含有甲酰基的多孔性载体、使用该多孔性载体的吸附体以及它们的制造方法

专利名称：含有甲酰基的多孔性载体、使用该多孔性载体的吸附体以及它们的制造方法
技术领域：
本发明涉及各种吸附体，特别是治疗用(医疗用)吸附体和抗体医药品精制用吸附体。
背景技术：
多孔性载体已被广泛用作各种吸附体，例如各种色谱法用吸附体及亲和吸附体。 其中，亲和吸附体可以高效率地精制目标物，并且能够降低无用物的浓度，因此已越来越多地被用作医疗用吸附体和抗体医药品精制用吸附体。特别是，作为用于治疗风湿、血友病、 扩张型心肌病的治疗用(医疗用)吸附体，受到关注的是将作为亲和配位体的蛋白质A固定化于多孔性载体而得到的吸附体(例如，非专利文献1、非专利文献2)。另一方面，作为能够特异性地吸附、洗脱免疫球蛋白(IgG)的吸附体，备受瞩目的是将作为亲和配位体的蛋白质A固定化于多孔性载体而得到的吸附体(抗体医药品精制用吸附体)。作为将以蛋白质A为代表的各种亲和配位体固定化于多孔性载体的方法，可以从例如非专利文献3的表8. 1和图8. 15中所示的溴化氰法、三氯三嗪法、环氧法、三氟乙烷磺酰氯法等各种固定化方法中选择。其中，从安全性的观点、以及固定化反应的容易程度、能够使用可通过较容易的方法生产的蛋白质、肽等理由来看，工业上优选将多孔性载体的甲酰基与亲和配位体的氨基之间的反应应用于固定化。作为向多孔性载体导入甲酰基的方法，可以列举通过过碘酸氧化法使具有连位 (m t > )羟基的多糖凝胶氧化、从而在糖链上生成甲酰基的方法(以下简称为糖链开裂型)(例如非专利文献4)。通过该方法得到的吸附体具有配位体洗脱少的优点。此外，还可以列举如非专利文献3的图8. 15、或非专利文献5所示地，介由通过使戊二醛发生作用的方法、使环氧基开环得到的甘油基与过碘酸盐作用的方法等得到的各种间隔团导入甲酰基的方法(以下简称为间隔团型)。使用了上述含有间隔团型甲酰基的多孔性载体的吸附体，具有目标物吸附量较大的倾向。此外，在专利文献1中公开了下述制造方法向多孔性粒子的环氧基中导入氨基糖，并在该氨基糖部分经氧化开裂而生成的甲酰基上固定化含有氨基的配位体。现有技术文献专利文献专利文献1 日本特开昭62-15300非专利文献非专利文献 1 =Annals of the New York Academy of Sciences,2005,Vol. 1051， P635-646 非专利文献 2 =American Heart Journal, Vol. 152(4), 2006非专利文献3 :亲和色谱法，笠井献一等著，东京化学同人，1991年非专利文献4 Jmmunology, Vol. 20，pl061,1971
非专利文献5 !Immobilized Affinity Ligand Techniques,Greg Τ. Hermanson et al. , Academic Press,199
发明内容
发明要解决的问题然而，对于含有糖链开裂型甲酰基的多孔性载体而言，糖链会因强氧化反应而开裂，导致多孔性载体的强度变弱，可能难以在高线速下使用。另外，就抗体医药品精制用吸附体而言，具有对目标物抗体的吸附量小的倾向，难以高速地进行抗体精制。另一方面，对于含有间隔团型甲酰基的多孔性载体而言，如果甲酰基的导入量少，则在治疗过程中及精制目标物的过程中，可能发生亲和配位体洗脱而混入到患者血液或精制产品的情况，因此从安全性和纯度的观点来看不优选。此外，虽然在通常的亲和色谱领域的文献(例如非专利文献3和非专利文献5) 及活性化载体的产品目录中没有明确记载，但本发明人等发现在专利文献1所述方法中， 对多孔性粒子进行环氧化时，无论如何都会发生环氧基自动开环而副产甘油基的情况。这样，在使氨基糖发生氧化开裂而导入甲酰基时，由所述环氧基开环得到的甘油基也同时被氧化，从而会导入与间隔团型相同的甲酰基，可能使亲和配位体变得容易洗脱。本发明是鉴于现有技术存在的上述问题而完成的，目的在于提供可以提高治疗和精制的安全性、实现高速化、并进一步提高精制产品的纯度的含有甲酰基的多孔性载体、使用该多孔性载体的吸附体、它们的制造方法、以及使用它们的精制方法。解决问题的方法为了解决上述问题，本发明人等进行深入地研究，结果完成了本发明。S卩，本发明涉及含有甲酰基的多孔性载体的制造方法，其包括向具有甲酰基的多孔性粒子中导入间隔团，然后利用过碘酸和/或过碘酸盐对上述间隔团部分进行氧化，使其转变为甲酰基，其中，导入间隔团后，多孔性粒子的甲酰基含量为每ImL多孔性粒子中的甲酰基含量为3 μ mol以下。此外，本发明涉及含有甲酰基的多孔性载体的制造方法，其包括在加入酸而将 PH调节至1 6范围的液体中，使过碘酸或其盐与多孔性载体或与导入了间隔团的多孔性载体发生作用。此外，本发明涉及含有甲酰基的多孔性载体的制造方法，其包括使过碘酸和/或过碘酸盐与多孔性载体或与导入了间隔团的多孔性载体在0°c以上且10°C以下的温度下发生作用。此外，本发明涉及通过上述任意一种含有甲酰基的多孔性载体的制造方法得到的含有甲酰基的多孔性载体。此外，本发明涉及吸附体的制造方法，其包括将含有氨基的配位体固定化于所述的含有甲酰基的多孔性载体上。此外，本发明涉及吸附体的制造方法，其中，在含有下述水溶液的反应液中，将含有氨基的配位体固定化于含有甲酰基的多孔性载体，所述水溶液包含选自羧酸盐、金属卤化物及硫酸盐中的1种以上化合物，且以羧酸盐为必要成分。此外，本发明涉及吸附体的制造方法，其中，在含有柠檬酸盐和/或硫酸盐的反应液中，将含有氨基的配位体固定化于含有甲酰基的多孔性载体。此外，本发明涉及吸附体的制造方法，其包括通过亚氨基化及其还原反应这两步反应来进行将含有氨基的配位体固定化于含有甲酰基的多孔性载体，并在亚氨基化反应之后实施稳定化操作。此外，本发明涉及吸附体的制造方法，其中，在将含有氨基的配位体固定化于含有甲酰基的多孔性载体时，通过有机硼烷络合物，使配位体的固定化键稳定化并同时使其余的甲酰基钝化。此外，本发明涉及吸附体，其中，含有氨基的配位体的导入量为每ImL多孔性载体中导入含有氨基的配位体Img以上且500mg以下。此外，本发明涉及吸附体，其中，含有氨基的配位体的导入量为每ImL多孔性载体中导入含有氨基的配位体0. 01 μ mol以上且15 μ mol以下。此外，本发明涉及吸附体的制造方法，其中，所述含有氨基的配位体是蛋白质A。此外，本发明涉及吸附体，其中，从吸附体洗脱到目标物中的配位体浓度的第一次精制 第三次精制的平均值为50ppm以下。此外，本发明涉及吸附体，其在压缩5%时的压缩应力为0. OlMPa以上且IMPa以下，压缩10%时的压缩应力为0. 03MPa以上且3MPa以下，以及压缩15%时的压缩应力为 0. 06MPa以上且5MPa以下。此外，本发明涉及吸附体的制造方法、按照上述制造方法得到的吸附体以及使用上述吸附体的精制方法。此外，本发明涉及精制方法，其中，使用直径为0.5cm以上且高度为3cm以上的柱。此外，本发明涉及精制方法，其包括以lOOcm/h以上且lOOOcm/h以下的线速进行通液的工序。发明的效果根据本发明，可以提供高强度的含有甲酰基的多孔性载体。本发明的含有甲酰基的多孔性载体可以适用于吸附体，可以得到目标物吸附量大、且配位体的泄漏少的吸附体。 此外，通过本发明的吸附体，可以提高治疗和精制的安全性，并提供治疗和精制的高速化及
高纯度化。发明的
具体实施例方式本发明的含有甲酰基的多孔性载体的制造方法中，向具有甲酰基的多孔性粒子中导入间隔团，然后利用过碘酸和/或过碘酸盐对上述间隔团部分进行氧化，使其转变为甲酰基，其中，导入间隔团后，多孔性粒子的甲酰基含量为每ImL多孔性粒子中的甲酰基含量为3μπι01以下。通过该方法，在导入亲和配位体后的吸附体中，配位体的洗脱量少，且可以抑制批次间偏差，并且，可以得到目标物吸附量大的吸附体。为了抑制配位体的泄漏，通常会针对配位体固定化后的还原反应加以研究，而除此之外，本发明人还着眼于在用于导入配位体的含有甲酰基多孔性载体的前驱体阶段，即在向具有甲酰基的多孔性粒子导入间隔团之后，对于反应中未使用的多孔性粒子的甲酰基的处理。即，本发明人猜测，未经处理而残留的多孔性粒子的甲酰基可能是导致洗脱(溶出)发生的原因。对于向具有甲酰基的多孔性粒子中导入间隔团后，对间隔团导入反应中未使用的多孔性粒子的甲酰基的处理方法进行了研究，结果发现在导入间隔团后，得到的多孔性载体中不存在甲酰基、或者存在下述含量的甲酰基每ImL载体中的甲酰基含量为3 μ mol以下。而使用这样的导入了间隔团的多孔性载体制造含有甲酰基的多孔性载体时，获得了出乎意料的结果在导入亲和配位体后的吸附体中，配位体的洗脱量少，且批次间偏差得到了抑制。由此，可以减轻精制后工序的繁琐程度，此外，在用于精制抗体医药品的情况下，可以提高抗体医药品的安全性。导入了间隔团的载体中的甲酰基的含量优选为每ImL载体中的甲酰基含量为
0μ mol以上且3 μ mol以下，进一步优选0 μ mol以上且2 μ mol以下，更优选0 μ mol以上且
1μ mol以下，特别优选0 μ mol以上且0. 5 μ mol以下，最优选0 μ mol以上且0. 3 μ mol以下。可以作为间隔团被导入至本发明的多孔性载体及吸附体的化合物，可以没有特别限定地使用，为了进一步减少配位体的洗脱量，优选具有环结构的化合物。作为具有环结构的化合物，没有特别限定，可以列举例如以环戊烷或环己烷等为代表的仅由碳构成的5元环或6元环，以呋喃糖或吡喃糖等为代表的糖或糖类似物。其中，基于容易获得等理由，优选糖或糖类似物。此外，从多孔性载体和亲和配位体的之间的成键更加坚固和/或亲和配位体难以解离的观点来看，更加优选上述糖为还原糖。本发明的多孔性载体中，作为间隔团而被导入的化合物可以没有特别限定地使用，采用过碘酸氧化法等作为导入甲酰基的方法的情况下，优选具有平伏位具有羟基的碳原子连续存在的部分，所述平伏位具有羟基的碳原子的连续个数为2或3。作为向本发明的多孔性载体中导入间隔团的方法，优选利用含有甲酰基的多孔性粒子和作为间隔团而被导入的化合物的官能团之间的反应。对于含有甲酰基的多孔性粒子的官能团以及作为间隔团而被导入的化合物的官能团，各自并无特别限定，优选采用适于相互反应的组合，也优选使二者之间经由其它其它化合物进行反应。利用含有甲酰基的多孔性粒子的甲酰基的情况下，作为间隔团而被导入的化合物优选具有能够与甲酰基反应的官能团。作为与甲酰基反应的官能团，只要能够与甲酰基反应即可，没有特别限定，通常优选氨基。即，作为间隔团而被导入到本发明的多孔性载体中的化合物含有氨基；作为间隔团被导入的化合物是糖的情况下，更加优选为氨基糖。此外，本发明人等发现在pH 7 11的范围使具有1，2-二醇结构的伯胺或仲胺与含有甲酰基的多孔性粒子缩合，和任选地，通过对形成的键实施还原反应使其稳定化时， 出乎意料的是，可以高效率地将1，2_ 二醇结构导入至载体。上述pH的范围更优选为8 10，PH特别优选8. 5 9. 5。作为可作为间隔团而被导入到本发明的多孔性粒子中的含有氨基的糖(氨基糖)，并无特别限定，可以列举选自下组中的一种以上或者它们的盐酸盐等盐等葡糖胺、 半乳糖胺、r y/ ^ >、乳糖胺、岩藻糖胺、甘露糖胺、葡甲胺、阿洛糖胺、阿卓糖胺、核糖胺、阿拉伯糖胺、古洛糖胺、艾杜糖胺、塔罗糖胺、木糖胺、来苏糖胺、山梨糖胺、塔格糖胺、阿洛酮糖胺、果糖胺、亚氨基环多醇(iminocyclitol)、黏多醣类、糖蛋白类、透明质酸、肝素、 软骨素、4-硫酸软骨素、硫酸皮肤素、以及它们的D构型体、L构型体、消旋体等、含有这些糖作为构成成分的多糖、聚合物、糖脂等。其中，作为间隔团而被导入到本发明的多孔性载体中的糖，更优选为葡糖胺及其衍生物。
作为可作为间隔团而被导入到本发明的多孔性载体中的葡糖胺，并无特别限定， 更优选为D构型体。此外，对于可用于本发明的葡糖胺的制造方法，并无特别限定，可以通过将葡萄糖等进行化学修饰而得到，也可以使用甲壳类等的甲壳、几丁质、壳聚糖等来源的物质；用于精制抗体医药品时，优选为能够由植物性化合物等获得的葡糖胺，例如，协和发酵公司制造的被称作发酵葡糖胺的公知的物质等。此外，从溶解性的观点来看，可用于本发明的葡糖胺还优选为盐酸盐等盐。此外，作为可作为间隔团而被导入到本发明的多孔性载体中的糖或糖类似物的导入量，优选每ImL多孔性载体中，糖或糖类似物的导入量为1 μ mol以上且500ymol以下。 若每ImL多孔性载体中糖或糖类似物的导入量为1 μ mol以上，则将该多孔性载体用于吸附体时，目标物的吸附量变大，因此优选；若每ImL多孔性载体中糖或糖类似物的导入量为 500 μ mol以下，则可以抑制本发明的多孔性载体的制造成本，因此优选。进一步优选每ImL 多孔性载体中糖或糖类似物的导入量为2 μ mol以上且250 μ mol以下，更优选4 μ mol以上且125 μ mol以下，特别优选6 μ mol以上且50 μ mol以下，最优选8 μ mol以上且25 μ mol以下。可以通过在导入反应终止后对反应溶液中的糖或糖类似物的减少量进行测定的方法、 对反应后的多孔性载体进行滴定的方法(非水滴定等)、元素分析法等求出糖或糖类似物的导入量。此外，向含有甲酰基的多孔性粒子中导入可以作为间隔团而被导入的化合物时， 对于作为间隔团而被导入的化合物的用量并无特别限定，为了达到更适合的导入量，优选为多孔性载体中该官能团含量的0.01摩尔倍以上，和/或，从废液处理和效率的观点来看， 优选100摩尔倍以下；进一步优选0. 1摩尔倍以上且50摩尔倍以下；更优选0. 5摩尔倍以上且20摩尔倍以下；特别优选1摩尔倍以上且10摩尔倍以下。对于向多孔性粒子中导入作为间隔团而被导入的化合物时的溶剂，并无特别限定，可以使用水、二甲亚砜、二甲基甲酰胺、二氧杂戊环等常用的有机溶剂，乙醇、甲醇、丙醇等醇，以及选自上述中的2种以上的混合溶剂。此外，对反应液的pH并无特别限定，从反应效率的观点来看，优选在pH 3以上进行反应，基于官能团的失活、对多孔性载体的损害少的理由，优选PH为13以下，进一步优选 PH为4以上且12以下，特别优选pH为6以上且11以下，最优选pH为7以上且11以下。此外，对导入可以作为间隔团而被导入的化合物时的温度并无特别限定，基于对反应速度有利的理由，优选为0°c以上，从安全性和对载体的损害的观点来看，优选为 100°C以下，基于官能团不易失活的理由，进一步优选70°C以下，进一步优选4°C以上且 500C以下，更优选4°C以上且30°C以下，特别优选10°C以上且25°C以下，最优选12°C以上且 18°C以下。此外，优选一边搅拌或振动一边进行导入反应，对于每1分钟的转速或次数并无特别限定，基于可以均勻搅拌且不对载体产生物理损害的理由，优选1次以上且1000次以下，进一步优选10次以上且500次以下，更优选30次以上且300次以下，特别优选50次以上且200次以下，最优选75次以上且150次以下，特别优选结合各原料的比重之差及载体的强度进行适当调节。对于向多孔性载体中导入可作为间隔团而被导入的化合物的反应时间并无特别限定，基于反应性和对载体的损害较少的理由，优选0. 2小时以上且100小时以下，进一步
9优选0. 5小时以上且50小时以下，更优选1小时以上且M小时以下，特别优选2小时以上且15小时以下，最优选3小时以上且10小时以下，优选结合反应性、pH及反应温度进行调节。此外，通过向具有甲酰基的多孔性粒子中导入间隔团后对反应中未使用的多孔性粒子的甲酰基进行处理，可以得到本发明的多孔性载体。作为向具有甲酰基的多孔性粒子中导入间隔团后对反应中未使用的多孔性粒子的甲酰基进行处理的方法，并无特别限定，可以列举使用还原剂进行处理的方法、热处理方法、使用碱进行处理的方法、使用抗粘连剂进行处理的方法等。作为使用还原剂进行处理的方法，并无特别限定，优选使四氢硼酸钠等四氢硼酸盐发挥作用从而进行处理的方法。作为进行还原处理时的溶剂，并无特别限定，可以使用水、二甲亚砜、二甲基甲酰胺、二氧杂戊环等常用的有机溶剂，乙醇、甲醇、丙醇等醇，以及选自上述中的2种以上的混合溶剂。对于进行还原处理时的pH并无特别限定，从安全性的问题来看，优选PH为7以上。此外，为了减轻对载体及间隔团的损害，优选PH为12以下，进一步优选pH为9以上且 12以下，更优选pH为11以上且12以下。此外，对于还原处理温度并无特别限定，从有利于反应速度的观点来看，优选为 0°C以上，从安全性以及对载体和间隔团的损害的观点来看，优选为100°C以下。更优选4°C 以上且70°C以下，特别优选10°C以上且50°C以下，最优选10°C以上且40°C以下。对于还原处理的时间并无特别限定，基于官能团的失活和载体的损害少的理由， 优选0. 01小时以上且50小时以下，进一步优选0. 1小时以上且25小时以下，更优选0. 25 小时以上且10小时以下，特别优选0. 25小时以上且5小时以下，最优选0. 5小时以上且2 小时以下，优选结合反应性、PH及反应温度进行调节。对于还原次数并无特别限定，从向具有甲酰基的多孔性粒子中导入间隔团后对反应中未使用的多孔性粒子的甲酰基进行完全处理的观点来看，优选1次以上。此外，在20 次以下时，可减轻对载体和间隔团的损害。进一步优选2次以上且15次以下，更优选2次以上且10次以下，最优选3次以上且7次以下。对还原剂的浓度并无特别限定，从对甲酰基的处理效率的观点来看，优选0. 0001M 以上，从安全性的问题来看，优选2M以下，进一步优选0. 00IM以上且IM以下，更优选0. 0IM 以上且0. 5M以下，特别优选0. 02M以上且0. 25M以下，最优选0. 05M以上且0. IM以下。作为向具有甲酰基的多孔性粒子中导入间隔团后对反应中未使用的多孔性粒子的甲酰基进行热处理的方法，并无特别限定，从对反应速度有利的观点来看，优选50°C以上，从对载体和间隔团的损害的观点来看，优选150°C以下，进一步优选50°C以上且130°C 以下，更优选80°C以上且130°C以下。作为向具有甲酰基的多孔性粒子中导入间隔团后利用碱对反应中未使用的多孔性粒子的甲酰基进行处理的方法，对于PH并无特别限定，由于当pH为10以上时可实现高效率地处理，因此优选。为了减轻对载体和间隔团的损害，PH优选为13以下。更优选pH为 10以上且12以下，特别优选PH为11以上且12以下。作为向具有甲酰基的多孔性粒子中导入间隔团后利用封闭剂(封止剤)对反应中未使用的多孔性粒子的甲酰基进行处理的方法，并无特别限定，但优选封闭剂为含有与多孔性载体上的活性基团反应的官能团的低分子化合物。越是低分子化合物，则空间位阻越小，因此可以高效率地进行封闭反应(封止反応)。其中，优选使用含有氨基的低分子化合物，作为这类低分子化合物的一例，可以列举赖氨酸、甘氨酸、单乙醇胺和三(羟甲基)氨基甲烷等。作为向本发明的多孔性粒子中导入间隔团后向所述间隔团上导入甲酰基的方法， 可以列举过碘酸氧化法。对于可用于本发明的过碘酸和/或过碘酸盐等并无特别限定，优选使过碘酸钠或过碘酸钾等过碘酸盐发挥作用，从而导入甲酰基。此外，作为本发明的多孔性载体的甲酰基含量，每ImL多孔性载体中的甲酰基含量优选0. 5μπιο1以上且IOOymol以下。每ImL多孔性载体中的甲酰基含量为0. 5 μ mol以上时，可以高效率地将亲和配位体固定化，将其用作吸附体的情况下，对目标物的吸附量变大，因此优选。此外，尽管理由还不明确，令人意料之外的是，每ImL多孔性载体中的甲酰基含量为ΙΟΟμπιοΙ以下时，对目标物的吸附量较易变大，因此优选。此外，采用使过碘酸和/ 或过碘酸盐发挥作用而导入甲酰基的方法的情况下，每ImL多孔性载体中的甲酰基含量为 100 μ mol以下时，多孔性载体的强度较易变大，因此优选。每ImL多孔性载体中的甲酰基含量的更为优选的范围是Iymol以上且50 μ mol 以下，更优选ι μ mol以上且25 μ mol以下，特别优选1 μ mol以上且10 μ mol以下，最优选 2 μ mol以上且7μπι01以下。甲酰基含量并无特别限定，例如，可根据导入甲酰基反应的时间、温度、过碘酸和/或过碘酸盐等的甲酰化剂的浓度等，来调节甲酰基的含量。甲酰基含量的测定可通过下述方法进行向含有甲酰基多孔性载体中加入苯胼溶液，在40°C下搅拌1小时，通过UV测定反应后的上清液的吸收光谱，由苯胼的校正曲线测定苯胼的减少量，从而可求出甲酰基的含量。尽管理由还不确定，本发明人等经过深入研究后发现了下述结果，并基于该结果完成了本发明在加入酸而将PH调节至1 6范围的液体中，使过碘酸或其盐发挥作用而得到含有甲酰基的多孔性载体，并将含有氨基的配位体固定化于所得含有甲酰基的多孔性载体来获得吸附体时，令人感到意外的是，目标物的吸附量变大，此外，含有氨基的配位体的泄漏量变小。S卩，本发明提供吸附体的制造方法，该方法包括在加入酸而将pH调节至1 6范围的液体中，使过碘酸或其盐发挥作用而得到含有甲酰基的多孔性载体，在将含有氨基的配位体固定化于上述得到的含有甲酰基的多孔性载体。作为上述过碘酸的盐，并无特别限定，优选使用过碘酸钠或过碘酸钾等。此外，对于可用于本发明的上述酸并无特别限定，可以使用盐酸、硫酸、硝酸等无机酸或其盐等。此外，使用柠檬酸、乙酸、酒石酸、邻苯二甲酸、富马酸、油酸、乳酸、月桂酸等有机酸或其盐时，可以获得反应液的PH缓冲效果，因此更加优选。上述使过碘酸或其盐发挥作用的pH的范围优选为2 5。进一步优选为pH 2 4. 5，特别优选为pH 2 4。上述过碘酸或其盐的浓度优选为5mM以上且300mM以下。浓度在5mM以上时，较容易向载体中导入甲酰基，此外，浓度在300mM以下时，多孔性载体的强度不易减小，因此优选。上述过碘酸或其盐的浓度进一步优选为5mM以上且250mM以下，更优选为5mM以上且150mM以下。尽管理由还不确定，本发明人等经过深入研究后发现了下述令人意外的结果通过使过碘酸和/或过碘酸盐在o°c以上且10°C以下的温度发挥作用而得到含有甲酰基的多孔性载体，并将含有氨基的配位体固定化于所得含有甲酰基的多孔性载体来制造吸附体， 利用该制造方法制造的吸附体对目标物的吸附量变大。上述温度进一步优选为o°c以上且 8°C以下。本发明的多孔性载体的材质并无特别限定，可以列举例如多糖类、聚苯乙烯、苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇、以及它们的衍生物等。上述材质还可以涂层，所述涂层为甲基丙烯酸羟乙酯等具有羟基的高分子材料或由具有聚氧乙烯链的单体与其它聚合性单体形成的共聚物这样的接枝共聚物等。其中，由于容易向载体表面导入活性基团，因此优选使用多糖类、聚乙烯醇等。其中，本发明的多孔性载体进一步优选含有多糖类。多糖类容易在工业中获得，另外，对生物体的安全性高，因此优选。对于可用于本发明的多孔性载体的多糖类并无特别限定，可以列举例如琼脂糖、纤维素、糊精、壳聚糖、几丁质、以及它们的衍生物等。此外，本发明的多孔性载体进一步优选含有纤维素和/或纤维素衍生物。由于含有纤维素或纤维素衍生物的多孔性载体的机械强度较高且坚韧，因此被破坏而生成微粒等的情况较少，将其填充至柱中时，即使以高线速流通液体，也比较不易发生压紧化，因此优选。此外，从强度和成本的观点来看，本发明的多孔性载体的最优选材质为纤维素。多孔性载体被广泛用作以治疗用(医疗用)吸附体为首的各种色谱法用吸附体和亲和吸附体，特别是在抗体医药品精制领域，伴随着抗体医药品市场的不断扩张，精制的大规模化以及高线速化正积极展开。而伴随着精制的大规模化以及高线速化，有时需要增加精制所使用的吸附体、即多孔性载体(或多孔性粒子)的强度。作为增加多孔性载体(或多孔性粒子)强度的方法，并无特别限定，优选增加多孔性载体(或多孔性粒子)的基质含量(例如树脂含量)的方法等，从多孔性载体(或多孔性粒子)的细孔径不易变小的优点来看，进一步优选使交联剂发挥作用，以增大多孔性载体(或多孔性粒子)的强度。换言之， 本发明的多孔性载体(或多孔性粒子)优选经过交联。交联剂和交联反应条件并无特别限定，可以使用公知的技术进行交联。例如，可以通过使环氧氯丙烷、环氧溴丙烷、二氯丙醇等卤代醇，间苯二酚二缩水甘油醚、新戊二醇二缩水甘油醚、1，6_己二醇二缩水甘油醚、氢化双酚A 二缩水甘油醚、甘油二缩水甘油醚、三羟甲基丙烷二缩水甘油醚、对苯二甲酸二缩水甘油酯、邻苯二甲酸二缩水甘油酯、乙二醇二缩水甘油醚、二乙二醇二缩水甘油醚、丙二醇二缩水甘油醚等双官能以上的环氧化合物发挥作用来进行交联。使用上述交联剂增加多孔性载体(或多孔性粒子)的强度的方法并无特别限定， 从反应效率的观点来看，优选在碱性条件下，使上述交联剂对载体发挥作用。交联剂的投料方法并无特别限定，可以在反应初期就投入全部用量，也可以将其分为数次重复反应，此外，还可以使用滴液漏斗等一点点地投入交联剂，或者将多孔性载体投入添加了交联剂的反应容器中。对交联反应的溶剂并无特别限定，可以使用水、二甲亚砜、二甲基甲酰胺、二氧杂戊环等常用的有机溶剂，乙醇、甲醇、1-丙醇等醇类，或者上述中2种以上的混合溶剂。此外，为了提高反应效率，进一步优选与硼氢化钠等还原剂共存。对交联反应时的温度并无特别限定，基于对反应速度有利的理由，优选0°C以上， 和/或，从安全性以及对多孔性载体(或多孔性粒子)的损害的观点来看，优选100°c以下， 基于官能团不易失活的理由，进一步优选70°C以下。优选一边搅拌或振动一边进行交联反应，对于其每1分钟的转速或次数并无特别限定，基于可以均勻搅拌且不对多孔性载体(或多孔性粒子)产生物理损害的理由，优选每 1分钟1次以上且1000次以下，进一步优选10次以上且500次以下，更优选30次以上且 300次以下，特别优选50次以上且200次以下，最优选75次以上且150次以下，优选结合各原料的比重之差及多孔性载体(或多孔性粒子)的强度进行调节。对交联反应的时间并无特别限定，基于官能团失活以及对载体损害少的理由，使用卤代醇的情况下，优选1小时以上且8小时以下，使用双官能以上的环氧化合物的情况下，优选1小时以上且低于15小时，进一步优选结合交联剂的反应性、PH及反应温度进行调节。此外，本发明优选在下述水溶液中，将含有氨基的配位体固定化于含有甲酰基的多孔性载体，所述水溶液包含选自羧酸盐、金属卤化物及硫酸盐中的1种以上化合物，且以羧酸盐为必要成分。作为上述羧酸盐并无特别限定，可以使用例如乙酸钠、乳酸钠、乳酸钙、柠檬酸钠、 酒石酸氢钾、油酸钾、月桂酸钠、苯二甲酸钠、苯二甲酸钾、富马酸钠、富马酸钾、酒石酸钠、 酒石酸钾等，特别优选柠檬酸钠。上述羧酸盐在水溶液中的浓度并无特别限定，优选0. OlM以上且5M以下。若在 0. OlM以上，则容易增大配位体的固定化量，因此优选；从制造成本的观点来看，优选5M以下。上述羧酸盐水溶液的浓度进一步优选0. 05M以上且3M以下，更优选0. IM以上且1. 5M 以下，特别优选0. 25M以上且IM以下，最优选0. 4M以上且0. 8M以下。对上述金属卤化物并无特别限定，优选使用例如氯化锂、氯化钠、氯化钾、氯化钙、 氯化镁等。此外，对上述金属卤化物在水溶液中的浓度并无特别限定，优选0. 00IM以上且 IM以下。若在0. 005M以上，则目标物的吸附量变大，因此优选；从成本的观点来看，优选在 IM以下。上述金属卤化物在水溶液中的浓度进一步优选为0. OlM以上且0. 75M以下，更优选0. 05M以上且0. 5M以下，特别优选0. 075M以上且0. 5M以下。此外，本发明人等发现作为更优选的实施方式，在含有柠檬酸盐和/或硫酸盐的反应液中，将含有氨基的配位体固定化于含有甲酰基的多孔性载体上时，与使用不含有柠檬酸盐和/或硫酸盐的反应液的情况相比，含有氨基的配位体的固定化量和/或固定化率变大。这一点可适用于本发明。对于可用于本发明的柠檬酸盐或硫酸盐并无特别限定，作为柠檬酸盐，可以列举例如柠檬酸单钠、柠檬酸单钾等柠檬酸单碱金属盐，柠檬酸二钠、柠檬酸二钾等柠檬酸二碱金属盐，柠檬酸三钠、柠檬酸三钾等柠檬酸三碱金属盐，柠檬酸单铁钠、柠檬酸铁、柠檬酸铁铵、柠檬酸钾、异柠檬酸或其盐等，其中，上述化合物可以单独使用1种，也可以使用2种以上，此外，还可以使用其水合物、酸酐。作为硫酸盐，可以使用例如硫酸锂、硫酸钠、硫酸钾等碱金属硫酸盐，此外，还可以使用其水合物、酸酐。此外，在含有上述柠檬酸盐和/或硫酸盐的反应液中，还可以其它包含其它物质， 作为其它物质，可以列举例如氯化钠、氯化钾、碳酸盐、磷酸盐、乙酸、乙酸钠等乙酸盐、三乙胺等胺类等。此外，在本发明的制造方法中，对上述反应液中的柠檬酸和/或硫酸盐的浓度没有特别限定，优选为0. 01 2M。柠檬酸和/或硫酸盐的浓度在0. OlM以上时，配位体的固定化量和/或固定化率变大，因此优选。此外，柠檬酸和/或硫酸盐的浓度在2M以下时，可缩减成本并且使反应液的粘度降低，因此优选。柠檬酸和/或硫酸盐的浓度进一步优选为 0. 05 1. 9M,更优选0. 1 1. 7M,特别优选0. 25 1. 5M,最优选0. 4 1M。此外，对上述含有柠檬酸盐和/或硫酸盐的反应液中可以含有的其它所述其它物质的浓度并无特别限定，优选为0. 001 1M。上述其它物质的浓度在0. OOlM以上时，吸附体的各种性能均改善，因此优选。此外，上述其它物质的浓度在IM以下，可缩减成本并且使反应液的粘度降低，另外还容易显示出柠檬酸和/或硫酸盐所带来的效果，因此优选。上述其它物质的浓度进一步优选为0. 005 0. 7M，更优选0. 01 0. 5M，特别优选0. 05 0. 5M， 最优选0. 1 0. 25M。此外，在本发明的制造方法中，上述反应液的PH并无特别限定，优选为7 13。上述反应液的PH为7以上时，配位体的固定化量和/或固定化率增大，因此优选。此外，上述反应液的PH在13以下时，对吸附体的基体材料及配位体的损害较少，因此优选。此外，在pH为11. 5以上且低于13. 0的反应液中将含有氨基的配位体固定化于含有甲酰基的多孔性载体时，可使含有氨基的配位体的固定化量和/或固定化率变大，因此进一步优选。PH更优选为11. 5以上且低于12. 6，特别优选11. 5以上且低于12. 3，最优选 11. 6以上且低于12. 1。可以使用由pH为3 5、6 7、9 10的标准溶液进行3点校正的PH计来进行pH的测定。此外，本发明人等经过深入研究，还发现了下述的令人意外的结果在通过亚氨基化及其还原反应这两步反应来进行将含有氨基的配位体固定化于含有甲酰基的多孔性载体时，与未实施稳定化操作的情况相比，在亚氨基化反应之后实施稳定化操作的情况下，在用作吸附体时能够增大对目标物的吸附量。S卩，本发明还提供一种吸附体的制造方法，其包括通过亚氨基化及其还原反应这两步反应来进行将含有氨基的配位体固定化于含有甲酰基的多孔性载体，并在亚氨基化反应之后实施稳定化操作。本发明中的亚氨基化反应之后的稳定化操作，是指在亚氨基化反应之后，将反应液的PH调节为还原反应的pH士 1以内，并在不加入还原剂的情况下进行搅拌、振荡或放置。此外，对上述稳定化操作的时间并无特别限定，优选为1小时以上且48小时以内。 稳定化时间在1小时以上时，可进一步增大吸附体对目标物的吸附量，因此优选；稳定化时间在48小时以内时，从制造成本的观点考虑更为优选。稳定化时间进一步优选在1小时以上且M小时以内，更优选1小时以上且15小时以内，特别优选2小时以上且15小时以内。此外，所述亚氨基化反应后的稳定化操作，优选在pH为2 10的条件下实施。稳定化操作的PH为2以上时，从制造装置的耐久性和安全性的观点来看优选，pH为10以下时，可进一步增大吸附体对目标物的吸附量，因此优选。稳定化操作的PH进一步优选为2 9，更优选2 8。此外，从pH稳定性的观点来看，本发明的亚氨基化反应、稳定化操作、还原反应优选在缓冲液中进行。对可以在本发明中使用的缓冲液并无特别限定，优选使用现有公知的缓冲液。此外，上述缓冲液优选含有至少1种以上能够具有二价以上阴离子的盐。尽管理由还不确定，但令人感到意外的是，当本发明的亚氨基化反应、稳定化操作、还原反应在含有至少1种以上能够具有二价以上阴离子的盐的缓冲液中进行时，可使含有氨基的配位体的固定化量进一步增加，因此优选。作为能够具有二价以上阴离子的盐，并无特别限定，可以使用例如柠檬酸盐、草酸盐、苯二甲酸盐、琥珀酸盐、苹果酸盐、乙二胺四乙酸盐等多元羧酸盐、磷酸盐、硫酸盐、碳酸盐等。对缓冲液中能够具有二价以上阴离子的盐的浓度并无特别限定，优选0. OlM以上且5M以下。当其浓度在0. OlM以上时，容易增大配位体的固定化量，因此优选；当其浓度在 5M以下，从制造成本的观点来看优选。上述羧酸盐在水溶液中的浓度进一步优选为0. 05M 以上且3M以下，更优选0. IM以上且1. 5M以下，特别优选0. 25M以上且IM以下，最优选0. 4M 以上且0. 8M以下。此外，上述缓冲液进一步优选含有多元羧酸盐和/或中性盐。作为中性盐，没有特别限定，可以列举例如硫酸钠、氯化钠、硝酸钠、氯化钾、氯化锂、氯化镁、氯化钙等。此外，上述缓冲液更优选含有柠檬酸盐。作为柠檬酸盐，并无特别限定，可以列举例如柠檬酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸锂等。此外，上述含有柠檬酸盐的缓冲液优选含有金属卤化物和硫酸盐中的至少一种以上。对上述金属卤化物并无特别限定，优选使用例如氯化锂、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁等。此外，对上述金属卤化物和/或硫酸盐在缓冲液中的浓度并无特别限定，优选0. OOlM 以上且IM以下。当浓度为0.005M以上时，对目标物的吸附量增大，因此优选，当浓度为IM 以下时，从成本的观点来看优选。进一步优选为0. OlM以上且0. 5M以下，更优选0. 05M以上且0. 75M以下，特别优选0. 075M以上且0. 5M以下，最优选0. IM以上且0. 3M以下。此外，本发明人等还发现了下述令人意外的结果在将含有氨基的配位体固定化于含有甲酰基的多孔性载体时，如果通过有机硼烷络合物使配位体的固定化键稳定化并同时使其余的甲酰基钝化，则吸附体对目标物的吸附量增大。即，本发明还涉及吸附体的制造方法，其中，在将含有氨基的配位体固定化于含有甲酰基的多孔性载体时，通过有机硼烷络合物，使配位体的固定化键稳定化并同时使其余的甲酰基钝化。这里，所述其余的甲酰基，是指多孔性载体上的甲酰基中，在固定化含有氨基的配位体时未被使用的残留的甲酰基。若所述其余的甲酰基未被钝化，则在将多孔性载体用作吸附体时，可能会引起非特异吸附。尽管本发明中使用了通常作为较弱还原剂使用的有机硼烷络合物，但本发明的特征在于即使未使用在使用弱还原剂时通常被用作钝化剂的含有氨基的低分子量化合物 (例如，单乙醇胺、甘氨酸、三(羟甲基)氨基甲烷等)、所谓的抗粘连剂，也能够使其余的甲
酰基钝化。此外，在含有羧酸盐的反应液中实施通过上述有机硼烷络合物使配位体的固定化键稳定化并同时使其余的甲酰基钝化的操作时，能够进一步促进配位体的固定化键的稳定化以及其余的甲酰基的钝化，因此优选。对于可用于本发明的羧酸盐并无特别限定，可以列举例如乙酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、苯二甲酸盐、琥珀酸盐、苹果酸盐、乙二胺四乙酸盐等，作为这些羧酸盐的阳离子种类，并无特别限定，可以使用例如锂、钠、钾、镁、钙等。其中，从成本的观点来看， 可优选使用柠檬酸盐，特别是柠檬酸的碱金属盐。此外，对羧酸盐在反应液中的浓度并无特别限定，当其浓度在0. OlM以上时，可以进一步促进配位体的固定化键的稳定化以及其余的甲酰基的钝化，因此优选。此外，当羧酸盐的浓度在2M以下时，不仅可以降低成本，而且可以降低反应液的粘度，此外，从操作性方面来看，也更为优选。羧酸盐的浓度进一步优选为0. 05 1. 9M,更优选0. 1 1. 7M,特别优选0. 25 1. 5M,最优选0. 4 IM0此外，上述应液中可以含有除羧酸盐以外的其它物质，例如，优选含有金属卤化物和硫酸盐中的至少一种以上。对上述金属卤化物并无特别限定，可优选使用例如氯化锂、 氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁等。此外，对上述金属卤化物和/或硫酸盐在缓冲液中的浓度并无特别限定，优选为0. OOlM以上且IM以下。当其浓度在0. 005M以上时，对目标物的吸附量变大，因此优选，当其浓度在IM以下时，从成本的观点来看优选。其浓度进一步优选为0. OlM以上且0. 5M以下，更优选为0. 05M以上且0. 75M以下，特别优选为0. 075M以上且 0. 5M以下，最优选为0. IM以上且0. 3M以下。此外，通过上述有机硼烷络合物使配位体的固定化键稳定化并同时使其余的甲酰基钝化的操作，优选实施1小时以上且48小时以下。上述操作实施1小时以上时，可进一步促进配位体的固定化键稳定化以及其余的甲酰基的钝化，因此优选；从制造成本的观点来看，上述操作优选实施48小时以下。上述操作时间进一步优选为2小时以上且M小时以下，更优选3小时以上且20小时以下，特别优选4小时以上且15小时以下，最优选5小时以上且10小时以下。此外，作为可用于本发明的上述有机硼烷络合物，并无特别限定，尽管理由尚不明确，令人感到意外的是上述有机硼烷络合物为胺合硼烷络合物(包括氨基硼烷)时，更容易促进其余的甲酰基钝化，因此优选。作为可用于本发明的氨基硼烷络合物，并无特别限定，可以列举例如4-( 二甲基氨基)吡啶硼烷、N-乙基二异丙基胺合硼烷、N-乙基吗啉硼烷、N-甲基吗啉硼烷、N-苯基吗啉硼烷、二甲基吡啶硼烷、三乙胺硼烷、或三甲基胺合硼烷、 4-( 二甲基胺)吡啶硼烷、N-乙基二异丙基胺合硼烷、N-乙基吗啉硼烷、N-甲基吗啉硼烷、 N-苯基吗啉硼烷、二甲基吡啶硼烷、硼烷氨、二甲胺硼烷、吡啶硼烷、4-甲基吡啶硼烷、N’， N-二乙基苯胺硼烷、N’，N-二异丙基乙基胺硼烷、2，6_ 二甲基吡啶硼烷、硼烷合胺、三(二甲基氨基)硼烷、三甲基氨基硼烷、环硼氮烷、1，3，5_三甲基环硼氮烷、2，4，6_三甲基环硼氮烷、六甲基环硼氮烷等。其中，从在反应液中的溶解性和安全性的观点来看，特别优选二甲胺硼烷。此外，本发明的亚氨基化反应、稳定化操作、还原反应的操作温度优选为-10 40°C。上述操作温度在-10°C以上时，从反应液的流动性的观点来看进一步优选；上述操作温度在40°C以下时，亲和配位体和多孔性载体的甲酰基不易失活，因此进一步优选。操作温度进一步优选为-5 35°C，更优选为0 30°C。此外，每ImL多孔性载体中，本发明吸附体中的亲和配位体的导入量优选为Img以上且500mg以下。每ImL多孔性载体的亲和配位体的导入量为Img以上时，对目标物的吸
16附量增大，因此优选；在500mg以下时，可使生产成本得到抑制，因此优选。每ImL多孔性载体的亲和配位体的导入量进一步优选为ang以上且120mg以下，更优选为:3mg以上且60mg 以下，特别优选为^ig以上且30mg以下，最优选为^ig以上且15mg以下。此外，每ImL多孔性载体中，本发明吸附体中的亲和配位体的导入量优选为 0. 01 μ mol以上且15 μ mol以下。每ImL多孔性载体的亲和配位体的导入量为0. 01 μ mol 以上时，对精制目标物的吸附量增大，因此优选；在15 μ mol以下时，可使生产成本得到抑制，因此优选。每ImL多孔性载体的亲和配位体的导入量进一步优选为0. 03 μ mol以上且 5 μ mol以下，更优选0. 05 μ mol以上且2 μ mol以下，特别优选0. 1 μ mol以上且0. 75 μ mol 以下，最优选0. 1 μ mol以上且0. 5 μ mol以下。通过测定固定化反应后的反应液上清液中来自亲和配位体的吸光度，可以求出亲和配位体的导入量。此外，可以采用元素分析法求出亲和配位体的导入量。例如，对于含有氨基的亲和配位体而言，通过对吸附体进行N含量分析，可以测定亲和配位体的导入量。作为用于治疗用(医疗用)吸附体或抗体医药品精制用吸附体等情况下的亲和配位体，并无特别限定，可以列举例如对抗体显示高度特异性的抗原或蛋白质、蛋白质G、L 或其变异体、具有抗体结合活性的肽等。特别是，作为可以特异性地吸附、洗脱免疫球蛋白 (IgG)等的吸附体，受到关注的是将蛋白质A作为亲和配位体固定化于载体而得到的吸附体。备受关注的是将固定化有蛋白质A的吸附体用作风湿病、血友病、扩张型心肌病的治疗用吸附体。此外，在抗体医药精制领域，期待一种能够以大规模、高速以及低成本实现对IgG 等抗体的精制的吸附体。由上述观点来看，本发明的吸附体优选为导入了作为亲和配位体的蛋白质A的吸附体。对于可用于本发明的蛋白质A并无特别限定。可以不受限制地使用天然物、基因重组物等。此外，还可以使用含有抗体结合位点及其变异体、融合蛋白等。此外，也可以使用由菌体提取物或培养上清液、通过组合使用和/或重复进行下述精制法而之比的蛋白质 A，所述精制法选自利用了下述技术的分子量分级、分级沉淀法等方法离子交换色谱法、疏水性相互作用色谱法、凝胶过滤色谱法、羟基磷灰石层析法等各种色谱法以及膜分离技术。 特别优选通过国际公开专利公报W02006/004067、美国专利公报US5151350中所述方法得到的蛋白质A。此外，使用本发明的吸附体进行精制时，从吸附体洗脱到目标物中的配位体浓度的第一次精制 第三次精制的平均值优选为50ppm以下。当洗脱到目标物中的配位体浓度的第一次精制 第三次精制的平均值在50ppm以下时，可以提高治疗和精制的安全性，还可以提高目标物的纯度，而且可以减轻精制中后续工序的繁琐程度，因此优选。洗脱到目标物中的配位体浓度进一步优选为Oppm以上且40ppm以下，更优选Oppm以上且30ppm以下， 特别优选Oppm以上且25ppm以下，最优选Oppm以上且20ppm以下。洗脱到目标物中的配位体浓度可以按照Steindl F. et al. ,Journal of Immunological Methods,Vol. 235(2000), 61-69中记载的方法求出。为了进一步减少本发明的吸附体中含有氨基的配位体的泄漏量，优选对吸附体进行清洗。对清洗剂和清洗方法并无特别限定，优选使用含有选自水、乙酸、醇、各种有机溶剂、pH2 5的液体、pH8 13的液体、氯化钠、氯化钾、乙酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、缓冲剂、表面活性剂、尿素、胍、胍盐酸盐、其它再生剂等中的至少1种溶液等进行通液，或者投入上述溶液等并进行搅拌。此外，使用同种或者不同溶液进行数次清洗时，可以进一步减少配位体的泄漏量，因此优选。此外，每ImL吸附体中，本发明吸附体对目标物的吸附量优选为Img以上。若每 ImL吸附体对目标物的吸附量在Img以上，则可以实现高效率的精制，因此优选。此外，若每ImL吸附体对目标物的吸附量在IOOmg以下，则吸附的目标物容易从吸附体上洗脱，因此优选。每ImL吸附体中，吸附体对目标物的吸附量进一步优选为5mg以上且90mg以下，更优选IOmg以上且80mg以下，特别优选20mg以上且70mg以下，最优选30mg以上且60mg以下。可以按照下述方法求出目标物的吸附量。作为求算目标物吸附量的方法，并无特别限定，可以通过静态吸附量或动态吸附量求出。例如，测定静态吸附量的情况下，对于以 PH7. 4的磷酸缓冲液(Sigma公司制造)置换的吸附体0. 5mL,使其与将70mg的目标物溶解于35mL的pH7. 4的磷酸缓冲液(Sigma公司制造)中而得到的溶液接触，并在25°C搅拌2 小时，然后通过测定上清液中目标物的减少量来求算目标物的吸附量。优选本发明的吸附体在压缩5%时的压缩应力为0. OlMPa以上且IMPa以下、压缩 10%时的压缩应力为0. 03MPa以上且3MPa以下、压缩15%时的压缩应力为0. 06MPa以上且 5MPa以下。当吸附体压缩5%时的压缩应力为0. OlMPa以上、压缩10%时的压缩应力为 0. 03MPa以上、以及压缩15%时的压缩应力为0. 06MPa以上时，容易获得在高线速进行通液时也不会产生压紧化的吸附体，因此优选。此外，若吸附体压缩5%时的压缩应力为IMPa以下、压缩10%时的压缩应力为3MPa以下、以及压缩15%时的压缩应力为5MPa以下，则其脆性提高，可以抑制微粒子的产生，因此优选。此外，压缩应力进一步优选为压缩5%时的压缩应力为0. 02MPa以上且IMPa以下、压缩10%时的压缩应力为0. 06MPa以上且3MPa以下、以及压缩15%时的压缩应力为 0. 09MPa以上且5MPa以下。压缩应力最优选为压缩5%时的压缩应力为0. 04MPa以上且 IMPa以下、压缩10%时的压缩应力为0. 08MPa以上且3MPa以下、压缩15%时的压缩应力为 0. IlMPa以上且5MPa以下。这里，所述压缩5%时的压缩应力，是指吸附体被压缩至体积较初始体积减少5% 时的应力；所述压缩10%时的压缩应力，是指吸附体被压缩至体积较初始体积减少10%时的应力；所述压缩15%时的压缩应力，是指吸附体被压缩至体积较初始体积减少15%时的应力。所述初始体积是指，对含有吸附体的浆料施以振动的同时，使其发生沉降填充，直至达到吸附体的体积不再减少的状态时的体积。此外，对于本发明吸附体的单位填充体积中的树脂含量并无特别限定，优选2%以上且50%以下。当单位填充体积的树脂含量为2%以上时，可以得到即使以大规模、高线速进行精制也不会产生压紧化的吸附体，因此优选。此外，单位填充体积的树脂含量在50%以下时，可以确保能够使精制目标物通过的充分的孔，因此优选。此外，单位填充体积的树脂含量进一步优选的范围是3%以上且25%以下，更优选4%以上且15%以下。对于单位填充体积的树脂含量而言，通过调节多孔性载体的量，使其沉降并填充直至多孔性载体的体积不再减少时，多孔性载体的体积为lmL。将该载体在105°C干燥12 小时，可以由ImL凝胶的干燥重量(g)求出ImL凝胶的干燥重量百分比，即树脂含量。
此外，对于本发明的吸附体，其体积平均粒径优选为20μπι以上且ΙΟΟΟμπι以下。 多孔性载体的体积平均粒径在20 μ m以上时，不易产生压紧化，因此优选，体积平均粒径在 ΙΟΟΟμπι以下时，用于吸附体时对目标物的吸附量变大，因此优选。多孔性载体的体积平均粒径进一步优选的范围是30 μ m以上且250 μ m以下，更优选40 μ m以上且125 μ m以下，特别优选50 μ m以上且100 μ m以下，最优选60 μ m以上且85 μ m以下。可以通过测定随机选取的100个多孔性载体的粒径来求算体积平均粒径。各个多孔性载体的粒径，可以通过下述方法测定拍摄各个多孔性载体的显微镜照片，以电子数据的形式保存，并利用粒径测定软件(Media Cybernetics公司制造的Image-Pro Plus)进行测定。通过本发明的吸附体和/或本发明的制造方法制造的吸附体，可以用于使用亲和色谱法对各种目标物进行的精制、非专利文献3中公开的各种精制方法、以及治疗用(医疗用)吸附体。精制方法和治疗方法并无特别限定，优选使用非专利文献1、2、3以及其它公知方法。此外，本发明的吸附体可实现对目标物的大规模、高速且低成本地精制。因此，使用本发明的吸附体进行精制或治疗时，优选使用直径为0. 5cm以上且高度为3cm以上的柱。 柱的直径为0. 5cm以上且高度为3cm以上时，可以高效率地进行精制或治疗。此外，从精制或治疗的精度和效率的观点来看，柱的大小优选直径为2000cm以下且高度为5000cm以下。柱的大小进一步优选直径为2cm以上且200cm以下、高度为5cm以上且300cm以下，更优选直径为5cm以上且100cm以下以及高度为8cm以上且150cm以下，特别优选直径为IOcm以上且85cm以下以及高度为12cm以上且85cm以下，最优选直径为20cm以上且 85cm以下以及高度为14cm以上且:35cm以下。此外，使用本发明的吸附体进行治疗或精制时，优选包括以lOOcm/h以上的线速进行通液的工序。若具有以lOOcm/h以上的线速进行通液的工序，则可以高效率地进行治疗或精制，因此优选。此外，从治疗或精制的精度和装置的耐久性的观点来看，使用本发明的吸附体进行治疗或精制时，优选以lOOOcm/h以下的线速进行。精制的线速进一步优选为 150cm/h以上且800cm/h以下，更优选250cm/h以上且750cm/h以下，特别优选300cm/h以上且700cm/h以下，最优选:350cm/h以上且700cm/h以下。与未使用本发明技术方案的情况相比，本发明的多孔性载体、使用该多孔性载体的吸附体、它们的制造方法以及使用它们的精制方法，可以实现高速的精制，提供纯度高且安全性高的精制产品。
实施例以下，针对本发明的实施例进行说明，但本发明并不限定于这些实施例。需要说明的是，对于反应投料时的多孔性粒子以及多孔性载体的体积，若无特别记载，是指自然沉降体积。自然沉降体积是指，将由多孔性载体和RO水形成的浆料投入计量容器中，在无振动的状态下静置2小时以上，直至体积不再减少时的体积。此外，对于官能团含量中的多孔性载体的体积，若无特别记载，是指将由多孔性载体和RO水形成的浆料投入计量容器中，施以振动的同时使其沉降，直至体积不再减少时的状态下的体积。(甲酰基含量的测定)甲酰基含量是指，使以pH 8的0. IM磷酸缓冲液置换后的多孔性载体(或多孔性粒子)2mL与溶解了苯胼的pH 8的0. IM磷酸缓冲液溶液2mL接触，在40°C搅拌1小时，通过UV测定对反应液的上清液在278nm附近最大吸收处的吸光度进行测定，由此可估算出苯胼在多孔性载体(或多孔性粒子)的吸附量。此时，使苯胼的投料量为预想的甲酰基含量的 3摩尔倍，而在多孔性载体(或多孔性粒子)中的吸附量为苯胼投料量的15%以下或45% 以上的情况下，要重新调整苯胼的投料量，再次进行测定。(压缩应力的测定)向内径为15mm的玻璃制量筒中投料多孔性粒子或吸附体占50Vol%的浆料。对多孔性粒子或吸附体的量进行调节，使得在边对玻璃制量筒施以振动边使浆料发生沉降填充直至多孔性粒子或吸附体的体积不再减少时，多孔性粒子或吸附体的体积达到4mL。将此时的体积视为初始体积。将金属制活塞(加工成不会与量筒的内壁发生摩擦、且不会使多孔性粒子或吸附体洗脱的形态)安装在装载有20N用负载传感器的自动绘图仪(SHIMADZU制 EZ-TEST)上。使活塞的底面与相当于多孔性粒子或吸附体的120vOl%的位置对齐。为了不产生气泡，以5mm/min的试验速度使活塞下降，压缩多孔性粒子或吸附体使其体积减少， 以测定任意点的压缩应力。(葡糖胺固定化量的定量)将多孔性载体ImL转移至玻璃过滤器(TOP公司制造的3G4)，使用凝胶3倍量的 0. OlN氢氧化钠溶液置换3次，使用凝胶3倍量的RO水清洗6次。然后，进行5分钟抽吸过滤(抽吸干燥)，用乙酸(和光纯药工业制造)进行置换。使用非水滴定用乙酸(和光纯药工业制造)将置换后的凝胶转移至50mL烧杯中，并稀释、“r"、至30mL。使用电位差自动滴定装置(KEM公司制造AT-610)，以0. 004N高氯酸/乙酸(使用非水滴定用乙酸对 0. IM高氯酸/乙酸溶剂进行稀释和光纯药工业制造)对其滴定，求出葡糖胺固定化量。(动态吸附量、以及泄漏到目标物中的配位体浓度的测定)(1)制备溶液以pH7. 4的磷酸缓冲液(Sigma公司制造)作为A液、以pH3. 5的35mM乙酸钠作为B液(使用和光纯药工业公司制造的乙酸、乙酸钠和RO水配制而成)、以IM乙酸(使用和光纯药工业公司制造的乙酸和RO水配制而成)作为C液、以lmg/mL的人多克隆IgG溶液(使用Baxter公司制造的Gammagard与A液配制而成)作为D液、以6M尿素作为E液、 以添加了相对于A液为0. 2Vol%的表面活性剂(和光纯药工业公司制造的聚氧乙烯00) 失水山梨醇单月桂酸酯)的溶液作为F液、制备2M的三(羟甲基)氨基甲烷(使用Sigma 公司制造的三(羟甲基)氨基甲烷和RO水配制而成)作为中和液，并在使用前对各溶液实施脱泡。(2)填充、准备使用AKTAexplorer 100 (GE Healthcare Bioscienc 公司制造)作为柱色谱法用装置，在直径0. 5cm、高度15cm的柱中安装22 μ m的网筛，分别装入本发明的吸附体3mL，以 450cm/h的线速通液20%的乙醇水溶液(使用和光纯药工业公司制造的乙酸和RO水配制而成)1小时进行填充。在馏分收集器中设置15mL的采样用试管，预先在溶出液的采样用试管中装入中和液。(3) IgG 的精制以300cm/h的线速通液A液9mL，然后，边监测UV边以300cm/h的线速通液D液，
20直至10%的IgG穿透(破過)。然后，以300cm/h的线速通液A液30mL，以300cm/h的线速通液B液30mL，使IgG洗脱。然后以300cm/h的线速通液C液9mL，并以300cm/h的线速通液E液9mL。继续重复进行2次吸附体填充终止后的操作2次，由此求出溶出液中的IgG 量和向IgG中泄漏的配位体浓度。(制造例1)使用90 μ m的网筛(NONAKA RIKAKI制，线径63 μ m)和分级机(筒井理化学器械公司制造的300-MM)，对体积平均粒径为92 μ m、树脂含量为6%、分子量排阻极限为5000万的多孔性纤维素粒子(Chisso公司制造的CK-A)进行湿式分级2小时，得到体积平均粒径为83 μ m的多孔性粒子A。向2. 3L的多孔性粒子A中加入RO水，使其体积为2. 78L，再将其转移至可拆卸式烧瓶中。向其中加入4N NaOH(使用和光纯药工业公司制造和RO水进行调整)0. 246L。此外，加入硼氢化钠3. 3g，并在水槽中升温至40°C。向其中加入含有作为交联剂的丙三醇多缩水甘油醚的Denacol EX314(Nagase Chemtex公司制造)1. 64L，在40°C搅拌5小时。反应终止后，一边在玻璃过滤器(TOP公司制造的^G-幻上进行抽滤，一边用多孔性粒子20 倍体积量的RO水清洗，得到交联多孔性粒子。该交联多孔性粒子在压缩5%时的压缩应力为0. 020MPa、压缩10%时的压缩应力为0. 049MPa、压缩15%时的压缩应力为0. 080MPa。向得到的交联多孔性粒子中加入RO 7jC,使其总量为交联多孔性粒子的2倍体积量，加入到玻璃制烧杯(IL)中，以2片铝箔封口，使用高压釜(Mkura公司制造的高压灭菌器Neoclave)在120°C加温40分钟。自然冷却至室温后，在玻璃过滤器(TOP公司制造的 ^GD上以多孔性粒子5倍体积量的RO水进行清洗，得到环氧基转变成了甘油基的交联多孔性粒子。然后，向上述经过高压釜加温后的多孔性粒子2. 3L中加入RO水至体积为2. 78L， 将其转移至可拆卸式烧瓶中。向其中加入4N-NaOH (使用和光纯药工业公司制造与RO水进行调整)0. 246L。此外，加入硼氢化钠3. 3g，在水槽中升温至40°C。向其中加入Denacol EX314 (Nagase Chemtex公司制造)1. 64L，在40°C搅拌5小时。反应终止后，一边在玻璃过滤器(TOP公司制造^GD上进行抽滤，一边用多孔性粒子20倍体积量的RO水清洗，得到交联多孔性粒子。该交联多孔性粒子在压缩5%时的压缩应力为0. 020MPa、压缩10%时的压缩应力为0. 049MPa、压缩15%时的压缩应力为0. 080MPa。向得到的交联多孔性粒子中加入RO水，使其总量为交联多孔性粒子的2倍体积量，加入到玻璃制烧杯(IL)中，以2片铝箔封口，使用高压釜(Mkura公司制造的高压灭菌器Neoclave)在120°C加温40分钟。自然冷却至室温后，在玻璃过滤器(TOP公司制造 26G-2)所以多孔性粒子5倍体积量的RO水进行清洗，得到多孔性粒子B。(实施例1)向制造例1的多孔性粒子B 523mL中加入RO水，使其总量为784. 5mL,加入到2L 的可拆卸式烧瓶中，并将该烧瓶安装在25°C的恒温槽(Tomas科学公司制造的恒温水浴锅 T-2S)中。然后，将过碘酸钠(和光纯药工业制造)溶解于RO水中，制备11.5mg/mL的过碘酸钠水溶液523mL，将该溶液加入可拆卸式烧瓶中，在25°C以120rpm的转速搅拌1小时。反应后，在玻璃过滤器(TOP公司制造的^GD上以RO水进行清洗，直至滤液的电导率达到 5μ S/cm以下。随后向得到的多孔性粒子中加入RO水，使其总量为784. 5mL，将其加入到可拆卸式烧瓶中，并将该可拆卸式烧瓶安装在25°C恒温槽(Tomas科学公司制造的恒温水浴锅T-2Q中。然后，将过碘酸钠(和光纯药工业制造)溶解在RO水中，制备11. 5mg/mL的过碘酸钠水溶液，将523mL该溶液加入到可拆卸式烧瓶中，在25°C以120rpm的转速搅拌1小时(Mazela Z)。反应后，在玻璃过滤器(TOP公司制造的^Gj)上进行清洗，直至清洗滤液的电导率达到5 μ S/cm以下，从而得到多孔性粒子C。使用电导率计(EUTECH INSTRUMENTS 制造的ECTestrlO pure+)测定清洗滤液的电导率。利用上述方法测定所得多孔性粒子C 的甲酰基含量，结果显示每ImL多孔性粒子C中的甲酰基含量为68μπι01。然后，在可拆卸式烧瓶的1042mL处做标记，并使用RO水将所得多孔性粒子C 521mL转移。将其安装在15°C的恒温槽(Tomas科学公司制造恒温水浴锅T-2S、投入冷却装置ADVANTEC TBC120DA)中，放置反应溶液直至达到15°C。确认反应液到达15°C后，向其中加入多孔性粒子C的甲酰基含量的10摩尔倍的发酵葡糖胺K (协和发酵公司制造)，并加入氢氧化钠溶液使其PH达到11。然后，一边使用4N氢氧化钠微调pH至11，一边加入RO水， 使反应液的总体积达到1042mL，在15°C以120rpm的转速搅拌5小时。随后，加入2. 96g硼氢化钠(和光纯药工业公司制造)，搅拌1小时同时使其反应。 反应后，在玻璃过滤器(TOP公司制造的^GD上以多孔性粒子20倍体积量的RO水进行清洗。将清洗后的凝胶加入可拆卸式烧瓶中，补足RO水直至达到可拆卸式烧瓶的1042mL 标记处，加入2. 96g硼氢化钠，在25°C搅拌1小时。反应后，在玻璃过滤器(TOP公司制造的 26G-2)上以凝胶的20倍体积量的RO水进行清洗。然后，再重复进行2次在25°C下进行的 1小时的硼氢化钠的反应，并使用RO水进行清洗，直至最后清洗时玻璃过滤器(TOP公司制造的^G-2)中的滤液的电导率达到5 μ S/cm以下，从而得到葡糖胺化多孔性载体。该多孔性载体中的葡糖胺导入量为每ImL多孔性载体中导入了 17μπι01葡糖胺。此外，未经还原剂处理完全的葡糖胺固定化后的甲酰基量为每ImL多孔性载体中为 0 μ mol ο向所得葡糖胺化多孔性载体109mL中加入RO水直至体积为163. 5mL,并转移至 500mL的可拆卸式烧瓶中。然后，制备11. 5mg/mL的过碘酸钠水溶液，并将109mL的该过碘酸钠水溶液加入到可拆卸式烧瓶中，在25°C以120rpm的转速搅拌1小时。反应后，在玻璃过滤器(TOP公司制造的^G-2)上以RO水进行清洗，直至滤液的电导率达到5μ S/cm以下，从而得到含有甲酰基的多孔性载体D。对于得到的含有甲酰基的多孔性载体D，压缩5% 时的压缩应力为0. (^8MPa、压缩10%时的压缩应力为0. 067MPa、压缩15%时的压缩应力为 0. 109MPa。每ImL多孔性载体D中的甲酰基含量为6. 2 μ mol。(实施例2)向制造例1的多孔性粒子B 435mL中加入RO水，使其总量为652mL，加入到2L的可拆卸式烧瓶中，并将该烧瓶安装在25°C的恒温槽(Tomas科学公司制造的恒温水浴锅T-2S) 中。然后，将过碘酸钠(和光纯药工业制造)溶解在RO水中，制备46. 0mg/mL的过碘酸钠 (和光纯药工业制造)，将217. 5mL该溶液加入可拆卸式烧瓶中，在25°C以120rpm的转速搅拌15分钟。反应后，在玻璃过滤器(TOP公司制造的^GD上以RO水进行清洗，直至滤液的电导率为5 μ S/cm以下，得到多孔性粒子D。测定所得多孔性粒子D的甲酰基含量，结果显示每ImL多孔性粒子E中甲酰基含量为45. 6 μ mol。然后，在可拆卸式烧瓶的820mL处做标记，并使用RO水将所得多孔性粒子E 410mL转移。将其安装在15°C的恒温槽(Tomas科学公司制造的恒温水浴锅T-2S、投入冷却装置 ADVANTEC TBC120DA)中，放置反应溶液直至达到15°C。确认反应液到达15°C后，向其中加入多孔性粒子D的甲酰基含量的10摩尔倍的发酵葡糖胺K(协和发酵公司制造)，并加入 4N氢氧化钠溶液(使用和光纯药工业公司制造的盐酸和RO水进行调整)使其pH达到11。 然后，一边使用4N氢氧化钠微调pH至11，一边加入RO水，使反应液的总体积达到1042mL， 在15°C以120rpm的转速搅拌5小时。随后，加入2. 33g硼氢化钠(和光纯药工业公司制造)，搅拌1小时同时使其反应。 反应后，在玻璃过滤器(TOP公司制造的^GD上以多孔性粒子20倍体积量的RO水进行清洗。将清洗后的凝胶加入可拆卸式烧瓶中，补足RO水直至达到可拆卸式烧瓶的1042mL 标记处，加入2. 33g硼氢化钠，在25°C搅拌1小时。反应后，在玻璃过滤器(TOP公司制造的 26G-2)上以凝胶的20倍体积量的RO水进行清洗。然后，再重复进行5次在25°C下进行的 1小时的硼氢化钠的反应，并使用RO水进行清洗，直至最后清洗时玻璃过滤器(TOP公司制造的^G-2)中的滤液的电导率达到5 μ S/cm以下，从而得到葡糖胺化多孔性载体。该多孔性载体中的葡糖胺导入量为每ImL多孔性载体中导入了 ΙΙ.ΟμπιοΙ/mL葡糖胺。此外，未经还原剂处理完全的葡糖胺固定化后的甲酰基量为每ImL多孔性载体中为 0. 4 μ moL·向所得葡糖胺化多孔性载体80mL中加入RO水直至体积为120mL，并转移至可拆卸式烧瓶中。然后，制备11. 5mg/mL的过碘酸钠水溶液，并将40mL的该水溶液加入到可拆卸式烧瓶中，在25°C以150rpm的转速搅拌30分钟(Mazela Z)。反应后，在玻璃过滤器(TOP 公司制造的^G-2)上以RO水进行清洗，直至滤液的电导率达到5 μ S/cm以下，从而得到含有甲酰基的多孔性载体。每ImL多孔性载体中的甲酰基含量为3.4μπι01。(实施例3)在葡糖胺固定化后的还原反应中，将在15°C、1小时的反应进行1次、在25°C、1 小时的反应进行6次变更为在15°C、1小时的反应进行1次、在37°C、1小时的反应进行 2次，除此之外，按照与实施例2相同的方法得到了葡糖胺化多孔性载体，随后得到了含有甲酰基的多孔性载体。需要说明的是，每ImL葡糖胺化多孔性载体中，葡糖胺的导入量为 9.6ymol/mL。此外，未经还原剂处理完全的葡糖胺固定化后的甲酰基量为每ImL多孔性载体中为0. 3 μ mo 1。此外，每ImL含有甲酰基的多孔性载体中，甲酰基含量为4. 3 μ mo 1。(实施例4)在葡糖胺固定化后的还原反应中，将在15°C、1小时的反应进行1次、在25°C、1小时的反应进行6次变更为在15°C、1小时的反应进行1次、在50°C、1小时的反应进行1 次，除此之外，按照与实施例2相同的方法得到了葡糖胺化多孔性载体和含有甲酰基的多孔性载体。需要说明的是，每ImL葡糖胺化多孔性载体中，葡糖胺的导入量为8. 7 μ mol/ mL。此外，未经还原剂处理完全的葡糖胺固定化后的甲酰基量为每ImL多孔性载体中为 0. 4 μ mol。此外，每ImL含有甲酰基的多孔性载体中，甲酰基含量为4. 3 μ mol。(实施例5)利用pHll的0. 5M柠檬酸钠(和光纯药工业制造)+0. 15M食盐(和光纯药工业制造)的缓冲液327mL，置换实施例1中得到的甲酰基多孔性载体109mL。使用pH 11的 0. 5M柠檬酸钠+0. 15M食盐缓冲液将置换后的含有甲酰基的多孔性载体转移至在197. 6mL处做了标记的可拆卸式烧瓶中。向其中加入含有蛋白质A的溶液(钟化公司制造的 PNXL30) 16. 5mL，该含有蛋白质A的溶液中的蛋白质A的浓度为52. 85mg/mL，且其中的蛋白质A根据国际公开专利公报W02006/004067中所述方法制备得到。使用4N NaOH(使用和光纯药工业公司制造和RO水进行调整)调节pH至11，使反应液面与197. 6mL处标记对齐， 在恒温槽中(Tomas科学公司制造的恒温水浴锅T-2S、投入冷却装置ADVANTEC TBC120DA)， 于4°C下、以150rpm的转速进行12小时搅拌以使其反应(Mazela Z)。反应后，使用4M盐酸(使用和光纯药工业公司制造的盐酸和RO水进行调整)调节反应液的PH至6. 8，然后加入硼氢化钠(和光纯药工业制造)0. 309g，在4°C缓慢搅拌1 小时以使其反应。反应后，测定反应液在277nm附近最大吸收处的吸光度，由此可知每ImL 多孔性载体中，亲和配位体即蛋白质A的导入量为7. 2mgo在玻璃过滤器(TOP公司制造的^GD上，以多孔性载体20倍体积量的RO水对反应后的多孔性载体进行清洗，将清洗后的载体加入到可拆卸式烧瓶中，向其中加入RO水直至到达197. 6mL标记处，加入0. 309g硼氢化钠，在25°C搅拌1小时。反应后，以20倍量的RO水进行清洗。然后，用3倍体积量的0. OlM盐酸(使用和光纯药工业公司制造盐酸和 RO水进行调整)置换，向置换后的多孔性载体中加入0. OlM盐酸使其总量达到220mL，并将该溶液加入至可拆卸式烧瓶中，在室温下搅拌30分钟的同时实施酸清洗。酸清洗后，在玻璃过滤器(TOP公司制造的^GD上，以多孔性载体20倍体积量的RO水进行清洗，然后，用3倍体积量的0. 05M氢氧化钠+IM硫酸钠水溶液(使用和光纯药工业公司制造的氢氧化钠、硫酸钠和RO水配制而成)置换。然后，向置换后的多孔性载体中加入0. 05M氢氧化钠+IM硫酸钠水溶液使其总量达到220mL，并将该溶液加入至可拆卸式烧瓶中，在室温下搅拌20分钟的同时实施碱清洗。碱清洗后，在玻璃过滤器(TOP公司制造^GD上，以多孔性载体20倍体积量的 RO水对多孔性载体进行清洗。然后，使用多孔性载体3倍量的pH 7. 4的PBS (SIGMA公司制造)进行置换，然后使用RO水进行清洗，直至清洗滤液的电导率达到5 μ S/cm以下，得到固定化了目标蛋白质A的吸附体。使用电导率计(EUTECH INSTRUMENTS制造的ECTestrlO pure+)测定清洗滤液的电导率。选择人多克隆IgG(BaXter公司制造的Gammagard)作为所得吸附体的目标物，求出动态吸附量和洗脱至目标物中的配位体的量，结果显示，IgG动态吸附量(5% Dynamic binding capacity)为第1次37mg、第2次37mg、第3次38mg。此外，泄漏至精制IgG中的配位体在IgG中所占的浓度为第1次38ppm、第2次20ppm、第3次19ppm。(实施例6)使用实施例2中得到的甲酰基多孔性载体，按照与实施例5相同的方法，得到固定化了蛋白质A的吸附体。求出所得吸附体的动态吸附量和洗脱至目标物中的配位体的量， 结果显示，IgG动态吸附量(5% Dynamic binding capacity)为第 1 次 37mg、第 2 次 38mg、 第3次39mg。此外，泄漏至精制IgG中的配位体在IgG中所占的浓度为第1次23ppm、第 2 次 19ppm、第 3 次 19ppm。(实施例7)使用实施例3中得到的甲酰基多孔性载体，按照与实施例5相同的方法，得到固定化了蛋白质A的吸附体。求出所得吸附体的动态吸附量和洗脱至目标物中的配位体的量，结果显示，IgG动态吸附量(5% Dynamic binding capacity)为第 1 次；Mmg、第 2 次 35mg、 第3次36mg。此外，泄漏至精制IgG中的配位体在IgG中所占的浓度为第1次27ppm、第 2 次 24ppm、第 3 次 16ppm。(实施例8)使用实施例4中得到的甲酰基多孔性载体，按照与实施例5相同的方法，得到固定化了蛋白质A的吸附体。求出所得吸附体的动态吸附量和洗脱至目标物中的配位体的量， 结果显示，IgG动态吸附量(5% Dynamic binding capacity)为第 1 次 31mg、第 2 次 32mg、 第3次32mg。此外，泄漏至精制IgG中的配位体在IgG中所占的浓度为第1次16ppm、第
2次 16ppm、第 3 次 8ppm。(实施例9)除了将蛋白质A的固定化温度由4°C改变为21°C以外，按照与实施例7相同的方法得到吸附体。求出所得吸附体的动态吸附量和洗脱至目标物中的配位体的量，结果显示， IgG 动态吸附量(5% Dynamic binding capacity)为 34mg。(实施例10)在固定化蛋白质A后加入硼氢化钠时，不直接加入其粉末，而是变更为将同量的硼氢化钠溶解于RO水中，制备17mg/mL的硼氢化钠溶液12. 4mL,在1小时内分25次将其总量加入，除此以外，按照与实施例7相同的方法得到吸附体。求出所得吸附体的动态吸附量，结果显示，IgG动态吸附量(5% Dynamic binding capacity)为第1次39mg、第2次 38mg、第 3 次 39mg。(实施例11)在固定化蛋白质A后加入硼氢化钠时，不直接加入其粉末，而是变更为加入17mg/ mL的硼氢化钠溶液0. 5mL,除此以外，按照与实施例7相同的方法得到吸附体。求出所得吸附体的动态吸附量和洗脱至目标物中的配位体的量，结果显示，IgG动态吸附量(5% Dynamic binding capacity)为第 2 次 39mg、第 3 次 39mg。(实施例12)在固定化蛋白质A后，不是一次性加入硼氢化钠，而是加入与硼氢化钠等摩尔量的二甲胺硼烷粉末，除此以外，按照与实施例7相同的方法得到吸附体。求出所得吸附体的动态吸附量，结果显示，IgG动态吸附量(5% Dynamic binding capacity)为第1次36mg、 第3次38mg。(比较例1)除了在固定化葡糖胺后未进行还原反应以外，按照与实施例1相同的方法，得到葡糖胺化多孔性载体和含有甲酰基的多孔性载体F。每ImL多孔性载体中的葡糖胺导入量为20.2μπιΟ1。此外，未经还原剂处理完全的葡糖胺固定化后的甲酰基量为7μπι01。此外， 每ImL多孔性载体F中，含有甲酰基的多孔性载体中甲酰基的含量为14. δμπιο 。使用所得甲酰基多孔性载体，按照与实施例5相同的方法，得到固定化了蛋白质A 的吸附体。求出所得吸附体的动态吸附量和洗脱至目标物中的配位体的量，结果显示，IgG 动态吸附量(5% Dynamic binding capacity)为第 1 次 37mg、第 2 次 38mg、第 3 次 38mg。 此外，泄漏至精制IgG中的配位体在IgG中所占的浓度为第1次87ppm、第2次47ppm、第
3次 56ppm。
(比较例2)向制造例1的多孔性粒子B 64mL中加入RO水，使其总量为96mL，加入到可拆卸式烧瓶中，并将该烧瓶安装在25°C的恒温槽(Tomas科学公司制造的恒温水浴锅T-2S)中。然后，将过碘酸钠(和光纯药工业制造)溶解在RO水中，制备1. 44mg/mL的过碘酸钠水溶液， 将64mL该溶液加入可拆卸式烧瓶中，在25°C以120rpm的转速搅拌1小时(Mazela Z)。反应后，在玻璃过滤器(TOP公司制造的^GD上以RO水进行清洗，直至滤液的电导率达到 5μ S/cm以下，得到含有甲酰基的多孔性载体G。测定所得含有甲酰基的多孔性载体G的甲酰基含量，结果显示每ImL多孔性载体中的甲酰基含量为5. 9μπι01。在玻璃过滤器(TOP公司制造的25G-2)上，以pH为11的0. 5M磷酸(和光纯药工业制造)+0. 15M食盐(和光纯药工业制造)的缓冲液165mL，置换上述酰基多孔性载体 54. 5mL。向置换后的含有甲酰基的多孔性载体中加入pHll的0. 5M磷酸(和光纯药工业制造)+0. 15M食盐(和光纯药工业制造)的缓冲液，使其总量达到90. 5mL，并转移至可拆卸式烧瓶中，向其中加入含有蛋白质A的溶液(钟化公司制造的PNXL30)8. 25mL，该含有蛋白质A的溶液中的蛋白质A的浓度为52. 85mg/mL，且其中的蛋白质A根据国际公开专利公报 W02006/004067中所述方法制备得到，在恒温槽中(Tomas科学公司制造恒温水浴锅T-2S、 投入冷却装置ADVANTEC TBC120DA)，于4°C下、以150rpm的转速使进行12小时搅拌以使其反应(Mazela Ζ)。反应后，使用4Μ盐酸(使用和光纯药工业公司制造盐酸和RO水进行调整)将反应液的PH调节为8，然后加入硼氢化钠(和光纯药工业制造)0. 155g，于4°C缓慢搅拌1小时以使其反应。反应后，测定反应液在276nm附近最大吸收处的吸光度，由此可知每ImL 多孔性载体中，亲和配位体即蛋白质A的导入量为6. 7mg。在玻璃过滤器(TOP公司制造的^GD上，以多孔性载体20倍体积量的RO水对反应后的多孔性载体进行清洗，向清洗后的载体加入RO水至达到109mL，并转移到可拆卸式烧瓶中，加入0. 155g硼氢化钠，在25°C搅拌1小时。反应后，以20倍量的RO水进行清洗。 然后，用3倍体积量的0. OlM盐酸(使用和光纯药工业公司制造盐酸和RO水进行调整)置换，向置换后的多孔性载体中加入0. OlM盐酸使其总量达到109mL，并将该溶液加入至可拆卸式烧瓶中，在室温下搅拌30分钟的同时实施酸清洗。酸清洗后，在玻璃过滤器(TOP公司制造的^GD上，以多孔性载体20倍体积量的RO水进行清洗，然后，用3倍体积量的0. 05M氢氧化钠+IM硫酸钠水溶液(使用和光纯药工业公司制造的氢氧化钠、硫酸钠和RO水配制而成)置换。然后，向置换后的多孔性载体中加入0. 05M氢氧化钠+IM硫酸钠水溶液使其总量达到109mL，并将该溶液加入至可拆卸式烧瓶中，在室温下搅拌20分钟的同时实施碱清洗。碱清洗后，在玻璃过滤器(TOP公司制造的^GD上，以多孔性载体20倍体积量的RO水对多孔性载体进行清洗。然后，使用多孔性载体3倍量的pH 7. 4的PBS (SIGMA公司制造)进行置换，然后使用RO水进行清洗，直至清洗滤液的电导率达到5 μ S/cm以下， 得到固定化了目标蛋白质A的吸附体。使用电导率计(EUTECH INSTRUMENTS制ECTestrlO pure+)测定清洗滤液的电导率。求出所得吸附体的动态吸附量和洗脱至目标物中的配位体的量，结果显示，IgG动态吸附量(5% Dynamic binding capacity)为第 1 次!35mg、第 2 次!35mg、第 3 次!35mg。此
26外，泄漏至精制IgG中的配位体在IgG中所占的浓度为第1次> lOOppm、第2次> lOOppm、 第 3 次> lOOppm。(比较例3)除了未对Chisso公司制造的CK-A分级以外，按照与制造例1相同的方法制得交联多孔性粒子。然后，向该交联多孔性粒子IlmL中加入RO水使其总量达到12. 6mL，将其加入离心沉降管(岩城硝子公司制造50mL)，再向其中加入2M氢氧化钠水溶液(使用和光纯药工业公司制造的氢氧化钠和RO水配制而成)3. 7mL,在40°C加温30分钟。将液温加温至 40°C后，加入环氧氯丙烷(和光纯药工业公司制造)1. 3mL，使用恒温振荡机(Tomas科学公司制造的恒温水浴锅T-25)，在40°C以100次/分振荡2小时以使其反应。反应终止后，在玻璃过滤器(TOP公司制造的17G-2)上，以多孔性粒子20倍体积量的RO水进行清洗，得到每ImL多孔性粒子中环氧基含量为5. 7 μ mol的环氧化多孔性粒子。在玻璃过滤器(TOP公司制造的17G-2)上，使用pH为10的0. 5M碳酸缓冲液(使用和光纯药工业公司制造的碳酸氢钠、碳酸钠和RO水配制而成)30mL，将上述环氧化多孔性粒子9. 5mL置换。向置换后的环氧化多孔性粒子中加入pH为10的0. 5M碳酸缓冲液，使其总量为19mL，将其加入离心沉降管(岩城硝子公司制造50mL)中，再向其中加入D (+)-葡糖胺盐酸盐(和光纯药工业公司制造)0. 18g，使用恒温振荡机(Tomas科学公司制造的恒温水浴锅T-25)，在50°C以100次/分振荡一晚上以使其反应。反应后，在玻璃过滤器(TOP公司制造17G-2)上，以多孔性载体20倍体积量的RO 水进行清洗，得到每ImL多孔性载体中的葡糖胺含量为1.4 μ mol的葡糖胺化多孔性载体。 向所得葡糖胺化多孔性载体IOmL中加入RO水，使其总量达到15mL，并将其装入离心沉降管(岩城硝子公司制造50mL)中。然后，将115mg过碘酸钠(和光纯药工业公司制造)溶解于IOmL RO水中，将所述过碘酸钠水溶液加入离心沉降管中，在恒温箱(岩城玻璃公司制造的恒温箱LOW-TEMP ICB-151L)中，使用混合转子(井内盛荣堂公司制造的Variable Mix Rotor VMR-5)，在25°C以100次/分振荡1小时，使其反应。反应后，在玻璃过滤器(TOP公司制造17G-2)上，以多孔性载体20倍体积量的RO 水进行清洗，得到含有甲酰基的多孔性载体。按照上述方法，对得到的含有甲酰基的多孔性载体的甲酰基含量进行测定，结果为每ImL多孔性载体中的甲酰基含量为5. 9 μ mol。在玻璃过滤器(TOP公司制造17GD上，以pH为10的0. 5M磷酸+0. 15M食盐的缓冲液(使用和光纯药工业公司制造的磷酸氢二钠、氯化钠、氢氧化钠和RO水配制而成)30mL，对上述含有甲酰基的多孔性载体7. ImL进行置换。向置换后的含有甲酰基的多孔性载体中加入PH为10的0. 5M磷酸+0. 15M食盐的缓冲液，使其总量达到11. 8mL，并转移至离心沉降管(岩城硝子公司制造50mL)中，向其中加入含有蛋白质A的溶液(钟化公司制造的PNXL30) 1. 08mL，该含有蛋白质A的溶液中的蛋白质A的浓度为52. 6mg/mL,且其中的蛋白质A根据国际公开专利公报W02006/004067中所述方法制备得到，在恒温箱(岩城玻璃公司制造的恒温箱L0W-TEMPICB-151L)，使用混合转子(井内盛荣堂公司制造的Variable Mix Rotor VMR-5)，于4°C下、以100次/分振荡12小时，以使其反应。使用4M盐酸(使用和光纯药工业公司制造的盐酸和RO水进行调整)调节反应后的反应液的PH至8，然后加入硼氢化钠0. 02g，在4°C缓慢振荡1小时以使其反应。反应后， 测定反应液在277nm附近最大吸收处的吸光度，结果可知每ImL多孔性载体中，亲和配位体即蛋白质A的导入量为4. 7mg。在玻璃过滤器(TOP公司制造的17G-2)上，用RO水清洗反应后的多孔性载体，直至清洗滤液的电导率达到5 μ S/cm以下，得到固定化了目标蛋白质A的吸附体。选择人多克隆IgG(BaXter公司制造的Gammagard)作为所得吸附体的目标物，按照下述方法求出动态吸附量和洗脱至目标物中的配位体的量，结果显示，IgG动态吸附量 (5% Dynamic binding capacity)为第 1 次 22mg、第 2 次 23mg、第 3 次 27mg。此外，泄漏至精制IgG中的配位体在IgG中所占的浓度为第1次^7ppm、第2次214ppm、第3次 198ppm。(制造例2)按照与制造例1相同的方法制备多孔性粒子B，并向该多孔性粒子BlOOmL中加入 RO水，使其总量为150mL，加入到可拆卸式烧瓶(TOP公司制造500mL)中。然后，将2. 30g 的过碘酸钠(和光纯药工业公司制造)溶解于50mL RO水中，将该过碘酸钠水溶液加入可拆卸式烧瓶中，在25°C、以150次/分搅拌15分钟的同时使其反应。反应后，在玻璃过滤器(TOP公司制造^GD上，以多孔性粒子20倍体积量的RO水进行清洗，得到多孔性粒子 H。按照上述方法对得到的含有甲酰基的多孔性粒子的甲酰基含量进行测定，结果显示每 ImL多孔性粒子中的甲酰基含量为57 μ mo 1。(实施例13)按照与制造例2相同的方法制备多孔性粒子H，并将99mL的该多孔性粒子H与 99mL的RO水以1 1制备浆料，将该浆料调节至15°C，然后，在玻璃过滤器(TOP公司制造的^G-2)上抽滤(抽吸干燥)15分钟。将得到的抽吸干燥后的多孔性粒子I全部投入到玻璃制可拆卸式烧瓶(TOP公司制造500mL)中。然后，向该可拆卸式烧瓶中加入3. 3g葡糖胺盐酸盐(协和发酵公司制造的发酵葡糖胺K)。随后，一边使葡糖胺盐酸盐溶解，一边加入 15°C的RO水，调节溶解后的反应液总量为180mL。将反应液调节至15°C后，使用4N的氢氧化钠水溶液和RO水，调节至pH为10、反应液的总量为198mL。接着，在15°C以150次/分搅拌5小时。然后，添加硼氢化钠(和光纯药工业公司制造)0.56g，在15°C以150次/分搅拌60分钟。反应后，在玻璃过滤器(TOP公司制造的^GD上，以多孔性载体40倍体积量的RO水进行清洗。将下述“，，内的操作共进行2次，得到目标多孔性载体“接着，将清洗后的多孔性载体全部投入到玻璃制可拆卸式烧瓶(TOP公司制造500mL)中，加入RO水，调节其总量至 198mL。然后，添加硼氢化钠(和光纯药工业公司制造)0. 56g，在15°C以150次/分搅拌60 分钟。反应后，在玻璃过滤器(TOP公司制造的^GD上，以多孔性载体40倍体积量的RO 水进行清洗。”。通过非水滴定测定该多孔性载体中的葡糖胺固定化量，结果显示每ImL载体中的葡糖胺固定化量为ΙΟμπιοΙ。(实施例14)除了在添加葡糖胺盐酸盐后实施pH调节时，将pH设定为9以外，按照与实施例13 相同的方法制备了目标多孔性载体。每ImL载体中的葡糖胺固定化量为ΙΟμπιοΙ。(实施例15)除了在添加葡糖胺盐酸盐后实施pH调节时，将pH设定为8以外，按照与实施例13 相同的方法制备了目标多孔性载体。每ImL载体中的葡糖胺固定化量为ΙΟμπιοΙ。
(实施例16)使用pH 3的0. OlM柠檬酸缓冲液(使用和光纯药工业公司制造的柠檬酸三钠二水合物、柠檬酸一水合物、RO水配制而成)280mL对实施例13中制备的多孔性载体94mL进行置换，加入该缓冲液，使其总量为141mL，并加入至可拆卸式烧瓶(TOP公司制造500mL) 中。然后，将0.54g过碘酸钠(和光纯药工业公司制造)溶解在94mL RO水中，并将该过碘酸钠水溶液加入可拆卸式烧瓶中，在5°C以150次/分使其搅拌40分钟以使其反应。反应后，在玻璃过滤器(TOP公司制造^G-幻上，以多孔性载体40倍体积量的RO水进行清洗， 得到含有甲酰基的多孔性载体。按照上述方法测定制得的载体的甲酰基含量，结果显示每 ImL多孔性载体中的甲酰基含量为4 μ mol。在玻璃过滤器(TOP公司制造的^G-2)上，以0. 6M柠檬酸三钠+0. 2M食盐的缓冲液(使用和光纯药工业公司制造的柠檬酸三钠二水合物、氯化钠和RO水制备)280mL对 92. SmL的上述含有甲酰基的多孔性载体进行置换。向置换后的该多孔性载体中加入0. 6M 柠檬酸三钠+0. 2M食盐的缓冲液，使其总量为132mL，并将其加入可拆卸式烧瓶(TOP公司制造500mL)中。向其中加入含有蛋白质A的溶液(钟化公司制造的PNXL30) 14.06mL，该含有蛋白质A的溶液中的蛋白质A的浓度为52. 8mg/mL，且其中的蛋白质A根据国际公开专利公报W02006/004067中记载的方法制备得到，加入0. 08M的氢氧化钠水溶液(使用和光纯药工业公司制造的氢氧化钠和RO水配制而成)，调节反应液的pH至12，在4°C以150次/分搅拌4小时以使其反应。使用0. IM柠檬酸(使用和光纯药工业公司制造的柠檬酸一水合物与RO水配制而成)调节反应后的反应液PH至7，然后加入二甲胺硼烷408mg，以150次/分，分别在40°C 搅拌1小时、然后在25°C搅拌8小时，以使其反应。反应后，测定反应液在277nm附近最大吸收处的吸光度，结果可知每ImL多孔性载体中，亲和配位体即蛋白质A的固定化量为 7. 6mg0在玻璃过滤器(TOP公司制造^G-2)上，以多孔性载体10倍体积量的RO水对反应后的多孔性载体进行清洗，然后，用3倍体积量的0. IM柠檬酸(使用和光纯药工业公司制造的柠檬酸一水合物和RO水配制而成)置换。然后向置换后的多孔性载体中加入0. IM 柠檬酸，使其总量为186mL，并加入至可拆卸式烧瓶(TOP公司制造500mL)中，以150次/分在25°C振荡30分钟的同时实施酸清洗。酸清洗后，在玻璃过滤器(TOP公司制造^GD上，以3倍体积量的0. 05M氢氧化钠+IM硫酸钠水溶液(使用和光纯药工业公司制造的氢氧化钠、硫酸钠和RO水配制而成) 置换多孔性载体。然后，向置换后的多孔性载体中加入0.05M氢氧化钠+IM硫酸钠水溶液， 使其总量为186mL，将其全部加入至可拆卸式烧瓶(TOP公司制造500mL)中，以150次/分在25°C振荡20分钟的同时实施碱清洗。碱清洗后，在玻璃过滤器(TOP公司制造^G-2)上，以pH为6的0. 5M柠檬酸缓冲液(使用和光纯药工业公司制造的柠檬酸三钠二水合物、柠檬酸一水合物和RO水配制而成)278mL置换多孔性载体，然后使用RO水进行清洗，直至清洗滤液的电导率为5 μ S/cm以下。接着，使用20%乙醇水溶液(使用日本药局方的乙醇和RO水配制而成)置换多孔性载体，然后，使用20%乙醇水溶液将其加入到250mL的塑料容器(f 'J容器)(Sanplatec公司制造)中，得到固定化了目标蛋白质A的吸附体。使用电导率计(EUTECH INSTRUMENTS 制造的ECTestrlO pure+)测定清洗滤液的电导率。选择人多克隆IgG(Baxter公司制造的Gammagard)作为所得吸附体的目标物，按照下述方法求出动态吸附量和洗脱至目标物中的配位体的量，结果显示，IgG动态吸附量 (5% Dynamic binding capacity)为每ImL载体中37mg。此外，泄漏至精制IgG中的配位体浓度为Mppm。按照上述方法测定所得吸附体中甲酰基的含量，结果显示每ImL多孔性载体中为0. 2μπιο1。(实施例17)除了使用实施例14中制备的多孔性载体以外，按照与实施例16相同的操作，得到目标吸附体。该IgG动态吸附量为每ImL载体中为37mg，泄漏至精制IgG中的配位体浓度为22ppm。(实施例I8)除了使用实施例15中制备的多孔性载体以外，按照与实施例16相同的操作，得到目标吸附体。该IgG动态吸附量为每ImL载体中为37mg，泄漏至精制IgG中的配位体浓度为26ppm。(实施例I9)除了使用pH为2的柠檬酸缓冲液(使用和光纯药工业公司制造的柠檬酸三钠二水合物、柠檬酸一水合物和RO水配制而成)来代替pH为3的柠檬酸缓冲液以外，按照与实施例17相同的操作来制备吸附体。此时，含有甲酰基的多孔性载体的甲酰基含量为每 ImL多孔性载体中为6 μ mol，亲和配位体即蛋白质A的固定化量为每ImL多孔性载体中为 7. 2mgo此外，IgG动态吸附量为35mg，泄漏至精制IgG中的配位体浓度为38ppm。(实施例2O)除了使用pH为5的柠檬酸缓冲液(使用和光纯药工业公司制造的柠檬酸三钠二水合物、柠檬酸一水合物和RO水配制而成)来代替pH为3的柠檬酸缓冲液以外，按照与实施例17相同的操作来制备吸附体。此时，含有甲酰基的多孔性载体的甲酰基含量为每 ImL多孔性载体中为4μπι01，亲和配位体即蛋白质A的固定化量为每ImL多孔性载体中为 6. 5mg。此外，IgG动态吸附量为35mg，泄漏至精制IgG中的配位体浓度为42ppm。(实施例21)在玻璃过滤器(TOP公司制造的^G-2)上，以0. 5M柠檬酸三钠+0. 15M食盐的缓冲液(使用和光纯药工业公司制造的柠檬酸三钠二水合物、氯化钠和RO水配制而成)278mL, 置换按照与实施例1相同的方法制备的92. SmL的含有甲酰基的多孔性载体。向置换后的含有甲酰基的多孔性载体中加入0. 5M柠檬酸三钠+0. 15M食盐的缓冲液，使其总量为130mL， 并将其加入可拆卸式烧瓶(TOP公司制造500mL)中。向其中加入含有蛋白质A的溶液(钟化公司制造的PNXL30) 14. 04mL,该含有蛋白质A的溶液中的蛋白质A的浓度为52. 85mg/ mL，且其中的蛋白质A根据国际公开专利公报W02006/004067中记载的方法制备得到，加入 4M的氢氧化钠水溶液(使用和光纯药工业公司制造的氢氧化钠和RO水配制而成)，调节反应液的PH至11。然后，使用pH为11的0. 5M柠檬酸三钠+0. 15M食盐的缓冲液(使用和光纯药工业公司制造的柠檬酸三钠二水合物、氯化钠、氢氧化钠和RO水配制而成)调节反应液的总量为168mL，在4°C以150次/分搅拌12小时以使其反应。
反应后，使用4M盐酸(使用和光纯药工业公司制造的盐酸和RO水配制而成)调节反应液的PH至6. 8，然后加入硼氢化钠^^mg，在4°C以150次/分搅拌1小时以使其反应。反应后，测定反应液在277nm附近最大吸收处的吸光度，由此可知每ImL多孔性载体中，亲和配位体即蛋白质A的导入量为7. 2mgo在玻璃过滤器(TOP公司制造的^G-2)上，以多孔性载体10倍体积量的RO水对反应后的多孔性载体进行清洗，然后将其全部装入可拆卸式烧瓶(TOP公司制造500mL)中， 向其中加入RO水调节反应液总量为168mL，然后，加入的硼氢化钠，在25°C以150次 /分搅拌1小时以使其反应。反应后，在玻璃过滤器(TOP公司制造的^G-2)上，以多孔性载体10倍体积量的RO水进行清洗，然后，用3倍体积量的0. OlM盐酸(使用和光纯药工业公司制造盐酸和RO水配制而成)置换，然后，向置换后的多孔性载体中加入0. OlM盐酸使其总量为168mL，将其加入至可拆卸式烧瓶(TOP公司制造500mL)中，在25°C以150次/分振荡30分钟的同时实施酸清洗。酸清洗后，在玻璃过滤器(TOP公司制造^GD上，以多孔性载体10倍体积量的 RO水对多孔性载体进行清洗，然后，用3倍体积量的0. 05M氢氧化钠+IM硫酸钠水溶液(使用和光纯药工业公司制造的氢氧化钠、硫酸钠和RO水配制而成)置换。然后，向置换后的多孔性载体中加入0. 05M氢氧化钠+IM硫酸钠水溶液使其总量为168mL，将其全部加入至可拆卸式烧瓶(TOP公司制造500mL)中，在25°C以150次/分振荡20分钟的同时实施碱清洗。碱清洗后，在玻璃过滤器(TOP公司制造的^G-2)上，以pH为6的0. OlM柠檬酸缓冲液(使用和光纯药工业公司制造的柠檬酸三钠二水合物、柠檬酸一水合物和RO水配制而成)278mL对多孔性载体进行置换，然后，使用RO水进行清洗，直至清洗滤液的电导率达到5yS/cm以下。接着，使用20%乙醇水溶液(使用日本药局方的乙醇和RO水配制而成) 置换多孔性载体，然后，使用20%乙醇水溶液将其加入至250mL的塑料容器(Sanplatec公司制造)中，得到固定化了目标蛋白质A的吸附体。使用电导率计(EUTECH INSTRUMENTS 制造的ECTestrlO pure+)测定清洗滤液的电导率。选择人多克隆IgG(Baxter公司制造的Gammagard)作为所得吸附体的目标物，求出动态吸附量和洗脱至目标物中的配位体的量，结果显示，IgG动态吸附量(5% Dynamic binding capacity)为第1次36mg、第2次36mg、第3次37mg。此外，泄漏至精制IgG中的配位体浓度为第1次69ppm、第2次47ppm、第3次36ppm。(实施例22)除了使用0. 025M磷酸+1. 5M硫酸钠的缓冲液(使用和光纯药工业公司制造的12 水合磷酸氢二钠、硫酸钠和RO水配制而成)来代替0. 5M柠檬酸三钠+0. 15M食盐的缓冲液， 并使用PH为11的0. 025M磷酸+1. 5M硫酸钠的缓冲液(使用和光纯药工业公司制造的12 水合磷酸氢二钠、硫酸钠、氢氧化钠和RO水配制而成)来代替pH为11的0. 5M柠檬酸三钠 +0. 15M食盐的缓冲液以外，按照与实施例21相同的操作来制备吸附体。按照与实施例2相同的方法求出亲和配位体即蛋白质A的固定化量，结果为每ImL多孔性载体中为7. 4mgo(实施例烈)除了在实施例21中调节pH为11的操作中，将pH 11改变为pH 12. 5以外，按照与实施例21相同的方法来制备吸附体。蛋白质A的固定化量为每ImL多孔性载体中6. Omg,IgG 动态吸附量(5% Dynamic binding capacity)为第 1 次 33mg、第 2 次 33mg、第 3 次 33mg。此外，泄漏至精制IgG中的配位体的浓度为第1次35ppm。(实施例除了在实施例21中调节pH为11的操作中，将pH 11改变为pH 13以外，按照与实施例21相同的方法来制备吸附体。蛋白质A的固定化量为每ImL多孔性载体中4. Omg, IgG 动态吸附量(5% Dynamic binding capacity)为第 1 次 ^mg、第 2 次 33mg、第 3 次 33mg。此外，泄漏至精制IgG中的配位体的浓度为第1次23ppm。(实施例25)除了将实施例21中的调节pH为11的操作改变为pH 10以外，按照与实施例21 相同的方法来制备吸附体。蛋白质A的固定化量为每ImL多孔性载体中4. Omg, IgG动态吸附量(5% Dynamic binding capacity)为 29mg。(实施例沈)在玻璃过滤器(TOP公司制造的^G-2)上，以0. 6M柠檬酸三钠+0. 2M食盐的缓冲液(使用和光纯药工业公司制造柠檬酸三钠二水合物、氯化钠和RO水配制而成)280mL,置换按照与实施例1相同的方法制备的92. SmL的含有甲酰基的多孔性载体。向置换后的多孔性载体F中加入0. 6M柠檬酸三钠+0. 2M食盐的缓冲液，使其总量为132mL，并加入到可拆卸式烧瓶(TOP公司制造500mL)中。向其中加入含有蛋白质A的溶液(钟化公司制造的 PNXL30) 14. 06mL，该含有蛋白质A的溶液中的蛋白质A的浓度为52. 8mg/mL，且其中的蛋白质A根据国际公开专利公报W02006/004067中记载的方法制备得到，加入0. 08M的氢氧化钠水溶液(使用和光纯药工业公司制造的氢氧化钠和RO水配制而成)，调节反应后的反应液pH至12，在4°C以150次/分搅拌4小时以使其反应。使用0. IM柠檬酸(使用和光纯药工业公司制造柠檬酸一水合物和RO水配制而成)调节反应后的反应液pH至7。在同温度下继续搅拌1小时后，加入二甲胺硼烷408mg，然后以150次/分分别在4°C搅拌1小时、 然后在25°C搅拌5小时，同时使其反应。在玻璃过滤器(TOP公司制造的^G-2)上，以多孔性载体10倍体积量的RO水对反应后的多孔性载体进行清洗，然后，用3倍体积量的0. IM柠檬酸(使用和光纯药工业公司制造的柠檬酸一水合物和RO水配制而成)置换，然后，向置换后的多孔性载体中加入0. IM 柠檬酸使其总量为186mL，将其加入可拆卸式烧瓶(TOP公司制造500mL)中，以150次/分在25°C振荡30分钟的同时实施酸清洗。酸清洗后，在玻璃过滤器(TOP公司制造的^G-2)上，以3倍体积量的0. 05M氢氧化钠+IM硫酸钠水溶液(使用和光纯药工业公司制造氢氧化钠、硫酸钠和RO水配制而成) 置换多孔性载体。然后，向置换后的多孔性载体中加入0. 05M氢氧化钠+IM硫酸钠水溶液使其总量为186mL，将其全部加入至可拆卸式烧瓶(TOP公司制造500mL)中，以150次/分在25°C振荡20分钟的同时实施碱清洗。碱清洗后，在玻璃过滤器(TOP公司制造^G-2)上，以pH为6的0. 5M柠檬酸缓冲液(使用和光纯药工业公司制造的柠檬酸三钠二水合物、柠檬酸一水合物和RO水配制而成)278mL置换多孔性载体。然后，使用RO水进行清洗，直至清洗滤液的电导率达到5 μ S/ cm以下。接着，使用20%乙醇水溶液(使用日本药局方的乙醇和RO水配制而成)置换多孔性载体，然后，使用20%乙醇水溶液将其加入到250mL的塑料容器(Sanplatec公司制造)
32中，得到固定化了目标蛋白质A的吸附体。使用RO水进行清洗，直至清洗滤液的电导率达到5yS/cm以下。接着，使用20%乙醇水溶液(使用日本药局方的乙醇和RO水配制而成) 置换多孔性载体，然后，使用20%乙醇水溶液将其加入到250mL的塑料容器(Sanplatec公司制造)中，得到固定化了目标蛋白质A的吸附体。使用电导率计(EUTECH INSTRUMENTS 制造的ECTestrlO pure+)测定清洗滤液的电导率。选择人多克隆IgG(Baxter公司制造的Gammagard)作为所得吸附体的目标物，求出动态吸附量和洗脱至目标物中的配位体的量，结果显示，IgG动态吸附量(5% Dynamic binding capacity)为每ImL载体中为3%ig。此外，泄漏至精制IgG中的配位体浓度为 30ppmo(实施例27)除了在使用0. IM柠檬酸调节pH至7后，将在同温度下继续搅拌的时间设定为2 小时以外，按照与实施例26相同的操作得到吸附体。所得吸附体的IgG动态吸附量为每 ImL载体中为36mg。(实施例观)除了在使用0. IM柠檬酸调节pH至7后，将在同温度下继续搅拌的时间设定为4 小时以外，按照与实施例26相同的操作得到吸附体。所得吸附体的IgG动态吸附量为每 ImL载体中为37mg，泄漏至精制IgG中的配位体浓度为22ppm。(实施例四)除了在使用0. IM柠檬酸调节pH至7后，将在同温度下继续搅拌的时间设定为6 小时以外，按照与实施例26相同的操作得到吸附体。所得吸附体的IgG动态吸附量为每 ImL载体中为36mg，泄漏至精制IgG中的配位体浓度为45ppm。(实施例30)除了使用0. IM柠檬酸调节pH至7后，将在同温度下继续搅拌的时间设定为15小时以外，按照与实施例26相同的操作得到吸附体。所得吸附体的IgG动态吸附量为每ImL 载体中为37mg。(实施例31)在pH 12的条件下使蛋白质A反应后，使用1. 6M柠檬酸将pH调节为3，然后将在同温度下继续搅拌的时间设定为4小时，除此之外，按照与实施例沈相同的操作得到吸附体。所得吸附体的IgG动态吸附量为每ImL载体中为36mg，泄漏至精制IgG中的配位体浓度为30ppm。(实施例32)除了在刚刚使用0. IM柠檬酸调节pH至7之后加入二甲胺硼烷以外，按照与实施例26相同的操作得到吸附体。所得吸附体的IgG动态吸附量为每ImL载体中31mg，泄漏至精制IgG中的配位体浓度为22ppm。(实施例33)使用pH为3的柠檬酸缓冲液(使用和光纯药工业公司制造的柠檬酸三钠二水合物、柠檬酸一水合物和RO水配制而成)282mL，对在制造例1中制备的多孔性粒子B进行置换，使用该缓冲液调节液体量，此外，将过碘酸钠设定为0. 16g，除此之外，按照与实施例 32相同的操作得到吸附体。此时，多孔性载体E中甲酰基的含量为每ImL多孔性载体中7 μ mol，亲和配位体即蛋白质A的固定化量为每ImL多孔性载体中为5. Omg。此外，IgG的动态吸附量为31mg，泄漏至精制IgG中的配位体浓度为36ppm。所得吸附体中甲酰基的含量为每ImL多孔性载体中为0. 2 μ mol。(比较例4)不使用二甲胺硼烷，按照与实施例16相同的操作得到吸附体。所得吸附体中甲酰基的含量为每ImL多孔性载体中为2 μ mol。此外，IgG的动态吸附量为每ImL载体中为 27mg，泄漏至精制IgG中的配位体浓度为615ppm。
权利要求
1.一种含有甲酰基的多孔性载体的制造方法，其包括向具有甲酰基的多孔性粒子中导入间隔团，然后利用过碘酸和/或过碘酸盐对上述间隔团部分进行氧化，使其转变为甲酰基，其中，导入间隔团后，多孔性粒子的甲酰基含量为每ImL多孔性粒子中的甲酰基含量为 3ymol以下。
2.权利要求1所述的含有甲酰基的多孔性载体的制造方法，其中，导入的间隔团是糖或糖类似物。
3.权利要求1或2中任一项所述的含有甲酰基的多孔性载体的制造方法，其中，导入的间隔团具有碳原子连续存在的部分，该碳原子在平伏位具有羟基，所述在平伏位具有羟基的碳原子的连续个数为2或3。
4.权利要求1 3中任一项所述的含有甲酰基的多孔性载体的制造方法，其中，导入的间隔团含有氨基。
5.权利要求1 4中任一项所述的含有甲酰基的多孔性载体的制造方法，其包括在pH7 11的范围内，使作为间隔团的具有1，2_ 二醇结构的伯胺或仲胺与具有甲酰基的多孔性粒子缩合；和任选地通过还原反应使形成的键稳定化。
6.权利要求5所述的多孔性载体的制造方法，其中，pH的范围为8 10。
7.权利要求1 6中任一项所述的含有甲酰基的多孔性载体的制造方法，其中，导入的间隔团为葡糖胺。
8.权利要求7所述的多孔性载体的制造方法，其中，以盐酸盐的状态使用所述葡糖胺。
9.权利要求1 8中任一项所述的含有甲酰基的多孔性载体的制造方法，其中，间隔团的导入量为每ImL载体中导入间隔团1 μ mol以上。
10.权利要求1 9中任一项所述的含有甲酰基的多孔性载体的制造方法，其中，向具有甲酰基的多孔性粒子中导入间隔团，然后对反应中未使用的多孔性粒子的甲酰基进行处理。
11.权利要求1 10中任一项所述的含有甲酰基的多孔性载体的制造方法，其中，所述含有甲酰基的多孔性载体是使过碘酸盐发生作用而得到的。
12.权利要求1 11中任一项所述的含有甲酰基的多孔性载体的制造方法，其中，甲酰基的导入量为每ImL载体中导入甲酰基0.5 μ mol以上且IOOymol以下。
13.一种含有甲酰基的多孔性载体的制造方法，其包括在加入酸而将PH调节至1 6范围的液体中，使过碘酸或其盐与多孔性载体或与导入了间隔团的多孔性载体发生作用。
14.权利要求13所述的含有甲酰基的多孔性载体的制造方法，其中，所述酸为有机酸。
15.权利要求1 14中任一项所述的含有甲酰基的多孔性载体的制造方法，其中，使过碘酸或其盐发生作用的PH范围为2 5。
16.权利要求1 15中任一项所述的含有甲酰基的多孔性载体的制造方法，其中，过碘酸或其盐的浓度为5mM以上且300mM以下。
17.一种含有甲酰基的多孔性载体的制造方法，其包括使过碘酸和/或过碘酸盐与多孔性载体或与导入了间隔团的多孔性载体在0°C以上且10°C以下的温度发生作用。
18.权利要求1 17中任一项所述的含有甲酰基的多孔性载体的制造方法，其为使过碘酸和/或过碘酸盐在0°C以上且8°C以下的温度发生作用而得到。
19.权利要求1 18中任一项所述的含有甲酰基的多孔性载体的制造方法，其中，多孔性粒子含有多糖。
20.权利要求19所述的含有甲酰基的多孔性载体的制造方法，其中，多糖为纤维素和/ 或纤维素衍生物。
21.权利要求1 20中任一项所述的含有甲酰基的多孔性载体的制造方法，其中，多孔性粒子经过了交联。
22.—种含有甲酰基的多孔性载体，其通过权利要求1 21中任一项所述的含有甲酰基的多孔性载体的制造方法而制得。
23.一种吸附体的制造方法，其包括将含有氨基的配位体固定化于权利要求22所述的含有甲酰基的多孔性载体。
24.权利要求23所述的吸附体的制造方法，其中，在含有下述水溶液的反应液中，将含有氨基的配位体固定化于含有甲酰基的多孔性载体，所述水溶液包含选自羧酸盐、金属卤化物及硫酸盐中的1种以上化合物，且以羧酸盐为必要成分。
25.权利要求23或M所述的吸附体的制造方法，其中，在含有柠檬酸盐和/或硫酸盐的反应液中，将含有氨基的配位体固定化于含有甲酰基的多孔性载体。
26.权利要求25所述的吸附体的制造方法，其中，所述反应液中的柠檬酸和/或硫酸盐的浓度为0.0IM 2M。
27.权利要求23 沈中任一项所述的吸附体的制造方法，其中，所述反应液的pH为 7 13。
28.权利要求23 27中任一项所述的吸附体的制造方法，其中，所述反应液的pH为 11. 5以上且低于13. 0。
29.权利要求23 28中任一项所述的吸附体的制造方法，其中，所述反应液的pH为 11. 5以上且低于12. 6。
30.一种吸附体的制造方法，其包括通过亚氨基化及其还原反应这两步反应来进行，将含有氨基的配位体固定化于含有甲酰基的多孔性载体，并在亚氨基化反应之后实施稳定化操作。
31.权利要求30所述的吸附体的制造方法，其中，亚氨基化反应之后的稳定化操作实施1小时以上。
32.权利要求30或31所述的吸附体的制造方法，其中，亚氨基化反应之后的稳定化操作在pH 2 10条件下实施。
33.权利要求30 32中任一项所述的吸附体的制造方法，其中，亚氨基化反应之后的稳定化操作在缓冲液中实施。
34.权利要求33所述的吸附体的制造方法，其中，缓冲液中含有至少一种以上的能具有二价以上阴离子的盐。
35.权利要求33或34所述的吸附体的制造方法，其中，缓冲液中含有多元羧酸盐和/ 或中性盐。
36.权利要求33 35中任一项所述的吸附体的制造方法，其中，缓冲液中含有柠檬酸Τττ . ο
37.权利要求33 36中任一项所述的吸附体的制造方法，其中，缓冲液中含有选自金属卤化物和硫酸盐中的至少1种以上。
38.权利要求23 37中任一项所述的吸附体的制造方法，其中，在将含有氨基的配位体固定化于含有甲酰基的多孔性载体时，通过有机硼烷络合物，使配位体的固定化键稳定化并同时使其余的甲酰基钝化。
39.权利要求38所述的吸附体的制造方法，其在含有缓冲液的溶剂中实施。
40.权利要求38或39所述的吸附体的制造方法，其中，上述通过有机硼烷络合物使配位体的固定化键稳定化并同时使其余的甲酰基钝化的操作，实施1小时以上且48小时以下。
41.权利要求38 40中任一项所述的吸附体的制造方法，其中，有机硼烷络合物是硼烷-胺络合物。
42.权利要求23 41中任一项所述的吸附体的制造方法，其中，操作温度为-10 40 "C。
43.一种吸附体，其通过权利要求23 42中任一项所述的制造方法制得。
44.权利要求43所述的吸附体，其中，含有氨基的配位体的导入量为每ImL多孔性载体中导入含有氨基的配位体Img以上且500mg以下。
45.权利要求43或44所述的吸附体，其中，含有氨基的配位体的导入量为每ImL多孔性载体中导入含有氨基的配位体0. 01 μ mol以上且15 μ mol以下。
46.权利要求43 45中任一项所述的吸附体，其中，所述含有氨基的配位体是蛋白质A0
47.权利要求43 46中任一项所述的吸附体，其中，从吸附体洗脱到目标物中的配位体浓度的第一次精制 第三次精制的平均值为50ppm以下。
48.权利要求43 47中任一项所述的吸附体，其中，精制目标物的吸附量为每ImL吸附体中精制目标物的吸附量为Img以上且IOOmg以下。
49.权利要求43 48中任一项所述的吸附体，其在压缩5%时的压缩应力为0.OlMPa 以上且IMPa以下，压缩10%时的压缩应力为0. 03MPa以上且3MPa以下，以及压缩15%时的压缩应力为0. 06MPa以上且5MPa以下。
50.权利要求43 49中任一项所述的吸附体，其在压缩5%时的压缩应力为0.02MPa 以上且IMPa以下，压缩10%时的压缩应力为0. 06MPa以上且3MPa以下，以及压缩15%时的压缩应力为0. 09MPa以上且5MPa以下。
51.权利要求43 50中任一项所述的吸附体，其树脂含量为2%以上且50%以下。
52.权利要求43 51中任一项所述的吸附体，其体积平均粒径为20μπι以上且 1000 μ m 以下。
53.一种精制方法，其中使用了权利要求43 51中任一项所述的吸附体。
54.权利要求53所述的精制方法，其中，使用直径为0.5cm以上且高度为3cm以上的柱。
55.权利要求53或M所述的精制方法，其包括以lOOcm/h以上且lOOOcm/h以下的线速进行通液的工序。
全文摘要
本发明涉及含有甲酰基的多孔性载体的制造方法，其包括向具有甲酰基的多孔性粒子中导入间隔团，然后利用过碘酸和/或过碘酸盐对上述间隔团部分进行氧化，使其转变为甲酰基，其中，导入间隔团后的多孔性粒子的甲酰基含量为每1mL多孔性粒子中的甲酰基含量为3μmol以下。此外，本发明还涉及吸附体的制造方法，其包括将含有氨基的配位体固定化于所述含有甲酰基的多孔性载体上。根据本发明，可以提供吸附量大、强度高且配位体洗脱少的含有甲酰基的多孔性载体，以及提供使用上述多孔性载体的吸附体。
文档编号B01J20/24GK102239001SQ20098014850
公开日2011年11月9日 申请日期2009年12月3日 优先权日2008年12月3日
发明者川原直美, 川嵜宏明, 河井义和 申请人:Jnc株式会社, 株式会社钟化