶解性很差，因此产率很低。
离子液体是指在室温或接近室温下呈现液态的、完全由阴阳离子所组成的 盐，也称为低温熔融盐。室温离子液体由于其独特的理化性质而得到世界各国化 学工作者的广泛关注，它被认为是继超临界二氧化碳之后的"新一代绿色溶剂"。 由于离子液体具有高溶解性(尤其适合普通有机液相合成中难以完成的反应)； 可重复利用性等独特性能，目前，离子液体作为反应溶剂已被应用到多种类型反 应中。例如氢化反应；傅-克反应；Heck反应；Diels-Aider反应等等。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的不足，提供一种蛋白质荧光探针 bis-ANS合成的方法，即8， 8， _二 —苯氨基一5， 5' _二一萘基—1， 1， 一二 一磺酸盐(bis-ANS)的化学合成方法。本发明利用离子液体的特性，采用几种 自行合成的咪唑阳离子类离子液体作为反应的溶剂，解决了反应原料8-苯胺基 -l-萘磺酸盐在普通有机溶剂中溶解性差的问题，提高了 bis-ANS产率。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明以烷基咪唑、卤代垸为原料，以 1， 1， l一三氯乙垸做反应溶剂，搅拌回流反应，得到相应的咪唑阳离子类离子 液体。然后以8-苯胺基-l-萘磺酸(ANS)为原料与氢氧化钾反应制得8-苯胺基-l-萘磺酸钾，在盐酸和亚硝酸钠催化下，以合成的咪唑阳离子类离子液体与丙酮混 合作为反应溶剂，回流温度下进行反应，反应结束后经过硅胶柱分离得到产物8， 8' -二一苯氨基一5， 5' —二一萘基一l， 1' 一二 —磺酸盐(bis-ANS)，产率最 高达到26%。
本发明包括以下合成步骤
第一步，咪唑阳离子类离子液体的合成制备以取烷基咪唑与卤代烷为原料，以l， 1， l一三氯乙烷为溶剂，回流反应得 咪唑阳离子类离子液体产物。所述第一步中，具体参数为烷基咪唑与卤代烷以1: 1. 0-1. 5摩尔比例混合，溶解于20-30倍体积比1，1， l一三氯乙烷中，搅拌回流反应2-4小时。趁热用分液漏斗将产物分离，再用1， 1， l一三氯乙烷洗涤两次，旋转蒸发溶剂后得产物。所得咪唑阳离子类离子液体产物分别为1、碘化1,3-二甲基-咪唑(丽頂1—)， 2、溴化l-乙基-3-甲基咪唑(EM頂Br—)， 3、溴化1-丙基-3-甲基咪唑(PM頂Br—)， 4、氯化1-丁基-3_甲基咪唑(BM頂C1一)， 5、溴化1，3-二乙基咪唑(EEIMBr—)， 6、溴化l-丙基-3-乙基咪唑(PE頂Br—) ， 7、 氯化1-丁基-3-乙基咪唑(BEIMCD 。第二步，8， 8， -二一苯氨基一5， 5， 一二一萘基一l， 1' — 二一磺酸钾的 合成以8-苯胺基-l-萘磺酸(ANS)为原料与氢氧化钾反应制得ANS的钾盐，将该 钾盐在浓盐酸和亚硝酸钠催化下，以合成的咪唑阳离子类离子液体与丙酮混合后 作为反应溶剂，回流温度下进行反应，反应完毕后经过硅胶柱分离得到产物。所述第二步，具体实现如下步骤一，8-苯胺基-1-萘磺酸与氢氧化钾摩尔比例为1: 1，溶解于水中升温 并搅拌，之后冷却至室温慢慢析出结晶，收集并重结晶后得到8-苯胺基-l-萘磺 酸钾盐；步骤二，在室温下，将8-苯胺基-l-萘磺酸钾盐溶解在20-30倍质量比的丙 酮中，加入第一步合成的咪唑阳离子类离子液体，在剧烈搅拌下加入盐酸，待反 应物冷却至室温后缓慢滴加亚硝酸钠溶液，升温并控制溶剂回流，反应数小时， 反应物冷却至室温，将上部丙酮层倒出；步骤三，用丙酮冲洗残余的离子液体，合并丙酮溶液用饱和碳酸氢钠溶液调 整pH值，减压浓縮得到墨绿色固体粉末，即8-苯胺基-1-萘磺酸钾和8， 8'-二一苯氨基一5， 5' —二一萘基一l， 1' 一二一磺酸钾及少量无机盐的混合物；步骤四，将上述混合物通过柱层析，用丙酮与乙酸乙酯按照体积比1: l混 合后做洗脱剂，分离得到产物8， 8' -二_苯氨基一5, 5' —二一萘基一1， 1'一二一磺酸钾(bis-ANS)。
步骤一中，所述升温，其温度为40。C 6(TC。 步骤二中，所述的盐酸，是指体积浓度为36%浓盐酸。 步骤二中，所述亚硝酸钠溶液，其浓度为0. 2摩尔/升亚硝酸钠溶液。 步骤二中，所述升温并控制溶剂回流，其温度为60。C 8(TC。 步骤三中，所述的调整pH值，是指调节pH值至7-9。 本发明针对8， 8， -二一苯氨基一5， 5' —二一萘基一l， 1' — 二一磺酸钾 (bis-ANS)合成产率低的问题，采用自行合成的咪唑阳离子类离子液体作为反 应溶剂，与已有技术相比，解决了以往合成方法中因反应物难溶而造成产率低(产 率〈3%)的问题，并将产率提高到20%以上。同时，该合成方法相对简化了反应 步骤并使后处理更简便；作为溶剂的离子液体可以重复使用，也体现了绿色化学 环保观念。该合成方法较好的优化了8， 8' -二一苯氨基一5， 5' —二一萘基一 1， 1， 一二一磺酸钾(bis-ANS)的工艺路线，为工业化生产提供了技术上的支 持。
具体实施例方式
下面对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下 进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实 施例。
本发明以下的实施例按照如下步骤实施
第一步，咪唑阳离子类离子液体的合成制备
室温下，将垸基咪唑溶于l， 1， l一三氯乙垸中，常压新蒸馏后的卤代垸
加入反应物中，升温至回流温度(70-8CTC)，维持此温度搅拌反应2-4小时。 反应完毕，趁热用分液漏斗将产物分层，收集下层的产物部分；再用1， 1， 1 一三氯乙烷20mlX2洗涤两次，将产物部分室温下减压蒸干溶剂后得咪唑阳离 子类离子液体产物。
第二步，8， 8' -二一苯氨基一5， 5' —二一萘基一l， 1' 一二一磺酸钾的
合成
(1) 8-苯胺基-卜萘磺酸钾的合成 8-苯胺基-1-萘磺酸溶解于氢氧化钾水溶液，升温至40°C-6(TC搅拌1小时，之后冷却至室温，静置并看到反应物中慢慢析出结晶，收集该析出的结晶，并在 水中重结晶后得到8-苯胺基-1-萘磺酸钾盐。(2) 在室温下，将8， 8' _二一苯氨基_5， 5' —二一萘基一1， 1' 一二 一磺酸钾溶解在丙酮溶剂中，之后向其中加入第一歩中合成的离子液体，在剧烈 搅拌下向反应物中滴加入盐酸，待反应物冷至室温后向其中缓慢滴加亚硝酸钠溶 液，滴加完毕后升温至60 8(TC反应40分钟 2小时。反应物冷却至室温，将 上部丙酮层倒出。(3) 将残余物用布氏漏斗过滤，用丙酮冲洗残余物，合并丙酮溶液用饱和 碳酸氢钠溶液调整pH值，将该溶液减压浓縮得到墨绿色固体粉末(此为原料8-苯胺基-l-萘磺酸钾和产物8， 8' -二一苯氨基一5， 5' —二一萘基一1， 1' 一 二 一磺酸钾以及碳酸氢钠的混合物)。(4) 将上述混合物通过柱层析，用丙酮与乙酸乙酯按照体积比l: l混合 后做洗脱剂，分离得到产物8， 8' _二一苯氨基一5， 5' —二一萘基一1， 1' 一二一磺酸钾(bis-ANS)。以下给出实施例1-3的具体实施条件第一步，如以上所述，咪唑阳离子类离子液体的合成中，参数条件分别为烷基咪唑与囟代烷分别以1: 1.0; 1: 1.2; 1: L5摩尔比例混合； 垸基咪唑与卤代垸溶解于20; 25; 30倍体积比1， 1， l一三氯乙垸中； 反应搅拌回流时间分别为2; 2.5; 3小时；反应温度70。C; 75°C; 80°C。所得咪唑阳离子类离子液体产物分别为1、碘化1， 3-二甲基-咪唑(画頂r) ， 2、溴化l-乙基-3-甲基咪唑(EMIMBr一)， 3、溴化l-丙基-3-甲基咪唑(PMIMBr—)， 4、氯化1-丁基-3_甲基咪唑(BM頂C1—)， 5、溴化1， 3-二乙基咪唑(EE頂Br—) ， 6、溴化1-丙基_3-乙基咪唑(PEIMBr—) ， 7、 氯化l-丁基-3-乙基咪唑(BE頂C1—)。第二步，如以上所述，其中所述8-苯胺基-l-萘磺酸钾的合成中，参数条件为 8-苯胺基-l-萘磺酸0. 15mol，溶解于氢氧化钾水溶液8. 4g/150ml水；反应温度为60°C，反应时间1小时。
所述8， 8， -二一苯氨基一5， 5' —二一萘基一l， 1' — 二一磺酸钾 (bis-ANS)的合成中，参数条件为在室温下，将8， 8' -二一苯氨基一5， 5' 一二一萘基一l， 1， 一二一磺酸钾5g溶解在50ml丙酮溶剂中，之后向其中加入 第一步中合成的离子液体10g。
在剧烈搅拌下向反应物中滴加入36%浓盐酸10ml，待反应物冷至室温后向其 中缓慢滴加0. 2摩尔/升亚硝酸钠溶液10ml。
滴加完毕后升温分别至6(TC、 7CTC、 8CTC反应。
反应时间分别为40分钟、1.5小时、2小时。
反应物冷却至室温，将上部丙酮层倒出。然后，将残余物用布氏漏斗过滤， 用100ml丙酮冲洗残余物，合并丙酮溶液用饱和碳酸氢钠溶液调整pH值至7. 5， 将该溶液减压浓縮得到墨绿色固体粉末(此为原料8-苯胺基-l-萘磺酸钾和产物 8， 8' -二一苯氨基一5， 5' —二一萘基一1， 1' 一二一磺酸钾以及碳酸氢钠的 混合物)。
将上述混合物通过柱层析分离，以丙酮与乙酸乙酯按照体积比l: l混合后 做洗脱剂，得到产物8， 8， -二一苯氨基一5， 5， 一二一萘基一l， 1， 一二一磺 酸钾(bis-ANS) 2. 6g产率26X。
实施例4
在8， 8' -二一苯氨基一5， 5' —二一萘基一1， 1' 一二一磺酸钾的合成中， 分别使用制备的七种离子液体与丙酮混合作为反应溶剂，在其他反应条件相同的 情况下(0.2M亚硝酸钠溶液8ml， 36。/。浓盐酸10ml，反应温度6(TC，反应时间2 小时)，分别考察其各自的产率，结果如下所示。
1、碘化1,3-二甲基-咪唑(丽頂I—)一产率14.8%, 2、溴化l-乙基-3-甲基咪 唑(EM頂Br—)—产率12. 5%， 3、溴化1-丙基-3-甲基咪唑(PMIMBr—)—产率9. 6%， 4、氯化l-丁基-3-甲基咪唑(BM頂Cl—)一产率19.2%， 5、溴化1， 3-二乙基咪唑 (EEIMBr，一产率10. 8%， 6、溴化1-丙基_3-乙基咪唑(PEIMBr-)—产率16. 3%， 7、 氯化1-丁基-3-乙基咪唑(BE頂C1—)—产率23. 4%。
实施例5在8， 8' -二一苯氨基一5， 5' —二一萘基一l， 1' 一二一磺酸钾的合成中， 为了考察亚硝酸钠的用量对产率的影响，根据实施例4的结果，选用了其中在实 施例4中描述的产率最高的离子液体-一7氯化1-丁基-3-乙基咪唑(BEIMCl—)与 丙酮作为混合溶剂，其他反应条件同实施例4中描述一致，在上述情况下，分别 考察了使用0.2M亚硝酸钠溶液在8ml、 10 ml、 15 ml不同用量下的产率情况为0. 2M亚硝酸钠溶液在8ral—产率23. 1%, 0. 2M亚硝酸钠溶液在10ml—产率 26. 0%， 0. 2M亚硝酸钠溶液在12ml—产率25. 7%。
权利要求
1. 一种8，8’-二-苯氨基-5，5’-二-萘基-1，1’-二-磺酸盐合成方法，其特征在于，包括以下合成步骤第一步，几种咪唑阳离子类离子液体的合成制备以取烷基咪唑与卤代烷为原料，以1，1，1-三氯乙烷为溶剂，回流反应得咪唑阳离子类离子液体产物；第二步，8，8’-二-苯氨基-5，5’-二-萘基-1，1’-二-磺酸钾的合成以8-苯胺基-1-萘磺酸为原料与氢氧化钾反应制得8-苯胺基-1-萘磺酸的钾盐，将该钾盐在盐酸和亚硝酸钠溶液催化下，以合成的咪唑阳离子类离子液体与丙酮混合后作为反应溶剂，回流温度下进行反应，反应完毕后经过硅胶柱分离得到产物。
2、 根据权利要求1所述的8， 8， -二_苯氨基一5, 5' —二一萘基—1， 1' 一二一磺酸盐合成方法，其特征是，所述第一步中，具体参数为垸基咪唑与卤 代垸以1: 1.0-1.5摩尔比例混合，溶解于20-30倍体积比1， 1， l一三氯乙烷 中，搅拌回流反应2-4小时，趁热用分液漏斗将产物分离，再用l， 1， 1_三氯 乙烷洗涤两次，旋转蒸发溶剂后得产物。
3、 根据权利要求1或2所述的8， 8' -二一苯氨基一5， 5' —二_萘基—1， 1' 一二一磺酸盐合成方法，其特征是，所述回流反应，其回流温度控制在7(TC -80°C，反应时间2小时。
4、 根据权利要求1所述的8， 8， -二 —苯氨基一5， 5' —二一萘基一1， 1' 一二一磺酸盐合成方法，其特征是，所述第一步共制备了以下七个系列咪唑阳离 子类离子液体，分别为碘化1,3-二甲基-咪唑應IMI—，溴化l-乙基-3-甲基咪 唑EMIMBr—，溴化l-丙基-3-甲基咪唑PM頂Br—，氯化1-丁基-3_甲基咪唑BM頂C1—， 溴化1, 3-二乙基咪唑EE頂Br—，溴化l-丙基-3-乙基咪唑PE頂Br—)，氯化1-丁基-3-乙基咪唑BE顶cr。
5、 根据权利要求1所述的8，8' -二一苯氨基—5，5' —二一萘基一1，1' 一二一磺酸盐合成方法，其特征是，所述第二步，具体实现如下步骤一，8-苯胺基-l-萘磺酸与氢氧化钾摩尔比例为1: 1，溶解于水中升 温并搅拌，之后冷却至室温慢慢析出结晶，收集并重结晶后得到8-苯胺基-1-萘磺酸钾盐；步骤二，在室温下，将8-苯胺基-1-萘磺酸钾盐溶解在20-30倍质量比的 丙酮中，加入第一步合成的咪唑阳离子类离子液体，在剧烈搅拌下加入盐酸， 待反应物冷却至室温后缓慢滴加亚硝酸钠溶液，升温并控制溶剂回流，反应数 小时，反应物冷却至室温，将上部丙酮层倒出；步骤三，用丙酮冲洗残余的离子液体，合并丙酮溶液用饱和碳酸氢钠溶液 调整pH值，减压浓縮得到墨绿色固体粉末，即8-苯胺基-l-萘磺酸钾和8， 8'-二一苯氨基一5，5' —二一萘基一l，l' 一二一磺酸钾及少量无机盐的混合物；步骤四，将上述混合物通过柱层析，用丙酮/乙酸乙酯做洗脱剂，分离得到产物8， 8' -二_苯氨基_5， 5' —二一萘基一l， 1' 一二一磺酸钾。
6、 根据权利要求5所述的8，8' -二一苯氨基一5，5' —二一萘基一l，l' 一二一磺酸盐合成方法，其特征是，步骤一中，所述升温，其温度为4(TC 60 。C。
7、 根据权利要求5所述的8， 8' -二一苯氨基一5， 5， 一二一萘基一l， 1' 一二一磺酸盐合成方法，其特征是，步骤二中，所述的盐酸，是指体积浓度为 36%浓盐酸。
8、 根据权利要求5或7所述的8， 8' _二一苯氨基一5， 5' —二一萘基一l， 1' — 二一磺酸盐合成方法，其特征是，步骤二中，所述亚硝酸钠溶液，其浓度 为0. 2摩尔/升亚硝酸钠溶液。
9、 根据权利要求5或7所述的8， 8' -二一苯氨基一5， 5， 一二一萘基一l， 1' — 二一磺酸盐合成方法，其特征是，步骤二中，所述升温并控制溶剂回流， 其温度为60°C 80°C。
10、 根据权利要求5所述的8， 8， -二一苯氨基一5， 5' —二一萘基一1， 1， 一二一磺酸盐合成方法，其特征是，步骤三中，所述的调整pH值，是指调 节pH值至7-9。
全文摘要
本发明涉及一种生物工程技术领域的蛋白质荧光探针8，8’-二-苯氨基-5，5’-二-萘基-1，1’-二-磺酸盐(bis-ANS)合成的方法，以烷基咪唑、卤代烷为原料，以1，1，1-三氯乙烷做反应溶剂，搅拌回流反应，得到相应的咪唑阳离子类离子液体。然后以8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS)为原料与氢氧化钾反应制得8-苯胺基-1-萘磺酸钾；在盐酸和亚硝酸钠催化下，以合成的咪唑阳离子类离子液体与丙酮混合作为反应溶剂，回流温度下进行反应，反应结束后经过硅胶柱分离得到产物8，8’-二-苯氨基-5，5’-二-萘基-1，1’-二-磺酸盐(bis-ANS)，产率最高达到26％。
文档编号B01J31/02GK101279939SQ20081003819
公开日2008年10月8日 申请日期2008年5月29日 优先权日2008年5月29日
发明者磊 傅, 刘文陆, 张健存, 彭英丹 申请人:上海交通大学