用于生物标本的收集、刺激、稳定化和分析的装置、系统和方法

专利名称：用于生物标本的收集、刺激、稳定化和分析的装置、系统和方法
用于生物标本的收集、刺激、稳定化和分析的装置、系统和
方法交叉引用本发明要求于2007年11月28日提交的美国临时专利申请No. 60/990，626的优 先权，该申请其整体通过引用包含于此。
背景技术：
传统的诊断集中于测量标本的未受干扰的生物状态。近年来，人们对将患者材 料暴露于诸如细胞因子、免疫调节因子、现有的药物和新的候选药物等刺激剂，然后测量 诸如细胞内信号转导和基因组转录的多种细胞参数所产生的变化越来越感兴趣。若干 研究显示，对患者标本进行刺激会产生其他方式无法看到的生物状态，这些生物状态具 有实质的临床和诊断价值(Irish，J.M 等人.Single cell profiling ofpotentiated phosphor-protein networks in cancer cells.Cell(2004) 118, 217-28 ；Van Meter, Μ. E 等人· K_RasG12D expression induceshyperproliferation and aberrant signaling in primary hematopoietic stem/progenitor cells. Blood(2007) 109,3945-52)。一个巨大的障碍是大部分常规抽血设施通常缺乏进行良好控制的刺激实验的能 力。具体的问题包括准备刺激物、将精确量的刺激物递送至血液标本、以及使标本稳定以进 行后续的信号状态或转录物丰度的评估。很多这样的设施缺乏进行常规刺激实验所必需的 器械。目前，活体患者标本被运输至能够进行需要的分析的实验室或者在运输之前进行低 温贮藏。不幸的是，运输包括HIV或其它病原体阳性血液标本在内的一些状态不固定/不 稳定的标本是不希望的，且很多设施也不能进行适当的低温贮藏。此外，已经显示低温贮藏 和活体运输都可导致细胞内信号和基因转录的变化并且产生难以反映血细胞在其自然环 境中的生物学状态的结果。多年来使用标本收集容器进行血液和其他体液的采集和储存。一般地，收集容器 是玻璃或塑料的并且具有弹性塞。可以使用血液收集管，其中将管抽空以将限定量的血液 抽入管中。管中可以容纳有多种添加物以准备用于特定检测的血液标本。一种常见的添加 物是诸如乙二胺四乙酸(EDTA)、缓冲的柠檬酸盐或肝素的抗凝血剂。其他的管容纳使样本 中的核酸稳定的一种或多种固定剂。这些试剂可以处于液态或干燥状态。除非使用者使用 在大部分抽血场所不能获得的液体处理装置，否则现有的标本收集容器不能够执行多步骤 实验。刺激实验需要必须准确计时的至少两个独立的步骤。在第一个步骤，使用抗凝血剂处 理标本并将标本暴露于刺激物。在限定的时间段后，进行第二个步骤，即添加稳定化溶液， 将细胞的蛋白质组和/或基因组特征冻存以用于储存、运输和后续分析。因此，希望具有用于收集和刺激诸如血液标本的生物标本以进行后续分析的装 置，其中刺激实验具有高精度和高一致性。在此公开了用于实现这些以及其他目标的装置、 系统、方法和套装(kit)。

发明内容
在此提供用于收集、刺激、稳定化和分析包括血液标本的生物标本的装置、系统、 方法和套装。为了从对生物标本进行的刺激实验获得生理和临床最相关的结果，生物标本 应当理想地在从患者获取之后立刻用控制剂量的刺激物刺激，在限定的刺激间隔时间后， 使用一种或多种稳定剂将产生的细胞内信号和/或基因转录迅速地冻结于该状态。在此提供一种用于收集、测定和稳定化生物标本的设备。在一些实施方式中，该设 备包括具有限定内室的侧壁、底壁和闭合构件的容器，其中至少一个壁由可弹性变形的材 料制成。在一个方面，内室中布置有隔离件(partition)，隔离件在内室中限定第一室和第
二室，并且将第一室和第二室流体隔开。在一个方面，第一室与闭合构件相关联地定位以接受生物标本。在又一个方面，第 一室包含至少一种刺激剂。刺激剂，或者此处所述的刺激物，可以包括容纳在第一室中并导 致或可能导致生物标本的生物变化的任何药剂，例如生物制剂。在另一个方面，第二室容纳至少一种稳定剂。此处所述的稳定剂可以包括保持生 物标本中的任何生物分子的状态(即阻止状态进一步变化)的任何药剂。在一个方面，通过在不打开容器的内室、不以其他方式损坏内室的流体完整性的 情况下使容器的壁变形能够使得第一室和第二室流体连通。在一些实施方式中，隔离件由一种材料构成，使得通过使壁变形能够损坏所述隔 离件的流体完整性，从而使得所述第一室和所述第二室流体连通。在一些实施方式中，可弹性变形的壁进一步包括在内室内部的诸如支撑环的支 撑结构，使得所述隔离件包括通过可破坏的粘接物(adhesive)固定至所述支撑环的阀瓣 (disc)构件，所述固定的阀瓣构件在所述内室中限定第一室和第二室并且将所述第一室和 所述第二室流体分隔；其中，所述阀瓣构件由与所述壁相比弹性变形能力显著较低的材料 制成，使得所述阀瓣构件能够通过所述壁和所述支撑环或结构的变形而位移，从而使得所 述第一室与所述第二室流体连通。这里还提供用于收集、测定和稳定化生物标本的系统。在一个方面，所述系统包括 如上文所述的收集设备，并额外地包括自动化设备(这里也被称为基站)，自动化设备使得 使用收集设备的一些方案自动化并且可以帮助并行使用多个收集设备以刺激、稳定化和储 存多个生物标本，以及储存并跟踪关于每个应用的信息。在一个方面，自动化设备包括能够 操纵所述收集设备的操纵装置。在第二个方面，自动化设备包括能够使所述收集设备的所 述第一室和第二室流体连通的力施加装置。在第三个方面，自动化设备包括能够调节所述 收集设备的温度的热调节装置。在一些实施方式中，这里提供的系统还包括控制自动化设 备的功能的微电子元件。在一些实施方式中，这里提供的自动化设备还包括计时装置，所述 计时装置与所述操纵装置、所述力施加装置和所述热调节装置中的一种或多种功能连接并 且触发其操作。在所述系统的一些实施方式中，收集设备还包括能够对其进行辨别的独特的标 签。在系统的另一个方面，自动化设备还包括扫描和识别每个带有标签的收集设备的装置， 以及能够储存一个或多个带有独特标签的收集设备的测定参数数据的数据库。这里还提供使用上述设备收集、刺激和稳定化生物标本的方法。在又一个方面，这
8里公开的方法包括提供如上所述的自动化设备，其中该设备自动地执行刺激、稳定化和储 存生物标本的步骤。这里公开的方法的一些实施方式还包括通过蛋白质组或基因组方法分 析标本。也提供用于根据这里说明的方法收集、测定和稳定化生物标本的套装。在阅读下文更详细说明的本发明的细节之后，本发明的这些以及其它目的、优点 和特征对于本领域技术人员将是很清楚的。参考引用本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请这里均通过引用包含于此，如同 特别并单独指出每个单独的出版物、专利和专利申请通过引用包含于此。


本发明的新的特征在后附的权利要求书中特别陈述。参照下述列出使用本发明的 原理的示例性实施方式的具体说明以及附图，将更好地理解本发明的特征和优点。附图中图IA是容器设备(Smart Tube)的一种实施方式的侧视图；图IB是图IA所示的 装置的侧向剖视图；图IC是图IA所示的装置的仰视图；图ID是装置的分解图。图IE是装 置的分解透视图。图IF是安瓿保持插入件的放大俯视图，可以看到它的孔。图IG是安瓿 保持插入件的侧向剖面，可以看到孔的几何形状。图IH是安瓿保持插入件的透视图，可以 看到插入件的顶部。图II是安瓿保持插入件的透视图，可以看到插入件的底部。图2示出设备的原型配置的前视图(图2A)、俯视图(图2B)以及前剖视图(图 2C)。图中还包括原型容器的尺寸(英寸)；图3A是由柔性且弹性的材料制成的管的前视图，图3B是管的剖视图，示出标本收 集室、分隔两个室的硬质塑料阀瓣以及通过可破坏的粘接物与阀瓣连接的整体式支撑环。 图3C是管设计的前视分解图，示出椭圆型的硬质阀瓣；图3D是新的管设计的侧视分解图， 示出椭圆形的硬质阀瓣。图3E是新的管设计的透视图，示出椭圆形的硬质塑料阀瓣。图3F 是将阀瓣移除的剖视透视图，示出整体式支撑环。图3G是将阀瓣移除的剖视透视图，示出 支撑环。图4A示出设备的一种实施方式的透视图，图4B示出将图4A中的设备的顶板、左 侧板和前板以及两个顶部框架构件一起移除的透视图。图4C示出设备的一种实施方式的 前视图；图4D示出设备的一种实施方式的左侧视图；图4E示出设备的一种实施方式的俯 视图。图4F示出将设备的一种实施方式的前侧板移除后的前视图。图4G示出将设备的一 种实施方式的左侧板和前侧板移除后的左侧视图。图5A示出处于打开位置的基站自动化装置的衔铁。图5B示出处于闭合位置的基 站的衔铁。图6A是基站自动化装置的侧视图。图6B中的剖视平面以点划线示出。图6B是 图IA的剖视图。剖视平面在管支撑块处将管横切。粗实线方框示出在图6C中放大的区域。 图6C是图6B中的粗实线标出的区域的放大图，示出管支撑块中的被横切的管。也示出管 与产生轴向旋转的五个连接件(coupling)中的一个相配合。图7A示出含有一个管的基站自动化装置的管支撑块子组件的俯视图。图7B示出 含有一个管的管支撑块子组件的前视图。图7C示出含有一个管的管支撑块子组件的侧视图；图7D示出含有一个管的管支撑块子组件的分解透视图。图8A示出含有一个管的基站自动化装置的管支撑块子组件的分解俯视图。图8B 示出含有一个管的管支撑块子组件的分解左视图。图8C示出含有一个管的管支撑块子组 件的分解仰视图。图9A示出基站自动化装置的管支撑块和液体冷却系统的透视图，为清楚起见其 他组成元件被移除。图9B示出管支撑块和液体冷却系统的透视图，为清楚起见其他组成元 件被移除；且图IOA是适于替代收集设备上的闭合构件的滤盖的侧视图。图IOB是图IOA所示 的装置的侧剖视图，示出与装置(Smart Tube)上的螺纹相接合的螺纹。图IOC是图IOA所 示的装置的透视图，可以看到装置的顶部。图IOD是图IOA所示的装置的俯视图。图IOE 是图IOA所示的装置的仰视图。图IOF是图IOA所示的装置的透视图，可以看到装置的底部。
具体实施例方式在说明本发明之前，应当理解，本发明并不限于所说明的特定的实施方式，而是当 然地可以变化。也应当理解，这里使用的术语仅用于说明特定的实施方式的目的，而不意于 是限制性的，本发明的范围仅由后附的权利要求书限定。在提供数值范围的情况下，应当理解，除非在上下文中另有明确指出，也即具体地 公开了在该范围的上限和下限之间的、以下限的单位的十分之一为间隔的每个中间值。在 所述范围内的任何所述值或中间值之间的更小的范围以及在所述范围内的任何其他所述 值或中间值也包含在本发明的范围内。根据在所述范围内的任何具体排除的限值，这些更 小的范围的上限和下限可以独立地包含或不包含在范围内，且一个或两个限值或没有限值 包括在更小的范围内的每个范围也包括在本发明的范围内。在所述的范围包括限值中的一 个或两个时，将所包括的限值中的一个或两个排除在外的范围也包括在本发明的范围内。除非另有定义，这里使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通 技术人员所普遍理解的含义相同。虽然在本发明的实践和测试中可以使用与这里所说明 的类似或等价的任何方法和材料，现在将说明一些潜在的和优选的方法和材料。这里提到 的所有出版物通过引用包含于此，以公开和说明与所引用的出版物相关联的方法和/或材 料。应当理解，在存在冲突的情况下，用本发明的公开内容取代所引入的出版物的任何公开 内容。必须注意，在这里以及后附的权利要求书中使用时，除非另有明确说明，单数形式 “一”和“该”也包括复数形式。因此，例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞，提及“该 化合物”包括一种或多种化合物以及本领域技术人员已知的等价物，等等。这里讨论的出版物仅用于在本发明的申请日之前的公开内容。这里不应理解为承 认本发明不会基于先发明而居先于这种出版物。此外，提供的公布日可能不同于实际公布 日，可能需要独立证实。这里提供一种用于收集、测定和稳定化生物标本的设备。在一些实施方式中，该 设备包括具有限定内室的侧壁、底壁和闭合构件的容器，其中至少一个壁由可弹性变形的 材料制成。换句话说，内室是由侧壁、底壁和闭合构件的接合构成的。在一些实施方式中，
10侧壁、底壁和闭合构件中的任意一个可以是不同的部件，它们被组装以形成内室，或者替代 地，一个或多个方案可以由诸如但不限于模铸塑料或金属的材料的单个部件制成。在一些 实施方式中，闭合构件是可移除并且可以替换的，以露出内室的开口端。当提到容器具有至少一个由可弹性变形材料制成的壁时，意思是该壁的形状可以 通过足够的压力而变形，例如有意地在容器表面上进行弯曲或压迫，并且将自行恢复基本 相同的形状。在一些实施方式中，可弹性变形的壁是侧壁、底壁中的至少一个。在其他的实施方 式中，可弹性变形的壁也可以是诸如闭合构件(即栓、盖或塞)的可弹性变形元件，其被构 建为具有足够的柔性从而可以在力的作用下变形以破坏隔离件并使得第一室与第二室流 体连通。为此，设备中在设备外部具有表面的任何元件可以同样地被构建为允许变形。在其它的实施方式中，可变形的壁或元件可以是非可弹性变形的，即在施加力以 破坏隔离件之后不能保持其原始的形状。在这种实施方式中，仍然能够保持壁或元件的流 体完整性。在本发明的一种实施方式中，设备帮助收集诸如全血的生物标本、使用一种或多 种刺激剂或刺激物刺激所容纳的标本、然后稳定化标本以进行储存和后续分析。这可以允 许以高精度和一致性分析血细胞对所施加的刺激的应答，即使是在远程测试地点。血液可 以被添加到装置中。替代地，血液可以被直接抽取到装置中，该装置中可以含有抗凝血剂和 被设计为诱导血细胞应答的一种或多种药剂。该药剂可以是刺激物。在限定的时间段后，装 置可以从第二室或安瓿中释放稳定化溶液，稳定化溶液能够稳定化血细胞的细胞内状态， 包括由于暴露于刺激物而发生的变化，包括细胞蛋白质的磷酸化和/或其他翻译后修饰和 /或mRNA转录物丰度。装置的一种最终用途可以是对人类患者进行诊断试验以改进其医学治疗(例如 白血病患者分类、指导狼疮患者的治疗等)。为了正确地进行这些试验，使用者必须小心地 记录从血液被抽取到或手动添加到装置中开始经过的时间，并且在经过适当的时间后启动 装置。适当的时间量可以由目标试验的诊断方案限定(例如，在发现对于白血病患者和狼 疮患者具有价值的试验的情况下是15分钟)。在很多抽血地点，例如医院和诊所，工作人员 的工作流程限制使得他们难以准确地计时和启动装置。为了减少可能对装置的诊断应用具 有负面影响的操作误差并增加操作的方便性，可以使用一种自动化设备(这里也被称为基 站)来使得计时和装置启动自动化并提供热控制和样本混合。本发明的一种实施方式是一种一次性装置或管，用于在多室收集装置中收集、刺 激、稳定化和储存生物标本。本发明还包括一种系统，该系统包括能够使得一次性装置的使 用自动化的设备，下面将详细说明。该设备还可以进一步地确保正确的计时、样本混合和热 控制。在本发明的一种实施方式中，抽血设备本身能够执行两个独立的步骤。在第一个步 骤中，血液可以被抽入管的第一室或刺激室，在其中血液可以暴露于抗凝血剂和/或一种 或多种刺激物。在一个方面，第一室与闭合构件相关联地定位以接收生物标本。换句话说， 闭合构件的存在允许第一室相对于设备外部的流体完整性。在一些实施方式中，闭合构件 是栓，例如盖、塞或可穿刺的自密封塞、或其他可移除并且可替换的元件，该元件将第一室 通向外部的开口密封，通过该开口，材料可以通过其他方式被引入或移出该设备。在又一个方面，第一室含有至少一种刺激剂。刺激剂，或在此称为刺激物，可以包括放置在第一室中的导致或可能导致生物标本产生生物变化的任何药剂，例如生物药剂。 在一些实施方式中，生物变化的机制是已知的。在一些实施方式中，生物变化的机制是未知 的。在一些实施方式中，刺激剂是生物活性分子或化合物，其被怀疑或已知在生物标本中的 细胞的表面上具有特定的结合配偶体(例如受体)，或在细胞内部具有细胞内信号分子，与 该活性分子或化合物的结合在细胞中产生生物效应。在一些实施方式中，与刺激剂接触可 以产生细胞中基因表达的变化。在一些实施方式中，刺激剂可以通过作为类似物起作用，例 如通过模拟细胞中的受体或其他结合配偶体的配体来产生生物效应。在一些实施方式中， 暴露于刺激剂导致或可能导致生物标本中细胞的细胞内变化。在一些实施方式中，暴露于 刺激剂导致或有可能导致生物标本中细胞的细胞表面分子变化。在一些实施方式中，暴露 于刺激剂导致或可能导致生物标本中细胞的细胞内变化。刺激剂包括但不限于小分子； 抗体及其片段；多肽；蛋白质；受体配体；多核苷酸；有机化合物；脂多糖；细胞因子；类固 醇；细胞；包括例如shRNA、siRNA、脂质体中的病毒或遗传材料在内的遗传制剂；包括盐在 内的无机分子；以及本领域已知的其他刺激剂。在一些实施方式中，刺激剂可以排除一些物质，这些物质存在于第一室中以保持 等分析和/或操作的生物标本的机械顺从性。这些物质可以包括但不限于抗凝剂、消化、变 性或离解包括胶原或其他细胞外和结构支持材料在内的细胞外基质的化合物或酶，以及消 化生物标本中可以发现的核酸的DNase或其他酶。在这些物质存在于第一室中的实施方式 中，刺激剂可以排除这些物质，即是除这些物质以外的物质，替代地是导致生物标本中产生 特定生物变化的额外的物质，这些变化可以包括但不限于基因表达变化、细胞表面分子丰 度变化、生存力变化、分子进出细胞变化等。这里提到的稳定剂可以包括保持生物标本中任何生物分子的状态，即阻止状态的 任何进一步改变的任何药剂。这些稳定剂可以包括能够有效地稳定化DNA和包括mRNA、 tRNA、微RNA、siRNA和cRNA在内的RNA的药剂。用于稳定化和保持核酸和/或防止基因 诱导的合适的稳定化药剂的例子包括阳离子化合物、去污剂、离液盐、核糖核酸酶抑制剂、 螯合剂等及其混合物。用于包括诸如细胞表面分子的抗原的蛋白质的稳定剂是本领域已知 的，包括但不限于杀死细胞但是将其蛋白质形态和/或核酸保持更长时间段的化合物。稳 定剂可以包括例如诸如多聚甲醛的交联固定剂或诸如乙醇的沉淀剂。稳定剂可以通过在细 胞分子之间形成共价键或通过将一些细胞内分子沉淀或通过其它方法来起作用。在一些实 施方式中，稳定剂包括细胞裂解缓冲液。细胞透化缓冲液也是本领域已知的，并且可以包含 使细胞膜透化从而允许探针和染料穿过膜的去污剂。在细胞裂解缓冲液中使用的去污剂的 例子包括但不限于TweeruTriton X-100、皂草苷、NP-40等。针对给定的最终用途调整细胞 裂解和透化剂的浓度。当以过低的浓度存在时，细胞裂解和透化可能不能达到最佳。在过 高的浓度下，可能出现不希望的细胞破坏。可以进行常规的根据经验的步骤来确定在每种 情况下优选的路线。在一些实施方式中，稳定剂在阻止细胞过程的同时保持细胞表面抗原。通过稳定 剂阻止的细胞过程包括例如细胞内信号传导，蛋白质转运、蛋白质修饰、蛋白质合成、蛋白 质降解、核酸合成、核酸降解、胞吞作用、分泌、磷酸化、脱磷酸化、泛素化和甲基化。在一个方面，可以在不打开容器的内室、不以其他方式损坏内室的流体完整性的 情况下通过使壁变形来使第一室和第二室处于流体连通。换句话说，通过手动或以其它机械装置施加于底壁或侧壁的力足以使壁变形，导致原来由隔离件分隔开的第一室和第二室 处于流体连接，使得这些室中的容纳物可以混合。第一室和第二室的这种流体连接是隔离 件的流体完整性被破坏的结果。在一些实施方式中，隔离件由一种材料制成，使得通过使室壁变形能够损坏所述 隔离件的流体完整性以使得第一室和第二室流体连通。在一些实施方式中，隔离件能够被 这样破坏的能力是由于其构成材料导致的。例如，隔离件可以由这样一种材料制成，该材料 通过由于外部施加的力作用而与变形的壁足够有力的接触从而能够整体地或部分地被破 坏。这些材料的例子包括但不限于塑料或玻璃，例如硼硅酸盐玻璃。在一些实施方式中，设 备还包括网或孔，能够在将损坏的隔离件的碎片保持在内室中的同时通过所述网或孔将液 体加入或移出内室。这里所说的孔是指具有网状边缘的开口，使得在阻止破坏的或破损的 隔离件的碎片经过开口的同时通过边缘几何形状帮助流体流过开口。在一些实施方式中，隔离件是可变形的或可弹性变形的，使得侧壁或底壁的变形 导致隔离件的物理构造允许第一室和第二室之间流体连通。在一些实施方式中，隔离件是 可溶解的。在又一些实施方式中，隔离件仅在一定的温度下可溶解。例如，这样构造的隔离 件可以在室温下不可溶而当加热到诸如37度、42度或更高的不同温度下时变得可溶。在一些实施方式中，可弹性变形的壁还包括在内室内部的支撑环，其中隔离件包 括通过可破坏的粘接物固定至支撑环的阀瓣构件，固定的阀瓣构件在内室中限定第一室和 第二室并且将第一室和第二室流体分隔；其中阀瓣构件由与所述壁相比弹性变形能力明显 较低的材料制成，使得阀瓣构件能够通过壁和支撑环的变形而位移，从而使得第一室与第 二室流体连通。在一些实施方式中，支撑环是整体式支撑环，使得环从壁突出并且由与壁相 同的材料制成。阀瓣构件由与所述壁相比弹性变形能力明显较低的材料制成，意味着通过 手动或机械装置使壁变形，在由于作用于粘接物的剪切力而破坏将阀瓣固定到支撑环上的 粘接物之前，不会使阀瓣变形。在一些实施方式中，支撑环相对于设备的长轴不成直角。在 一些实施方式中，该角度是使得由于侧壁变形而导致的作用于可破坏的粘接物上的剪切力 达到最大的角度，例如大约45度。可破坏的粘接物是指具有已知的剪切强度的粘接物，使 得在受到预定的剪切力的作用下粘接物会破裂、破坏或通过其它方式损坏从而失去粘接功 能。本领域技术人员能够容易地想到用于此目的的适合的粘接物。在又一些其它的实施方式中，阀瓣在没有支撑环的情况下固定至壁上并且依靠可 破坏的粘接物保持固定，从而起隔离件的作用。在其它的实施方式中，任何其它的固体构造、形状或膜可以取代阀瓣设置在内室 中，形成密封以限定第一室和第二室并将第一室和第二室流体分隔。然后该固体构造可以 如上文所讨论地通过容器的壁的变形被移出、破坏或损坏，使得第一室和第二室处于流体 连通。这样，在预定的时间段后，标本可以在第二步骤中通过与来自设备的第二室或安 瓿中的稳定化溶液混合从而被稳定化。稳定化标本使得能够储存标本并对其进行后续分 析。这两个步骤可以在管内执行并且不需要移除塞或使用除了抽血或通过其它方式收集 感兴趣的标本所需的标准针头和管(美国专利2，460，64)之外的任何材料。由此该设备 (Smart Tube)使得能够在几乎任何抽血场所进行刺激实验。本发明的一个方面是提供一种装置，该装置用于从患者收集生物标本，特别是全血，置于包含抗凝血剂和一种或多种刺激物的室中。血液标本可以是全血。在一些实施方式 中，血液标本可以是血浆。血液标本可以被引入管中。替代地，血液可以被直接抽入管中。 另外，管可以被预先抽至显著低于大气压的压强并且具有自密封橡胶塞。使用标准抽血管 可以将血液直接从患者抽入管中，在管中血液与抗凝血剂和刺激物接触。该实施方式还具 有填充有稳定剂的可破坏的安瓿，使得在希望的时间稳定剂可以被释放入标本中并且保持 希望的分析物。因此，该实施方式是血液收集、刺激、稳定化和储存单元。刺激物可以是对于标本具有已知的或未知的生物作用的药剂。在一定时间间隔 后，装置可以将包含一种或多种稳定化添加剂的一定体积的流体引入前述的室中，以保持 其中所含的患者标本的细胞内信号和/或转录谱。时间间隔可以由用户定义。稳定剂的浓 度可足以阻止细胞内信号传导，包括蛋白质的翻译后修饰如磷酸化和/或基因转录。稳定 剂也可以防止感兴趣的分析物降解和/或将干扰感兴趣的分析物的检测的修饰。感兴趣的 分析物包括但不限于蛋白质的翻译后修饰，包括特定氨基酸上诸如磷酸的一些化学基团的 添加或去除。感兴趣的分析物也包括但不限于DNA序列、信使RNA序列以及信使RNA转录 物丰度。一种或多种药剂可以添加至稳定化流体以裂解标本中的红细胞或帮助接下来的红 细胞裂解。在本发明的一些实施方式中，收集室可以在充满标本之前被抽至低于大气压，从 而抽入预定体积的生物标本。对于血液标本来说，预定体积的生物标本可能是特别重要的。 收集室可以具有足以防止标本凝结的量的干燥或液体形式的抗凝剂。通过一种用于收集、刺激和稳定化生物标本的设备可以实现本发明的目的。在一 些实施方式中，该设备为管。管可以被设计为收集生物标本或样本，包括但不限于血液、滑 液、脊髓液、脑脊液、羊水或活检组织。管的主体可以包括由限定内部容器的侧壁、底壁和开 放端部以及闭合该开放端部的闭合构件或塞构成的容器。容器可以由任何适合的材料制 成，包括但不限于聚乙烯、低密度聚乙烯、线性低密度聚乙烯、聚丙烯、低密度聚丙烯、尼龙、 聚苯乙烯或其组合。内部容器可以是刺激室。在一些实施方式中，闭合构件可以是由聚乙 烯、聚丙烯、聚苯乙烯或任何其它适合的材料或其组合制成的带有螺纹的盖。在一些实施方式中，第二室或安瓿位于容器内。在一些实施方式中，第二室邻近 容器的壁定位。第二室可以预先充有有效量的稳定化液体，其有效量足以稳定化并保持生 物标本使得能够保持细胞蛋白质的翻译后修饰。在一些实施方式中，稳定化液体可以保持 蛋白质的磷酸化和/或阻止其合成和降解。在生物标本是全血的情况下可能希望裂解红细 胞，而在稳定化液体的配方的一些实施方式中，稳定化液体可以防止诸如白细胞的其他类 型血细胞类型裂解。稳定化液体可以被保持与标本隔离，直至抽血后一段时间后，稳定化液 体可以被引入标本。然后稳定化液体可以稳定化并保持生物标本。稳定化液体保持与样本 隔离的时间长度可以由用户限定。在一个方面，容器的内室中布置有隔离件，隔离件在内室中限定第一室和第二室 并且将第一室和第二室流体分隔。这样，隔离件形成将第一室和第二室隔开并且阻止第一 室和第二室中的任何容纳物混合的一个或多个壁。在一些实施方式中，隔离件与侧壁、底壁和/或闭合构件共享结构构件，即隔离件 部分或整体地与构成内室的其他构件中的一个或多个成为一体。在一些实施方式中，隔离 件不与侧壁、底壁或闭合构件中的任何一个共享结构构件，即第二室仅由隔离件限定。在这
14种实施方式中，隔离件的构造在这里被称为安瓿。在本发明的一些实施方式中，稳定化液体可以容纳在被保持在刺激室中的密封的 可破坏安瓿或其它适合的容器中。当管的主体被手动或机械握持且弯曲时，稳定化液体可 以被释放进入标本中。当管弯曲或激活时，刺激室中的不可弯曲的安瓿被压碎。然后稳定 剂可以被释放进入标本中。在一些实施方式中，可压碎的安瓿可以由薄壁玻璃、塑料、纤维或其它适合的材料 或其组合制成。然后可以通过晃动或通过其它方式摇动或振动管来进行稳定化液体与标 本的混合。在一些实施方式中，稳定化液体可以通过管的机械旋转与标本混合。管可以沿 其长轴或沿其短轴旋转。在一些实施方式中，可以通过磁力搅拌棒或其它合适的组件在设 备中在外部磁场或类似力的作用下运动来实现稳定化液体与标本的混合。在一些实施方式 中，通过将安瓿包裹在闭合的网套或袋中以防止安瓿的碎片与患者标本混合。网套或袋可 以由任何适合的生物相容性材料制成，包括但不限于聚丙烯、尼龙或其组合。替代地，安瓿 可以涂覆有防止破坏的安瓿的碎片释放到标本中的任何适合的生物相容性材料，包括但不 限于硅橡胶、聚丙烯或其组合。另外，也可以通过控制碎片破碎的大小来防止碎片与标本 的混合。在一些实施方式中，碎片可以被束缚在一起使得它们不干扰标本的后续处理。安 瓿可以被包埋在硅橡胶或类似化合物中的线或纤维包裹、涂覆或表面处理，或者涂覆有纤 维_树脂混合物以防止安瓿碎片释放到血液中，或控制碎片的形状使得他们不干扰标本的 后续处理。在替代的实施方式中，闭合构件是由合成橡胶或本领域已知的类似材料制成的 自密封塞。在本发明的一种替代的实施方式中，稳定化液体可以通过电、机械或化学方法被 引入刺激室中。这些方法包括但不限于自动化地将管的主体机械弯曲以压坏、破坏或移出 诸如安瓿或阀瓣的隔离件。然后稳定化液体可以通过包括旋转、晃动、振动等自动化机械搅 动与生物标本混合。这里也提供了用于收集、测定和稳定化生物标本的系统。在一个方面，系统包括如 上所述的收集设备，以及额外地包括自动化设备，这里也称为基站，自动化设备使得使用收 集设备的一些方案自动化并且可以帮助并行地使用多个收集设备以刺激、稳定化和储存多 个生物标本，以及储存并跟踪与每个应用相关的信息。在一个方面，自动化设备包括能够通 过移动、晃动、旋转、超声振动或亚声振动收集设备或其顺序组合来操纵收集设备的操纵装 置。在第二个方面，自动化设备包括能够使收集设备的第一室和第二室流体连通的力 施加装置。在一些实施方式中，力施加装置对收集设备的可弹性变形的壁施加压力的作用 以使得隔离件破裂。这可以通过包括击打、弯曲、压迫、扭转容器以如上所述地破坏其中的 隔离件的任何适合的物理动作来完成。在第三个方面，自动化设备包括能够调节收集设备的温度的热调节装置。可以使 用本领域已知的任何调节温度的技术。在一些实施方式中，这里提供的系统还包括控制自动化设备的功能的微电子元 件。微电子元件包括当功能地连接至自动化设备的元件并且提供有适当的指令组时能够控 制并协调这些元件的动作的任何适合的计算元件。本领域技术人员将理解，微处理器、微控 制器、嵌入控制器、嵌入处理器等能够用于这里公开的系统的该方面。
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在一些实施方式中，自动化设备还包括能够将系统的状态报告至使用者的用户界 面。用户界面可以包括发光二极管(LED)、LCD或其它类型的显示器。在一些实施方式中，这里提供的自动化设备还包括计时装置，计时装置与操纵装 置、力施加装置和热调节装置中的一个或多个功能地连接并且被布置为触发其操作。计时 装置也功能地连接至微电子元件并且能够被微电子元件控制以帮助自动化设备的多种元 件定时工作这样，基站能够使得操作管的一些步骤自动化。基站能够在刺激过程中将含有标 本的管保持在生理温度(37摄氏度)下。然后基站能够对管的侧面施加力以破坏其中的安 瓿。然后设备可以旋转管以将稳定剂与标本混合，在37摄氏度下温育管5到10分钟，然后 将管的温度降低至临时储存温度(5到8摄氏度)。然后管可以被转移至-80摄氏度以进行 更长期的储存或转移至干冰以进行运输。在一些实施方式中，可以手动地转移管。在系统的一些实施方式中，收集设备还包括使得能够辨别收集设备的独特的标 签。用于为每个设备提供独特的标签的符号系统包括如本领域已知的无线射频识别(RFID) 标签、线性条码、矩阵或二维条码、微点图案等。在系统的另一个方面，自动化设备还包括扫 描并辨别每个带有标签的收集设备的装置以及能够储存一个或多个带有独特标签的收集 设备的测定参数数据的数据库。在一些实施方式中，自动化设备还包括用于将测定参数数 据传递至远程位置的装置。在一些实施方式中，远程位置是能够执行储存、分析以及向使用 者显示数据中的一种或多种操作的外部处理系统。在一些实施方式中，管可以具有能够由基站读取的嵌入无线射频识别(RFID) 标签。基站可以额外地保持实验数据的数据库链接至每个RFID标签。在一些实施方式 中，基站可以保持跟踪当管进入基站以及被移出基站时实验如实执行的程度(刺激时 间、整个热曲线、混合效率测量、基站电子器件是否检测到可能表示不恰当表现的不正常 电现象)。在一些实施方式中，可以通过使外部处理系统与基站连接来读取数据库。在 刺激和稳定化之后可以对标本执行多种不同的分析。在一些实施方式中所感兴趣的是 在下列文献中所说明的分析方案名称为“Methods and compositions for detecting receptor-ligandinteractions in single cell” 的美国专利公开 No. 20070196870 ；名 禾尔为“Use of Bayesian network for modeling cell signaling system，，的美国专利公 Jf No. 20070009923"Methods and compositions fordetecting the activation state of multiple proteins in single cells” 的美国专利公开 No. 20060073474 ; 以及名称为“Methods and compositions forrisk stratification” 的美国专利公开 No. 20050112700，上述文献的公开内容整体通过引用包含于此。替代地，可以通过将数据库 通过Ethernet或其他到远程服务器的连接上载到网络使得能够读取数据库。I.装置和组合物这里提供一种装置，其适于在采集时对患者标本(特别是全血)进行刺激，然后在 收集点在快速执行的第二步骤中对标本进行稳定化。图1示出了样本收集管或容器(即 Smart Tube)的一种实施方式的几个不同的视图。装置的主体106可以由具有弯曲弹性并 且可弹性变形的材料制成。本领域已知很多这样的材料以及运用它们的方法，包括注塑线 性低密度聚乙烯和其他类似的耐久且可弯曲的塑料、纤维复合物、金属组合物等。安瓿的可 压碎的薄玻璃壁105限定安瓿，并且将室102和103流体分开，直至作用于装置的柔性壁106的外力以足够的力压迫可压碎的壁105以将可压碎的壁105压碎。然后，安瓿103中的 容纳物可以被释放进入室102中。在一些实施方式中，可以通过移液管或类似的液体处理 装置将1毫升患者标本加入室102中，然后用与装置上的螺纹107相配合的螺纹盖101将室 102密封地关闭。装置被设计为具有圆筒形区域108，圆筒形区域108可以与自动化设备的 互补的连接器例如与基站相配合。0形环可以适配在槽104中并且其直径可以略大于该连 接器的内径，且当圆筒形区域108插入基站的连接器中时0形环略微变形。该装置也可以 具有第二个槽109以使得基站的连接器中的保持夹可以将装置固定在连接器中。槽104中 的0形环与连接器之间的静摩擦系数可以允许连接器旋转使得装置沿着其长轴旋转(轴向 旋转)。这可以帮助室102中的容纳物的混合。分别位于装置远端和近端处的逐渐变细的 六角形面110和111可以与自动化设备上的互补的表面相匹配以向装置施加更大的旋转力 矩以保证更好地控制轴向旋转。安装在室102顶部的由线性低密度聚乙烯(LLDPE)或类似 材料制成的柔性安瓿保持插入件112防止当倾泻装置的容纳物时将被压碎的安瓿的大碎 片倒出。该插入件112也防止完整的安瓿被意外地或有意地从室102中移出，但是插入件 指向下方的柔性凸缘允许必要时小的移液器进入室102。位于装置的底部101的室113在 图ID中示出。室113可以改善装置的可制造性并且提供用于放置通过粘合剂或其他方式 添加的RFID标签的室。在一些实施方式中，可以由空心针头穿刺闭合构件来将生物标本抽 入刺激室102中，该空心针头连接至一次性抽血管，该一次性抽血管通过柔性管连接至另 一个已经插入患者静脉中的空心针头。可以将顶部的室抽至一定压力，引导预定体积(约 Iml至5ml)的血液或流体被抽入。图IE示出该装置的分解图。室102可以接收生物标本 以及保持安瓿。样本稳定化安瓿103可以充有稳定化溶液，稳定化溶液的量使得容纳在室102中 的受刺激的生物样本稳定化。刺激剂以有效刺激容纳在该室中的生物样本的量设置在室 102 中。图2示出该设备的初始的原型构造的前视图(图2A)、俯视图(图2B)和前剖视图 (图2C)。可以看到容器的柔性主体以及容纳在内部的安瓿。原型容器的尺寸单位为毫米。图3为具有阀瓣隔离件方案的管的一种替代的实施方式。图3A示出由柔性并具 有弹力的低线性低密度聚乙烯(或类似材料)制成的管的前视图。图3B为管的剖视图， 示出标本收集室301 ；容纳稳定化溶液的室302 ；将室301与室302流体分离的硬质塑料阀 瓣303 ；以及模制成为管的主体的一部分并且通过可解除的粘接物连接至板303的支撑环 304。图3C为新的管设计的前视分解图，示出将室301与室302流体分离的椭圆形硬质塑 料阀瓣305。图3D为新的管设计的侧视分解图，示出将室301与室302流体分离的椭圆形 硬质塑料阀瓣305。图3E为新的管设计的透视图，示出椭圆形硬质塑料阀瓣306。图3F是 示出支撑环307的剖视透视图。图3G是示出支撑环307的剖视透视图。由隔离件限定或排除在外的第一室的内侧，刺激室可以包含足够的冻干硫酸肝素 以防止血液标本凝结。肝素可以预先添加入管内并且如本领域已知地被干燥或冻干。感兴 趣的刺激物也可以以干燥的或冻干的形式存在于顶部室中。刺激物可以在收集生物标本之 前加入管中，且刺激物可以被冻干。很多化合物是候选的刺激物，包括小分子和较大的生物 分子，例如细胞因子、抗体和类固醇。刺激物的一个例子是100纳克重组人干扰素α，一种 已知具有医疗重要性的免疫调节细胞因子。其他的用作刺激物的感兴趣的免疫调节细胞因子包括但不限于 IL-I 和 IL-2 (Karupiah 等· (1990) J. Immunology 144 :290_298，Weber 等· (1987) J. Exp. Med. 166 :1716_1733，Gansbacher 等· (1990) J. Exp. Med. 172 :1217_1224， 和美国专利 No. 4，738，927) ；IL-3 和 IL-4(Tepper 等· (1989)Cell 57 :503_512，Golumbek 等· (1991)Science254 :713_716，以及美国专利 No. 5，017，691) ；IL-5 和 IL-6 (Brakenhof 等· (1987) J. Immunol. 139 :4116-4121，以及国际公开 No. W090/06370) ；IL_7(美国专利 NO. 4，965，195) ；IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12 和 IL-13(Cytokine Bulletin, Summer 1994) ；IL-14 和 IL-15 ； α 干扰素(Pinter 等· (1991)Drugs 42 :749_765，美国专利 Nos. 4，892，743 和 4，966，843，国际公开 No. WO 85/02862，Nagata 等.(1980) Nature 284 316-320，Familletti 等.(1981)Methods in Εηζ· 78 :387_394，Twu 等.(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :2046_2050，以及 Faktor 等.(1990)Oncogene 5 :867_872) ； β 干扰素 (Seif 等.(1991)J. Virol. 65 :664_671) ； γ 干扰素(Radford 等.(1991)The American Society ofHepatology 29982015, Watanabe 等.(1989)Proc. Natl. Acad.Sci. USA86 9456-9460，Gansbacher 等.(1990) Cancer Research 50 :7820_7825，Maio 等.(1989) Can. Immunol. Immunother. 30 34-42,以及美国专利 Nos. 4，762，791 和 4，727，138) ；G-CSF (美 国专禾Ij Nos. 4，999，291和4，810，643)；粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)(国际公开 No. WO 85/04188)。免疫调节性化合物也可以包括作为Toll样受体(TLR)的激动剂的化合物。“TLR” 通常指任何生物物种的任何Toll样受体。PCT公开No. WO 98/50547中公开了几种人TLR。 人 TLR 的激动剂也在下述文献中说明Ulevich R, (2004)Nature Reviews Immunology， 4512-520 的表 1；Akira 禾口 Takeda， (2004)Nature Reviews Immunology, 4 :512_520 的 ^ 1 ；Medzhitov R, (2001)Nature Reviews Immunology, 1 345-145 ； L^l ^ PCT ^ JF WO 03/031573和WO 03/103586。上述文献的公开内容均通过引用包含于此。诸如α干扰素的很多干燥的或冻干的化合物特别易溶于血液，且在装置的当前 配置中使用的量在接触血液标本时会立刻溶解。可以添加额外的成分以改进刺激物的干燥 和/或在患者标本中的溶解性，如血清白蛋白和/或右旋糖。刺激剂和稳定剂可以在装置中 以不同的形式或制剂提供。作为说明，药剂可以与传统的载体和赋形剂(即媒介物)混合， 并且以粉末、水溶液、分散液、珠分散液(例如，当诸如刺激物和/或抗凝血剂的药剂被干燥 为珠和/或浸透可溶性珠基质(直径为1微米或更小的珠在高度可溶的基质中干燥)以加 强某些刺激剂和/或抗凝血剂的可溶性和分散一致性时)、凝胶、泡沫、片剂、胶囊、酏剂、悬 浮液、糖浆、薄片等形式使用。流体或液体组合物通常由活性剂在含有悬浮剂、防腐剂、表面 活性剂、润湿剂或着色剂的适当的液体载体中的悬浮液、分散液或溶液组成，适当的液体载 体例如是水、乙醇、甘油、山梨醇、非水溶剂如聚乙二醇、油或水。替代地，可以由可重配的粉 末制备液体制剂。例如，包含活性化合物和悬浮剂的粉末可以用水重配以形成悬浮液或分 散液。因此，存在多种多样的本发明的适合的刺激和稳定化制剂。在本装置中，在第一室中提供有效量的刺激剂，在第二室中提供有效量的稳定剂。 “有效量”是指化合物的量足以提供希望的效用。例如，对于细胞内信号或基因转录，刺激 剂的有效量是引起或被校正为引起与对照相比有用的响应(例如磷酸化蛋白质含量的增 加或下降、特定蛋白质的翻译后修饰的增加和下降、基因的mRNA丰度的增加等)的量。也 可以以这种方式确定稳定剂的有效量，例如通过确定样本中希望的种类与对照相比的稳定
18性。这样，本领域普通技术人员可以仅使用常规的实验来确定适当的有效量。然后，使用者可以将管颠倒数次以保证抗凝血剂和刺激物与患者标本适当混合。 将管颠倒以保证适当混合是用于现有的抽血装置的常用做法。在一种实施方式中，15分钟 或其他希望的刺激时间之后，使用者双手握持管并将管弯曲大约45度以将容纳稳定化液 体的安瓿103破坏，将稳定化液体释放进入患者标本中。管的聚乙烯主体可以是足够柔性 并耐久的以承受弯曲而不会破坏，并且已经在需要破坏内部安瓿的其他应用中使用，包括 Cyalume Lightstick 。然后使用者可以将管颠倒10次以保证稳定化液体与患者标本适当 混合ο在另一个方面，第二室容纳至少一种稳定剂。这里提到的稳定剂可以包括保持生 物标本的任何生物分子的状态(即阻止其状态的任何变化)的任何药剂。这种变化可以 包括但不限于基因表达；蛋白质表达；核酸丰度，例如转录物丰度；核酸降解；蛋白质或多 肽丰度/降解；对多核苷酸的转录后修饰，如聚腺苷酸化；与核酸的剪接体相关；诸如Jak/ STAT途径信号的任何细胞内信号；核酸发夹环和二级结构形成；多肽的翻译后修饰，例如 但不限于磷酸化、甲基化、泛素化、SUMO化、亚铁血红素或辅基协调；蛋白质构象；蛋白质结 合状态和本领域已知的其他变化。用于稳定化并保持核酸和/或防止基因诱导的适合的稳 定剂的例子包括阳离子化合物、去污剂、离液盐、核糖核酸酶抑制剂、螯合剂及其混合物。适 合的核糖核酸酶抑制剂是胎盘RNAse抑制蛋白。离液盐的例子包括尿素、甲醛、异硫氰酸 胍、盐酸胍、甲酰胺、二甲亚砜、乙二醇和四氟乙酸酯。稳定剂也可以包括用于处理生物标本 的其他成分。例如，可以包括透化或裂解病毒和细胞的化学试剂。其他的成分包括蛋白酶、 酚、酚/氯仿混合物、醇、醛、酮和有机酸。去污剂可以是阴离子去污剂、阳离子去污剂或非 离子去污剂。阴离子去污剂可以是例如十二烷基硫酸钠。非离子去污剂可以是例如环氧 乙烷缩合物，例如多元醇的乙氧基化脂肪酸酯。一种特别感兴趣的非离子去污剂是Sigma Chemical Co.的商品名为TWEEN 20的聚乙二醇失水山梨醇单月桂酸酯。可以包含足以透 化或裂解细胞以形成含有核酸的微囊和其他复合物的有效量的去污剂。在这里公开的装置和方法的一些实施方式中，稳定化缓冲液可以包含固定剂和/ 或沉淀剂。固定剂和沉淀剂是本领域已知的并且技术人员可以根据希望的试验容易地选择 固定剂和沉淀剂。交联固定剂包括但不限于甲醛、戊二醛、多聚甲醛、乙基二甲基_氨基丙 基-碳二亚胺和二甲基-silserimidate。沉淀剂包括乙醇、乙酸、甲醇、丙酮及其组合。也 可以包括冰乙酸作为固定剂。根据感兴趣的结合事件，固定剂通常以不损坏细胞核酸或蛋 白质结合至探针的能力的浓度使用。其他有用的固定剂对于本领域技术人员来说也是很清 楚的。在一些实施方式中，在固定化缓冲液中甲醛的浓度至少为约0. 1 %，有时为约0. 5%， 有时为约0.7%，经常为约1%，常常为约3%，经常为约4%，可达到5%，高达10%。用于通过微阵列、聚合酶链反应或其他方法对RNA转录的丰度进行后续分析的 RNA稳定化有多种可用的化学试剂，可以分为裂解样本中所有的细胞的化学试剂以及不 裂解白细胞而使核酸稳定化的化学试剂。第一类的例子是Trizol以及其他含有酚和/或 其他有机溶剂的缓冲液。第二类化学试剂的例子是RNALater和其他包含非常高浓度的盐 (包括卤化盐，例如氯化铵)但是不包含有机溶剂的缓冲液。本领域技术人员可以确定这些 缓冲液及相当的制剂。对于希望探针与细胞内核酸杂交的分析，试剂溶液一般可以包含离液变性剂、缓冲液、成孔剂、杂交稳定剂。离液变性剂(Robinson, D. W.和Grant，Μ. Ε. (1966) J.Biol. Chem. 241 4030 ；Hamaguchi，K.禾口 Geiduscheck，Ε. P. (1962) J. Am. Chem. Soc. 84 1329)包 括甲酰胺、尿素、硫氰酸盐、胍、三氯乙酸盐、四甲基胺、高氯酸盐和碘化钠。可以使用使PH 值至少保持在7. 0到8. 0之间的任何缓冲液。成孔剂是例如去污剂，如Bri j35、Brij 58、 十二烷基硫酸钠、CHAPSTM TRIT0NX-100TM。根据目标生物聚合物的位置，选择成孔剂以帮 助探针通过质膜、核膜或细胞区室结构进入。例如，0.05%的Briji 35或0. 的TRITON X-100 将允许探针通过质膜进入但是不允许通过核膜进入。替代地，去氧胆酸钠将允许探 针经过核膜。因此，为了限制与细胞质生物聚合物目标的结合，避免使用核膜成孔剂。当目 标生物聚合物处于细胞质中时，这些选择性的亚细胞定位通过消除探针与互补的核序列或 抗原的结合有助于分析的特异性和灵敏度。除了去污剂以外的试剂，例如固定剂，也可以起 这种作用。通常基于对处理的样本在刺激/稳定后进行蛋白质组分析或基因组分析的偏好 来选择稳定剂。例如，为用于诊断或用于研究目的建立刺激分析的兴趣大致分为希望集中于样本 在蛋白质水平的生物特性(蛋白质组学细胞内流式细胞术、蛋白质印迹等)以及希望集中 于样本在核酸水平的生物特性(基因组学微阵列、PCR等)。本发明的装置和方法可以用 于满足这两种要求。具体来说，本发明的装置和方法可以使用不同的稳定化溶液，例如使蛋 白质和细胞内信号稳定化的溶液，或者使核酸种类稳定化的溶液。对于蛋白质组的应用，稳 定剂是使得蛋白质和细胞内信号稳定化的稳定剂。特别感兴趣的是裂解红细胞但不裂解白 细胞并且保持细胞表面抗原同时抑制选自蛋白质合成、蛋白质降解、RNA合成、DNA合成、核 酸降解、胞吞作用、分泌、磷酸化、脱磷酸化、泛素化、甲基化及其组合中的至少一种细胞过 程的稳定剂。在一些实施方式中感兴趣的是保持适于允许单细胞分选如荧光激活细胞分选 (FACS)或流式细胞术的细胞表面的稳定剂。感兴趣的是通过流式细胞术或FACS分析标本 的细胞内磷酸化特异性抗体染色。FACS技术根据细胞的物理性质和/或它们的特定蛋白质 或糖蛋白表位和代谢物的相对表达水平，促进单细胞多参数分析和分选。对感兴趣的蛋白 质上的独特磷酸化表位具有特异性的荧光抗体的使用进一步扩展了 FACS分析的范围。这 种新的应用被称为“磷酸-FACS(phospho-FACS)”，并已经成为用于描述细胞内磷酸化级联 的精选的工具。这样，磷酸-FACS对来自血液或外周的细胞亚组的应用，不管是经常的或偶 尔的，帮助病理学生物标记的发现和治疗创新。因为其能够产生单细胞数据和解析患者标 本中存在的细胞的非均质混合物，磷酸-FACS技术与用于测量信号级联的其他分析方法相 比具有多种优点。进一步发现以上述适于流式细胞术的方法处理过的标本几乎可以通过任何蛋白 质组技术来进行分析，包括蛋白质印迹法、毛细管电泳、微流体法、质谱分析法(随后进行 纯化)、电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)及其组合。这样，在一些实施方式中，稳定化液体可以是用于后续的通过磷酸化特异性流式 细胞术或其他需要单细胞悬浮液而非细胞裂解产物的方法进行蛋白质丰度和/或蛋白质 翻译后修饰分析的缓冲液。一种用于生物标本(包括全血)的稳定化液体的有效制剂是多 聚甲醛在磷酸盐缓冲液中的溶液。以约0. 至约4%的最终浓度将多聚甲醛引入血液标本可以有效地抑制蛋白质降解并保持参与细胞内信号发生的蛋白质的翻译后修饰，包括磷 酸化。可以加入稳定化液体中的其他的添加剂包括二甘醇、Triton XlOO和/或皂草苷。在 刺激并测定从全血中获取的细胞(例如免疫细胞)的实施方式中，可能希望通过使用红细 胞特异性裂解缓冲液来裂解标本中的红细胞。这些添加剂可以提高稳定化细胞内蛋白质修 饰状态和/或裂解细胞的能力。对于需要单细胞分选或流式细胞分析的刺激试验，稳定剂 可以包括0. 1 10%的多聚甲醛。发明者也发现包含二甘醇能提高稳定化细胞内蛋白质 修饰状态和/或裂解标本内红细胞的能力。在一些实施方式中，二甘醇以低至约0. 001%, 有时约1%，有时约3%，最高可达10%的最终体积浓度用于稳定剂中。稳定剂中另一种感 兴趣的成分是极性、质子惰性的有机溶剂二甲亚砜(DMSO)。在一些实施方式中，DMSO以约 1%，高达约10% (体积)的最终浓度用于稳定剂中。2，4_ 二硝基苯磺酸钠盐(DNBS)也以 约5-50mM或约20-30%的浓度使用。如上文所讨论的，去污剂TWEEN 20与用于针对标记探 针透化细胞的其他去污剂一起使用。发明者发现，对于FACS分析的目的，使用TWEEN 20比 皂草苷或Triton xlOO更优选，因为后者包含苯环和离域电子系统，导致在分析过程中有较 高的背景自体荧光。用于涉及单细胞分选或流式细胞分析的实施方式的稳定剂的优选实施方式包括 水溶液，该水溶液含有在生物样本中的最终浓度为约0. 至10%的甲醛和约0. 001%至 10%的二甘醇；约0. 至5%的甲醛和约至10%的二甲基亚砜(DMSO)，5-50mM的2， 4- 二硝基苯磺酸钠盐(DNBS)和约0. 001%至1. 0%的TWEEN 20 ；约至3%的甲醛和约
至3%的二甘醇；以及约0. 7%至的甲醛和6%至7%的DMS0、20%至30%的DNBS和 0. 07%至 0. 2%的 TWEEN 20。可以使用下述步骤制备用于蛋白质组学的最佳稳定化液体。可以使用重蒸馏 H2o(或磷酸盐缓冲液)来制备稳定化液体。稳定化液体可以递送，使得在生物样本中的最 终浓度是3%甲醛和3%二甘醇。这些试剂在安瓿中的浓度可以高达3X浓度。可以使用停 止样本中核酸合成和降解的稳定化液体的替代制剂。能够用于本发明的其他的稳定化液体 制剂是本领域已知的，包括在美国专利申请2006/0105372A1、美国专利6，204，375和美国 专利5，346，994中所公开的，上述文献其整体通过引用包含于此。在一些实施方式中，管的处理步骤可以包括通过磷酸化特异性流式细胞术进行分 析。在这里说明的本发明的一些实施方式中，管的安瓿可以具有约2毫升稳定化液体 的总容积，该稳定化液体由在重蒸馏压0(或磷酸盐缓冲液)中的约4. 5%的甲醛、约4. 5% 的二甘醇组成。该稳定化液体可以用于有效地使管中的2毫升血液稳定化。稳定化液体也 可以用于在从健康人供体抽取的血液的多种白细胞群体(包括T细胞、B细胞、单核细胞和 粒细胞)中分析细胞因子诱导的信号蛋白的翻译后修饰。此外，可以将缓冲液加入稳定化流体中以用于通过蛋白质印迹法、抗体阵列、蛋白 质阵列或需要细胞裂解物的其他方法进行蛋白质丰度和/或蛋白质翻译后修饰的后续分 析。如本领域技术人员所知，一种适合的制剂是通常用于十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶 电泳(SDS-PAGE)的十二烷基硫酸钠(SDS)细胞裂解缓冲液，其包含广泛起作用的蛋白酶抑 制剂和磷酸酶抑制剂。在一些实施方式中，稳定化液体可以导致RNA稳定化以用于通过微阵列、聚合酶链反应(PCR)实时PCR、寡核苷酸微阵列、cDNA微阵列、宏阵列(macroarray)对RNA转录 物的丰度进行后续分析，特别用于量化转录物丰度的目的。有多种可用的化学试剂，可以被 分为裂解标本中所有细胞的化学试剂，以及在不裂解白细胞的同时使核酸稳定化的化学试 剂。使核酸稳定化的化学试剂的例子包括但不限于Trizol，和其他包含酚和/或其他有机 溶剂的缓冲液，或类似RNALater的包含非常高浓度的盐(包括卤化盐，如氯化铵)但不包 含有机溶剂的其他缓冲液。完成该处理之后，可以将管转移至充满干冰的容器从而运输至设施以进行分析。 替代地，可以将管保存在冷冻器中，理想地是保持温度低于或等于-80摄氏度的冷冻器。 在-80摄氏度下储存适于将患者标本的临床上重要的特征(包括蛋白质修饰和/或基因转 录物丰度)保持一个月以上，但是必须预先确定储存的效果。II 系统这里也提供用于收集、测定和稳定化生物标本的系统。在一个方面，该系统包括如 上文所述的收集设备以及附加的自动化设备，自动化设备在这里也被称为基站，它使得使 用收集设备的一些方案自动化并且能够帮助并行地使用多个收集设备以刺激、稳定化并储 存多个生物标本，以及储存并跟踪每次使用的信息。图4A示出基站的一种实施方式。图4B示出将图4A中的设备的顶板、左侧板和前 侧板连同两个顶部框架构件一同移除后的透视图。图4C示出设备的一种实施方式的前视 图；图4D示出设备的一种实施方式的左侧视图；图4E示出设备的一种实施方式的俯视图。 图4F示出将设备的一种实施方式的前侧板移除后的前视图。图4F示出将设备的一种实施 方式的左侧板和前侧板移除后的左侧视图。装置401(管)可以插入温度控制的铝质支撑块402中的互补的孔中。装置401可 以经过支撑块402的后侧并能够紧密配合地插入连接件403中。连接件403的轴向旋转可 以通过管401与连接件403之间的紧密的互补配合使得管产生轴向旋转。齿轮马达404可 以通过齿轮系统5使得连接件403旋转，齿轮系统5通过对准板406保持与支撑块402中 的孔对准。在适当的时间，电动线性致动器407可以将楔形衔铁408推入保持在支撑块402 中的管401中从而使管401的壁弯曲并且破坏管401中的可破坏的安瓿。在安瓿被破坏之 后，线性致动器407可以将衔铁408缩回，使得管401能够通过连接件403自由地旋转，从 而保证从安瓿中释放的稳定化溶液与管中的标本材料适当地混合。支撑块402的温度可以通过两个珀尔贴409控制，珀尔贴409通过具有非常高导 热率的热环氧树脂连接至支撑块402表面。珀尔贴409不固定至支撑块402的侧面可以通 过热环氧树脂连接至铜散热器410。铜散热器410可以通过热环氧树脂连接至两个水箱。 当珀尔贴409主动地冷却支撑块402时，珀尔贴409通过将声子从连接至支撑块402的珀 尔贴409的一侧转移到连接至散热器410的一侧将热量从支撑块402中带走。在该过程中 也产生废热。该热量的总和被动地从散热器410扩散进入室411，在室411中通过由冷却 泵412泵送经过室411的基于水的冷却剂将热量转移至风扇冷却的散热器413。冷却剂可 以从风扇冷却的散热器413返回至冷却剂主储液箱414，并从主储液箱414由冷却剂泵412 泵送回到回路。12V电源415提供基站的所有组成部件的电力。为了开始循环，使用者将 Smart Tubes放入管支撑块402中并按下开始按钮416。IXD显示屏417向使用者提供状态 信息。在运行最后，Smart Tubes被冷却至4_8摄氏度并保持在该温度，直至使用者按下停止按钮418并将管转移至-80摄氏度储存或在干冰上运送至实验室进行分析。本领域技术人员应当理解，可以使用任何适当的热元件来加热和/或冷却容器及 其内部容纳物，并从而控制内室中反应混合物的温度。一般地，用于加热支撑块的适合的加 热元件包括传导加热器、对流加热器或辐射加热器。传导加热器的例子包括连接至支撑块 的电阻或电感加热元件，例如电阻或热电装置。适合的对流加热器包括强制空气加热器或 用于使流体流经支撑块的流体热交换器。适合的辐射加热器包括红外线或微波加热器。加 热元件可以包括金属、钨、多晶硅、或当在材料上施加压差时发热的其他材料。类似地，可以 使用多种冷却元件来冷却支撑块。例如，可以使用多种对流冷却元件，例如风扇、珀尔贴装 置、制冷装置、或用于使冷却流体流经支撑块表面的喷嘴。替代地，可以使用多种传导性冷 却元件。图5A示出处于打开位置的保持两个管的基站的衔铁。图5B示出处于闭合位置的 基站的衔铁。衔铁501在基站操作的大部分时间内处于打开位置。当线性致动器502延伸 时，将衔铁501压入装置503 (管)的柔性壁，使得壁弯曲并破坏装置内部的稳定剂安瓿。通 过管的轴向旋转，管中的标本混合。示出处于闭合位置的衔铁504以及处于延伸位置的线 性致动器505。图6示出基站的支撑块的剖视图，包括与管的远端相配合并且将轴向旋转传递至 管的管连接件。图6A中以点划线601示出图6B中剖视图的剖面。粗线方框602中所示的 区域在图6C中放大。管支撑块中的逐渐变细的孔603的形状与装置604互补，图中示出一 个装置604插入管支撑块中的示例。装置的远端与连接件605中的一个相配合，连接件605 使装置沿其长轴旋转。管支撑块606中的槽提供间隙，使得衔铁在垂直于管的长轴的方向 上对管的柔性壁施加力。图7示出管支撑块子组件的详细工作方式。图7A示出其中含有一个管的管支撑 块子组件的俯视图。图7B示出其中含有一个管的管支撑块子组件的前视图。图7C示出 含有一个管的管支撑块子组件的左侧视图。701为管盖；702为Smart Tube ;703为管支撑 块；704为连接件，它与Smart Tube的底部相匹配并且通过与Smart Tubes底部的六角形表 面(类似于表面逐渐变小的套筒扳手)的互补相互作用传递轴向旋转的转矩；705是具有 Fairloc Hub的直齿轮，其使得连接件旋转并且与转化齿轮马达709产生的旋转运动的其 他直齿轮啮合；705具有Fairloc Hub, Fairloc Hub起轴环的作用以将直齿轮与连接件704 的轴锁定；706是止推轴承，其允许704和705的子组件旋转并被轴对准板707支撑；708是 止推轴承和轴环，其允许704和705的子组件旋转并被707支撑；轴环锁定至704的轴上以 将子组件紧密地保持在一起，而止推轴承706和708允许子组件旋转；一对珀尔贴710通过 将热量(声子)传入或传出热支撑块来对管支撑块703进行热控制；珀尔贴通过铜散热器 711与一对水箱712热交流。图8A是含有一个管的管支撑块子组件的分解俯视图。801是管盖；802是Smart Tube ；803是管支撑块；804是连接件，它与SmartTube的底部相配合并通过与Smart Tubes 底部的六角形表面(类似于表面逐渐变小的套筒扳手)的互补相互作用传递轴向旋转的转 矩；805是具有Fairloc Hub的直齿轮，其使得连接件旋转并且与转化齿轮马达809产生的 旋转运动的其他直齿轮啮合；805具有Fairloc Hub, Fairloc Hub起轴环的作用以将直齿 轮与连接件804的轴锁定；806是止推轴承，其允许804和805的子组件旋转并被轴对准板
23807支撑；808是止推轴承和轴环，其允许804和805的子组件旋转并被707支撑；轴环锁定 至804的轴上以将子组件紧密地保持在一起，而止推轴承806和808允许子组件旋转；一对 珀尔贴810通过将热量(声子)传入或传出热支撑块来对管支撑块803进行热控制；珀尔 贴通过铜散热器811与一对水箱812热交流。图8B是含有一个管的管支撑块子组件的分 解左视图。图8C是含有一个管的管支撑块子组件的分解仰视图。图9A是管支撑块以及液体冷却系统的透视图，为便于说明，其他的组成部件被移 除。基于水的冷却剂通过泵903从储液箱901被经过冷却剂软管902泵送。然后冷却剂通过 软管904被泵送进入水箱，通过冷却剂的循环该水箱被保持在基本恒定的温度。冷却剂通 过软管905排出水箱，软管905与将冷却剂送入风扇冷却散热器(也被称为热交换器)907 的软管906 —致。冷却剂软管908将冷却剂从散热器907返回到储液箱901从而完成冷却 剂循环。图9B是管支撑块和流体冷却系统的透视图，为便于说明，其他的组成部件被移除。III 方法提供了使用这里公开的容器设备以及自动化系统的方法。公开了用于收集、刺激 和稳定化生物标本的方法。在一个方面，该方法包括提供一种标本收集容器，该容器包括限 定内室的侧壁、底壁和闭合构件，侧壁和底壁中的至少一个壁由可弹性变形的材料制成，内 室中布置有在内室中限定第一室和第二室并将第一室和第二室流体分开的隔离件，第一室 与闭合构件相关联地定位以接收生物标本；第一室中含有至少一种有效刺激生物标本的量 的刺激剂；以及第二室中含有至少一种有效稳定化生物标本的量的稳定剂；从患者收集生 物标本并将生物标本引入第一室中，以将生物标本暴露于在第一室中刺激生物标本的刺激 剂一个预定的时间段，以产生受刺激的生物标本；并在预定的时间段之后通过损坏隔离件 并将第一室和第二室中的容纳物混合以使得受刺激的生物标本稳定化。“预定的时间段”是指在生物标本被接收到装置的第一室中之后，从立刻到经过高 达1小时或更长时间，将第一室中的生物标本和刺激剂与第二室中的稳定剂混合。一般来 说，根据感兴趣的样本和特定分析，第一室中的样本的刺激以秒为增量在从约5分钟到约 30分钟的范围内，通常在从约10分钟到约20分钟的范围内。在一些实施方式中，生物标本被从患者直接收集进入标本收集容器的第一室。在 其他的实施方式中，生物标本被从患者收集进入非标本收集容器的容器，然后被引入标本 收集容器的第一室。所提供的装置、方法和套装适用的生物标本包括例如全血。但是，本领域技术人员将很清楚，这里公开的方法具有特别广泛的实用性。用于收 集、储存、测定和培养细胞和组织的具有多个不连续室的塑料容器在分子生物领域广泛应 用并且在可以使用的细胞的多样性上几乎没有限制。这里公开的装置、系统和方法提供了 一种方式，使得塑料容器中隔离的室中的容纳物能够转移至单个室中而不损坏容器的整体 性和无菌性或分析速度。这样，本领域技术人员将理解，本发明的公开的实施方式对于执行 将细胞或组织连续地暴露于至少一种刺激物和稳定剂以保存生物测定结果用于后续处理 和分析的任何多步骤分析是有用的。这样，可以根据本发明的方法刺激和稳定化来自任何 个体或患者的任何生物标本。因此，所提供的方法和套装能够适用的生物标本包括但不限于全血、滑液、脑脊 液、羊水和包括诸如来自易碎肿瘤的肿瘤细胞的组织活检标本。在一种实施方式中，生物标本为全血。其他的生物标本包括含有细胞的组合物，例如红细胞浓缩液、血小板浓缩液、白 细胞浓缩液、血浆、血清、尿液、骨髓抽取液、组织、细胞和其他体液。诸如容易分离的活检标 本的固态组织标本也是感兴趣的。血液系统疾病是感兴趣的。血液系统疾病包括血细胞的不正常生长，这可能导致 血细胞发育不良变化和血液恶性肿瘤，例如多种白血病。血液系统疾病的例子包括但不限 于急性骨髓性白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、 骨髓发育不良综合征和镰状细胞性贫血。可以根据这里所公开的方法获取和分析其细胞的癌症的其它例子包括但不限于 乳房癌、皮肤癌、骨癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、脑癌、喉癌、胆囊癌、胰腺癌、直肠癌、甲状旁 腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、神经组织癌、头颈癌、结肠癌、胃癌、支气管癌、肾癌、基底细胞 癌、溃疡和乳头型鳞状细胞癌、转移性皮肤癌、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、网状细胞肉瘤、骨髓 瘤、巨细胞瘤、小细胞肺癌、胆结石、胰岛细胞瘤、原发性脑瘤、急性和慢性淋巴细胞和粒细 胞瘤、毛细胞瘤、腺瘤、增生、髓样癌、嗜铬细胞瘤、粘膜神经细胞瘤、肠神经节瘤、增生性 角膜神经瘤、马凡样体质瘤(marfanoid habitus tumor)、威尔姆斯瘤(Wilm’ s tumor)、 精原细胞瘤、卵巢肿瘤、平滑肌瘤、子宫颈发育异常以及原位癌、成神经细胞瘤、成视网膜 细胞瘤、软组织肉瘤、恶性类癌、局部皮肤损伤、蕈样肉芽肿病、横纹肌肉瘤、卡波西肉瘤 (Kaposi' s sarcoma)、骨原性和其他肉瘤、恶性高钙血症、肾细胞肿瘤、真性红细胞增多症 (polycythermia vera)、腺癌、多形性胶质母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、恶性黑素瘤、表皮样 癌、以及其他癌和肉瘤。根据所公开的方法，从患者获取的任何组织可以容易地暴露于刺激物并随后被稳 定化，所以之后可以分析由于这种暴露而导致的任何细胞变化。在又一个方面，这里公开的方法包括提供一种如上文所述的自动化设备，其中该 设备在用于刺激生物标本的预定的时间段内将标本收集容器及其容纳物保持在37摄氏 度，并将其沿着其长轴旋转以确保与容器内的刺激物混合；然后将容器壁变形以损坏隔离 件；沿着标本收集容器的长轴旋转标本收集容器以将第一室和第二室的容纳物混合；在稳 定化过程中在预定的温度下将标本收集容器温育预定的时间；降低标本收集容器及其容纳 物的温度至-80摄氏度到10摄氏度之间。在一些方面，该方法还包括在等于或低于室温的 储存温度下储存和/或运输标本。患者标本可以被加入一个或多个管中。患者标本可以由系统的使用者手动加入。 在一些实施方式中，患者标本可以自动加入。然后可以将一个或多个管插入设备中。被填充 的管可以被插入作为基站的一部分的热控制铝质支撑块的互补的孔或接口(dock)中。孔 可以被预热至生理温度(约37摄氏度)。基站可以具有诸如微处理器或微控制器的控制基 站运行的微电子装置。一旦基站被激活，可以开始自动化循环。可替代地，基站可以检测哪 些孔或接口被占据，然后基站可以自动地启动。当管被插入接口中时，管的下部可以穿过接 口中的孔进入支持管的底部的连接件。连接件的内径可以略微大于管的底部的外径，但是 小于管上的橡胶0形环的外径。当管插入连接件中时，橡胶0形环可以略微变形从而在管 和连接件之间形成贴合配合。间歇地，管可以通过连接件的旋转沿着其长轴旋转。该旋转 转矩可以通过管的橡胶0形环与连接件之间的静摩擦系数传递至管。管的旋转确保管中的 血液与管中的刺激物完全混合并整体达到均一的温度。管也可以具有与连接件中的互补表
25面相匹配的六边形面一该配合允许通过连接件向管施加更大的转矩并且通过连接件确保 管的轴向旋转。在确定的时间段后，基站可以自动地激活管。确定的时间段可以从基站被激活的 时间开始测量并且可以是大约15分钟。可以通过由电动马达驱动的直线型驱动器驱动楔 形摆动衔铁进入接口的柔性壁中来激活管。驱动力可以导致管中的安瓿破坏。在衔铁致动 管之后，可以通过前文所述的轴向旋转将容纳物混合。在稳定剂作用于血液预定的时间段 (例如10分钟)之后，基站可以降低孔或接口的温度至适于短期储存标本的温度。在一些 实施方式中，孔或接口降温至约8摄氏度。然后基站可以发出管的处理已经完成的信号。在 一些实施方式中，基站可以通过任何感知装置发出处理结束的信号，包括但不限于点亮发 光二极管(LED)(或类似元件)、发出声音或其任意组合。一旦处理结束，被激活的管可以保持在接口的孔中数小时，直至管需要被转移至 冷冻器或干冰盒中以进行运输。可以通过微处理器控制的珀尔贴(peltier)来控制接口的 温度，珀尔贴可以通过热环氧树脂连接至支持管的铝质管支撑块。珀尔贴可以在使用或不 使用额外的配件的情况下连接至铝质支撑块。在一些实施方式中，仅连接一个珀尔贴。在 一些实施方式中，可以连接多于一个珀尔贴。微处理器可以使用传感器来确定接口或孔的 当前温度，该传感器包括但不限于热敏电阻、热电偶、或类似的装置。然后微处理器可以确 定当前温度和实验的该步骤所希望的温度之间的差别，并且使用诸如比例积分微分(PID) 控制器的控制反馈算法来确定向珀尔贴提供多少功率。然后微处理器可以向H桥发送脉宽 调制(PWM)信号以向珀尔贴提供功率。电流流过珀尔贴的方向可以表示珀尔贴是加热还是 冷却接口或孔。PWM信号的宽度(占空度)可以决定平均电压，从而决定可以发送至珀尔贴 的有效功率。珀尔贴不与管支撑块接触的侧面可以通过散热器连接至水箱(或基于空气的 吸热部件)。液体可以被泵送经过回路。回路可以使液体经过水箱和被风扇吹的散热器单 元。水箱和冷却回路可以使珀尔贴的一侧保持接近室温。使珀尔贴的一侧保持接近室温使 得珀尔贴能够根据实验方案的要求有效地加热或冷却接口。这里公开的方法的一些实施方式还包括通过蛋白质组或基因组方法分析标本。这 些蛋白质组或基因组方法包括但不限于流式细胞术、多标记飞行时间质谱分析、蛋白质微 阵列、PCR、实时定量PCR、核酸微阵列、RNAi阵列、细胞阵列、cDNA微阵列、肽测序以及核酸 测序。IV.套装也提供用于根据本发明的方法收集、测定、稳定化和分析生物标本的套装。在一个 方面，这种套装包括如上文所述的收集装置。在一种另外的实施方式中，提供一种用于分析和处理生物标本的套装。在一些实 施方式中，套装包含能够替代所提供的容器设备的闭合构件的滤盖，该滤盖包括网，可以通 过该网将液体加入或移出内室同时将损坏的隔离物的碎片保持在内室中。图10示出可以 用于在倒出容器的容纳物时将安瓿的碎片保持在容器(Smart Tube)中的滤盖。十字影线 图案示出连接至滤盖的尼龙过滤器，该过滤器移除安瓿碎片。该网的开口尺寸在250微米 到2000微米之间，例如约500微米至约1000微米。因为较细的网限制空气进入并且不能 帮助倒出小的体积，所以使用粗的尼龙过滤器以保证良好的流通。图1所示的安瓿保持插 入件对于移除较大的安瓿碎片是有效的，而该滤盖对移除几乎任何尺寸的安瓿碎片是有效的。插入件和盖可以单独使用或组合使用。在另一个方面，套装还包括低渗裂解缓冲液；高渗裂解缓冲液；透化缓冲液；以及 染色缓冲液。在从存储条件中移出之后，细胞可以通过用低渗裂解缓冲液处理以及任选地 随后使用高渗裂解缓冲液处理以承受渗透应力。在该套装的一些实施方式中，低渗裂解缓 冲液和高渗裂解缓冲液包含去污剂。在优选的实施方式中，去污剂为Tween20。一般来说， 稳定化缓冲液中包含的固定剂(例如多聚甲醛)的量越大，第一(低渗)和第二(高渗) 裂解步骤中对用于裂解不需要的细胞(例如在生物标本为全血的情况下，红细胞)的去污 剂的需求越大。在感兴趣的细胞被渗透化之后，细胞可以用例如标记抗体针对感兴趣的抗 原进行染色。通过下述示例性的实施例，本领域技术人员将很清楚这里公开的试剂和套装 的使用。所要求保护的装置、系统、方法和套装适用的生物标本包括但不限于全血、滑液、 脑脊液、羊水。V.实施例棚列1 侧_膽碰流錢胞太俯稳淀·物fe本通过磷酸化特异性流式细胞术进行分析的一种方法包括下述步骤。可以将冷冻的 标本用生理PH的ddH20清洗两次，如果生物标本是血液，ddH20可以包含用于裂解剩余的红 细胞的试剂。可选地，可以将0. 的Triton XlOO或0. 1 %的皂草苷加入用于裂解红细胞 的ddH20中，它们是对裂解红细胞有效的去污剂。然后用磷酸缓冲液冲洗细胞，并将沉淀物 重悬浮在冷却至4摄氏度的80%甲醇和20%磷酸缓冲液的2毫升溶液中。然后可以将甲 醇固定的细胞悬浮液在-80摄氏度下储存。为了继续处理，如本领域已知的，用由溶解在磷 酸缓冲液中的0. 5%牛血清蛋白组成的染色介质清洗甲醇固定的细胞悬浮液两次，然后通 过磷酸-FACS染色并分析。实施例2 使用Smart Tube Kit处理冷冻在Smart Tube中的标本，然后通过磷酸 仆龙寺异+牛流,式细朐,术讲行后续分析，IU#/zH斤稳定北的勿标本下述方案使用所述的容器设备和套装处理冷冻在Smart Tube中的标本，以用于通 过磷酸化特异性流式细胞术进行后续分析。处理套装的组成包括i)滤盖(过滤网孔的尺寸在500微米到2000微米之间)ii)裂解缓冲液1 含0. 03%的Tween 20的重蒸馏H20(ddh20)iii)裂解缓冲液2 含0. 03%的Tween 20的2X磷酸缓冲液(2XPBS)iv) 一升 2X PBS = 16g Nacl, 0. 4g KCl，2· 88g Na2HPO4,0. 48gKH2P04，pH 值为 7. 4ν)透化缓冲液1 :80%甲醇与20% PBS(使用前在冰上预冷)vi)染色缓冲液含0. 5%牛血清蛋白的PBSΑ.将收集、刺激并稳定化的全血标本解冻；裂解红细胞将标本在37°C的水浴中解冻10分钟。将盖拧开，加入2ml裂解缓冲液1，重新拧 上盖，并涡旋振荡10秒钟。将盖替换为滤盖并倒入15ml锥形管中。可选地，50ml锥形管 可以用细胞过滤网在适当位置替代以去除细胞结块。在锥形管中加入裂解缓冲液1并且在 370C (42°C是具有特别的优点的替代温度)水浴中温育10分钟。以SOOXg离心5分钟。 弃去上清液。如果产生的沉淀物是白色的(不含未裂解的红细胞)，则进行下一个阶段，染色以通过磷酸化特异性流式细胞术进行分析。如果产生的沉淀物是红色的(含有未裂解的 红细胞)，则将沉淀物在IOml裂解缓冲液2中重新悬浮并在37°C (42°C是具有特别的优点 的替代温度)水浴中温育10分钟。以SOOXg离心试管5分钟，倒出上清液，并用裂解缓冲 液1清洗沉淀物。产生的沉淀物应该是白色的，与完全红细胞裂解相一致。继续进行染色 以通过磷酸化特异性流式细胞术进行分析。B.染色以通过磷酸化特异性流式细胞术进行分析涡旋振荡上述包含沉淀物的试管以使得沉淀物松散。向每个管中加入Iml透化缓 冲液1并涡旋振荡5秒钟以使得沉淀物重悬浮在缓冲液中。将管转移至-80摄氏度。在进 一步处理之前，标本可以储存在-80摄氏度下至少三十天。为了进一步处理，在每个管中加 入至少4ml染色缓冲液并且在4摄氏度下以SOOxg离心5分钟。倒出上清液，并用4ml染 色缓冲液冲洗沉淀物两次。将每个沉淀物重悬浮在IOOul染色缓冲液中并且将IOOul细 胞悬浮液转移至新的FACS管(或板)用于抗体染色。将抗体混合物加入每个标本中并在 室温下在黑暗中染色30分钟。用于此的抗体混合物一般包括一种或多种荧光标记的磷酸 特异性抗体如STAT5(pY694)特异性克隆47 (Becton Dickinson目录编号612598)，以及一 种或多种荧光标记的细胞型限制性表面表位特异性抗体如CD33特异性克隆P67. 6 (Becton Dickinson目录编号341640)。最后将染色缓冲液加入管中，在SOOxg下离心并倒出上清液。 在适于该应用的流式细胞术平台上分析，例如Becton DickinsonFACSCalibur或LSRII。注 意如果Smart Tube中如所推荐地收集和刺激了 Iml患者血液，则标本可以被分到至少4个 不同的FACS管中以用不同的染色混合物进行分析。上文仅说明了本发明的原理。应当理解，虽然这里没有详细描述或示出，但是本领 域技术人员将能够设计出体现本发明的原理并且包括在本发明的精神和范围内的多种布 置。此外，这里说明的所有例子和条件语言主要是为了便于读者理解本发明的原理以及发 明人对于本领域的发展所提出的概念，而并不应被理解为仅限于这些特别说明的例子和条 件。此外，这里说明本发明的原理、方面和实施方式的所有陈述以及其具体实施例均意于包 含其结构和功能等价物。此外，这些等价物意于包括当前已知的以及将来开发的等价物，即 开发出来的任何执行同样功能的元件，无论其结构如何。因此，本发明的范围不应限制于这 里示出并说明的示例性的实施方式。本发明的范围和精神由后附的权利要求书说明。
权利要求
一种用于收集、测定和稳定化生物标本的设备，所述设备包括容器，其具有限定内室的侧壁、底壁和闭合构件，所述内室中布置有隔离件，所述隔离件在所述内室中限定第一室和第二室并且将所述第一室和所述第二室流体分隔，所述第一室与所述闭合构件相关联地定位以接收所述生物标本；其中，所述壁中的至少一个由可弹性变形材料制成；其中，所述第一室包含至少一种刺激剂；其中，所述第二室包含至少一种稳定剂；且其中，能够在不打开、不以其他方式损坏所述内室的流体完整性的情况下通过使所述至少一个壁变形以使得所述第一室和所述第二室流体连通。
2.根据权利要求1所述的设备，其中，所述隔离件由一种材料制成，使得通过使所述壁 变形能够损坏所述隔离件的流体完整性以使得所述第一室和所述第二室流体连通。
3.根据权利要求2所述的设备，其中，所述隔离件由一种材料制成，所述材料是可破坏 的和可溶解的材料中的一种或多种。
4.根据权利要求2所述的设备，还包括网或孔中的一种；在将被损坏的所述隔离件的 碎片保持在所述内室中的同时能够通过所述网或孔将液体加入或移出所述内室。
5.根据权利要求3所述的设备，其中，所述隔离件形成限定所述第二室的安瓿。
6.根据权利要求5所述的设备，其中，所述安瓿由硼硅酸盐玻璃制成。
7.根据权利要求1所述的设备，其中，所述壁还包括在所述内室内部的支撑环；其中，所述隔离件包括通过可破坏的粘接物固定至所述支撑环的阀瓣构件，所述固定的阀瓣构件在所述内室中限定第一室和第二室并且将所述第一室和所述第二室流体分 隔；其中，所述阀瓣构件由与所述壁相比弹性变形能力显著较低的材料制成，使得所述阀 瓣构件能够通过所述壁和所述支撑环的变形而位移以使得所述第一室与所述第二室流体 连通。
8.根据权利要求7所述的设备，其中，所述支撑环为整体式支撑环并且相对于所述设 备的长轴成非直角。
9.根据权利要求8所述的设备，其中，所述角度为约45度。
10.根据权利要求1所述的设备，还包括在所述第一室中的抗凝血剂。
11.根据权利要求1所述的设备，其中，所述刺激剂为生物制剂。
12.根据权利要求11所述的设备，其中，所述刺激剂为抗体。
13.根据权利要求11所述的设备，其中，所述刺激剂为小分子。
14.根据权利要求11所述的设备，其中，所述刺激剂为细胞因子。
15.根据权利要求14所述的设备，其中，所述刺激剂为免疫调节细胞因子。
16.根据权利要求11所述的设备，其中，所述刺激剂为Toll样受体配体。
17.根据权利要求1所述的设备，其中，所述稳定剂包括固定剂。
18.根据权利要求1所述的设备，其中，所述稳定剂包括细胞裂解缓冲液。
19.根据权利要求1所述的设备，其中，所述稳定剂保持细胞表面抗原，同时阻止选自 蛋白质合成、蛋白质降解、核酸合成、核酸降解、胞吞作用、分泌、磷酸化、脱磷酸化、泛素化 和甲基化的至少一种细胞过程。
20.根据权利要求1所述的设备，其中，所述稳定剂保持核酸。
21.根据权利要求1所述的设备，其中，所述稳定剂含有细胞裂解缓冲液或红细胞特异 性细胞裂解缓冲液。
22.根据权利要求1所述的设备，其中，所述稳定剂包括固定剂和红细胞裂解缓冲液。
23.根据权利要求1所述的设备，其中，所述稳定剂使得蛋白质和细胞内信号稳定化。
24.根据权利要求1所述的设备，其中，所述稳定剂保持核酸以用于通过聚合酶链反应 (PCR)、实时PCR、寡核苷酸微阵列、cDNA微阵列、宏阵列进行后续分析，特别用于量化转录 物丰度的目的。
25.根据权利要求1所述的设备，其中，所述稳定剂适当地保持细胞表面以允许单细胞 分选和/或流式细胞分析。
26.根据权利要求25所述的设备，其中，所述单细胞分选是荧光激活细胞分选。
27.根据权利要求26所述的设备，其中，所述荧光激活细胞分选和/或流式细胞分析使 用磷酸化特异性抗体。
28.根据权利要求22所述的设备，其中，所述稳定剂是包含在所述生物标本中的最终 浓度约为0. 至10%的甲醛、0. 001%至10%的二甘醇的水溶液。
29.根据权利要求22所述的设备，其中，所述稳定剂是包含在所述生物标本中的最终 浓度约为0. 至5%的甲醛、至10%的二甲亚砜(01^0)、5至50識的2，4-二硝基苯磺 酸(DNBS)、0. 001%至1. 0%的TWEEN 20去污剂的水溶液。
30.根据权利要求22所述的设备，其中，所述稳定剂是包含在所述生物标本中的最终 浓度为至3%的甲醛和至3%的二甘醇的水溶液。
31.根据权利要求22所述的设备，其中，所述稳定剂是包含在所述生物标本中的最终 浓度为 0. 7%至 的甲醛、6%至 7% 的 DMS0、20%至 30% 的DNBS、0. 07%至0. 2% 的 Tween 20去污剂的水溶液。
32.根据权利要求1所述的设备，其中，所述第一室的内部压强低于大气压。
33.根据权利要求32所述的设备，其中，所述内部压强设定为将预定体积的所述生物 标本抽入所述第一室。
34.根据权利要求1所述的设备，其中，所述生物标本选自全血、滑液、脑脊液、羊水和 肿瘤细胞。
35.一种用于收集、测定和稳定化生物标本的系统，所述系统包括a)根据权利要求1所述的收集设备；以及b)自动化设备，其包括i)操纵装置，其能够以下述方式中的一种或多种操纵所述收集设备移动、旋转、摇 动、超声振动以及亚音速振动所述收集设备； )力施加装置，其能够使得所述收集设备的所述第一室和第二室流体连通；以及iii)热调节装置，其能够调节所述收集设备的温度。
36.根据权利要求35所述的系统，还包括控制所述自动化设备的功能的微电子元件。
37.根据权利要求35所述的系统，还包括能够向使用者报告所述系统的状态的用户界
38.根据权利要求36所述的系统，还包括计时装置，所述计时装置与所述操纵装置、所述力施加装置和所述热调节装置中的一种或多种功能连接并且设置为触发其操作。
39.根据权利要求36所述的系统，其中，所述收集设备还包括能够对其进行辨别的独 特的标签。
40.根据权利要求36所述的系统，其中，所述独特的标签选自RFID标签、线性条码、矩 阵式条码和微点图案。
41.根据权利要求39所述的系统，其中，所述自动化设备收集数据，所述数据包括一个 或多个带标签的收集设备的测定参数数据。
42.根据权利要求41所述的自动化设备，还包括将所述测定参数数据传输至远程位置 的装置。
43.根据权利要求42所述的自动化设备，其中，所述远程位置为能够进行存储所述数 据、分析所述数据以及向使用者显示所述数据中的一项或多项的外部处理系统。
44.根据权利要求35所述的系统，其中所述隔离件由一种材料制成，使得通过使所述壁变形能够损坏所述隔离件的流体完整 性，以使得所述第一室和所述第二室流体连通；且所述力施加装置通过使所述壁变形能够使得所述收集设备的所述第一室和第二室流 体连通。
45.根据权利要求35所述的系统，其中，所述壁还包括在所述内室的内部的支撑环；其中，所述隔离件包括通过可破坏的粘接物固定至所述支撑环的阀瓣构件，所述固定的阀瓣构件在所述内室中限定第一室和第二室并且将所述第一室和所述第二室流体分 隔；其中，所述阀瓣构件由与所述壁相比弹性变形能力显著较低的材料制成，使得所述阀 瓣构件能够通过所述壁和所述支撑环的变形而位移以使得所述第一室与所述第二室流体 连通。
46.一种用于收集、刺激和稳定化生物标本的方法，该方法包括提供样本收集容器，所述样本收集容器包括限定内室的由可弹性变形的材料制成的 壁、底壁和闭合构件，所述内室中布置有隔离件，所述隔离件在所述内室中限定第一室和第 二室并且将所述第一室和所述第二室流体分隔，所述第一室与所述闭合构件相关联地定位 以接收所述生物标本；在所述第一室中含有能够有效地刺激生物标本的量的至少一种刺激 剂；以及在所述第二室中含有能够有效地稳定化所述生物标本的量的至少一种稳定剂；从患者收集生物标本并且将所述生物标本引入所述第一室中以使得所述生物标本暴 露于所述刺激剂；刺激所述第一室中的所述生物标本预定的时间段，以产生受刺激的生物标本；并且在所述预定的时间段之后，通过损坏所述隔离件并且将所述第一室与第二室中的容纳 物混合来稳定化所述受刺激的生物标本，以产生稳定化的生物标本。
47.根据权利要求46所述的方法，其中，所述稳定剂含有细胞裂解缓冲液或红细胞特 异性细胞裂解缓冲液。
48.根据权利要求46所述的方法，其中，所述稳定剂包括固定剂和红细胞裂解缓冲液。
49.根据权利要求46所述的方法，其中，所述稳定剂使蛋白质和细胞内信号稳定化。
50.根据权利要求49所述的方法，其中，所述稳定化的生物标本接下来通过蛋白质组技术进行分析。
51.根据权利要求50所述的方法，其中，所述蛋白质组技术是蛋白质印迹技术。
52.根据权利要求50所述的方法，其中，所述蛋白质组技术是毛细管电泳技术。
53.根据权利要求50所述的方法，其中，所述蛋白质组技术是微流体技术。
54.根据权利要求46所述的方法，其中，所述稳定剂保持核酸以用于通过聚合酶链反 应(PCR)、实时PCR、寡核苷酸微阵列、cDNA微阵列和宏阵列技术中的一种或多种进行后续 分析。
55.根据权利要求54所述的方法，其中，所述技术为测序技术。
56.根据权利要求46所述的方法，其中，所述稳定剂保持细胞表面，以适于允许单细胞 分选和/或流式细胞分析。
57.根据权利要求56所述的方法，其中，所述单细胞分选为荧光激活细胞分选。
58.根据权利要求57所述的方法，其中，所述荧光激活细胞分选使用磷酸化特异性抗体。
59.根据权利要求56所述的方法，其中，所述流式细胞分析是电感耦合等离子体质谱 法(ICP-MS)。
60.根据权利要求46所述的方法，其中，所述隔离件由一种材料制成，使得能够通过 所述壁的变形来损坏所述隔离件的流体完整性，从而使得所述第一室与所述第二室流体连 通；且其中，所述损坏所述隔离件是通过使所述壁变形来完成的。
61.根据权利要求46所述的方法，还包括提供根据权利要求35所述的自动化设备， 其中，所述设备在所述刺激过程中将所述样本收集容器及其容纳物保持在37摄氏度； 使所述壁变形以损坏所述隔离件；使所述样本收集容器沿其长轴旋转以使得所述第一室与所述第二室中的容纳物混合；在所述稳定化过程中在预定的温度下将所述标本收集容器温育预定的时间；以及 降低所述标本收集容器及其容纳物的温度至-80摄氏度到10摄氏度之间。
62.根据权利要求46所述的方法，其中，所述生物标本从所述患者直接被收集到所述 标本收集容器的所述第一室中。
63.根据权利要求46所述的方法，其中，所述生物标本从所述患者被收集到非所述标 本收集容器的容器中，然后被引入所述标本收集容器的所述第一室。
64.一种收集、刺激和稳定化全血标本的方法，所述方法包括提供样本收集容器，所述样本收集容器具有限定内室的侧壁、底壁和闭合构件，所述 内室中布置有(i)隔离件，所述隔离件在所述内室中限定第一室和第二室并且将所述第 一室和所述第二室流体分隔，所述第一室与所述闭合构件相关联地定位以接收所述生物标 本，并且所述第一室具有低于大气压的压强；以及(ii)以能够有效地刺激全血标本的量容 纳在所述第一室中的至少一种刺激剂以及以能够有效地稳定化所述全血标本的量容纳在 所述第二室中的至少一种稳定剂；其中，至少一个所述壁由可弹性变形材料制成；从患者直接收集全血标本进入所述第一室中以使得所述全血标本直接暴露于所述刺激剂；刺激所述第一室中的所述全血标本希望的时间段，以产生受刺激的全血标本；并且在所述希望的时间段之后，立刻通过使所述壁变形以损坏所述隔离件并且将所述第一 室与第二室中的容纳物混合来稳定化所述受刺激的全血标本。
65.根据权利要求46所述的方法，其中，所述刺激还包括将所述标本保持在预定的反 应温度下预定的时间段。
66.根据权利要求46所述的方法，其中，所述方法还包括以下一个或多个步骤在等于 或低于室温的储存温度下储存所述标本和在等于或低于室温的储存温度下运输所述标本。
67.根据权利要求46所述的方法，其中，所述方法还包括通过蛋白质组或基因组方法 分析所述标本。
68.根据权利要求67所述的方法，其中，所述蛋白质组或基因组技术选自流式细胞术、 蛋白质微阵列、PCR、实时定量PCR、核酸微阵列、RNAi阵列、细胞阵列、cDNA微阵列、肽测序 以及核酸测序。
69.一种分析生物标本的刺激曲线的方法，所述方法包括分析生物标本的刺激曲线，所 述生物标本通过根据权利要求46所述的方法准备。
70.根据权利要求46所述的方法，所述方法还包括通过将所述标本加热至室温到100 摄氏度之间的温度来处理所述标本。
71.根据权利要求46所述的方法，所述方法还包括通过将所述标本加热至40到50摄 氏度之间的温度来处理所述标本。
72.一种用于收集、测定和稳定化生物标本的套装，所述套装包括根据权利要求1所述 的设备。
73.一种用于分析和处理生物标本的套装，所述套装包括能够替代根据权利要求3所述设备的闭合构件的滤盖，所述滤盖包括网或孔，能够在将损坏的所述隔离件的碎片保持在所述内室中的同时通 过所述网或孔将液体加入或移出所述内室；低渗裂解缓冲液；高渗裂解缓冲液；透化缓冲液；以及染色缓冲液。
74.根据权利要求73所述的套装，其中，所述网中的开口尺寸大于约500微米且小于约 2000微米。
75.根据权利要求73所述的套装，其中，所述低渗裂解缓冲液和所述高渗裂解缓冲液 中的一个或多个包含去污剂。
76.根据权利要求75所述的套装，其中，所述去污剂为Tween20。
全文摘要
公开了用于收集、刺激、稳定化和分析包括血液标本在内的生物标本的装置、系统、方法和套装。本发明的一种实施方式包括具有限定内室的侧壁、底壁和闭合构件的容器，内室中布置有隔离件，隔离件在内室中限定第一室和第二室并将第一室和第二室流体分隔，第一室与闭合构件相关联地定位以接收生物标本；其中，至少一个壁由可弹性变形的材料制成；其中，第一室包含至少一种刺激剂；其中，第二室包含至少一种稳定剂；且其中使用者能够在不打开、不以其他方式破坏内室的流体完整性的情况下使第一室和第二室流体连通。
文档编号B01L3/00GK101896276SQ200880120882
公开日2010年11月24日 申请日期2008年11月28日 优先权日2007年11月28日
发明者M·哈尔 申请人:智能管公司