同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相萃取小柱及其制备方法和应用的制作方法

文档序号:4953587阅读:260来源:国知局
专利名称:同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相萃取小柱及其制备方法和应用的制作方法
技术领域
本发明涉及分析化学、食品安全领域,具体地说,是涉及同时萃取三聚氰胺和三聚 氰酸的固相萃取小柱及制备方法和应用,并主要用于各类食品(包括原料乳、奶制品、动物 源性食品、植物源性食品等)和饲料中三聚氰胺和三聚氰酸残留的高选择性分离、富集和 纯化。
背景技术
三聚氰胺(Melamine),化学式C3H6N6,俗称蜜胺、蛋白精,IUPAC命名为“ 1,3, 5-三氨基_2,4,6-三嗪”,是一种三嗪类含氮杂环有机化合物,被用作化工原料,广泛应用 于造纸、日用品、印刷、塑料制品等和人类日常生活息息相关的产品中。食品工业中常常需 要测定食品的蛋白质含量,由于直接测量蛋白质技术上比较复杂,所以常用一种叫做凯氏 定氮法的方法,通过测定氮原子的含量来间接推算食品中蛋白质的含量。由于三聚氰胺 (含氮量66%)与蛋白质(平均含氮量16%)相比含有更高比例的氮原子,所以被一些造 假者利用,添加在食品中以造成食品蛋白质含量较高的假象,从而造成严重的食物安全事 故。三聚氰胺的毒性事实上是低的,单独摄入体内并不造成很严重的后果,它遇强酸或强 碱水溶液水解,氨基逐步被羟基取代,生成三聚氰酸二酰胺,然后进一步水解生成三聚氰酸 一酰胺,最后生成三聚氰酸(Cyanuric Acid)。当三聚氰胺和三聚氰酸同时存在时,二者能 够依靠分子结构上的氢氧基与氨基之间形成水合键,最后生成氰尿酸三聚氰胺。氰尿酸三 聚氰胺很难溶于水,被摄入人体后,由于胃液的酸性作用,氰尿酸三聚氰胺解离,这种复合 物被破坏,三聚氰胺和三聚氰酸于是分别被吸收入血。由于人体无法转化这两种物质,最 终三聚氰胺和三聚氰酸被血液运送到肾脏,两种物质又一次相遇,于是又进行了相互作用, 以网格结构重新形成不溶于水的大分子氰尿酸三聚氰胺,大量氰尿酸三聚氰胺聚集于此形 成结石,造成肾小管的物理阻塞,导致尿液无法顺利排除,使肾脏积水,最终导致肾脏衰竭。 2007年美国宠物食品受污染事件,调查结果认为掺杂了<6. 6%三聚氰胺的小麦蛋白粉 是宠物食品导致中毒的原因。2008年爆发的“婴儿奶粉中三聚氰胺事件”给处于辉煌时期 的中国乳业造成了毁灭性的打击,并导致乳制品国际贸易蒙受重大损失,包括欧盟、美国在 内的许多国家和地区一度对我国出口的乳及含乳制品设置了严格的技术标准和壁垒。目 前我国仅出台了原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法国家标准(GB/T 22388-2008和GB/ T2M00-2008),对于三聚氰酸检测的报道较少见,而对于除乳及乳制品外的含蛋白食品中 的三聚氰胺的检测也是参照原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法、国家标准。由于各类食 品基质非常复杂,为了避免不同复杂基质的影响,样品前处理就非常重要了。采用固相萃取 法对食品中的三聚氰胺和三聚氰酸进行预处理,简单、方便、去除干扰杂质效果好。但是,由 于弱碱性的三聚氰胺(PKa 8. 95)和弱酸性的三聚氰酸(pKa 5.0)是两种完全不同性质的 化合物,目前通常采用美国食品药品监督管理局(FDA)的官方推荐方法,即利用两种不同 性质的固相萃取小柱(强阳离子交换小柱和强阴离子交换小柱),分别萃取三聚氰胺和三
5聚氰酸,再分开检测。但该方法操作复杂,耗费大量的时间以及人力和物力,同时方法的适 用基质也仅限于乳及含乳制品。

发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供一种同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸 的固相萃取小柱及制备方法和应用,以方便、快捷、准确、高效地选择性萃取各类食品中的 三聚氰胺和三聚氰酸,结合质谱方法实现快速分析,使三聚氰胺和三聚氰酸的定性和定量 更准确更高效。本发明是通过以下技术方案实现的一种同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相萃取小柱,由聚丙烯外壳、聚乙烯筛板 和填料组成,其特征在于所述填料为强阳离子交换填料和亲水性键合相硅胶。进一步地,所述强阳离子交换填料为选自苯磺酸化的苯乙烯二乙烯苯聚合物、丙 磺酸化的苯乙烯二乙烯苯聚合物、苯磺酸键合硅胶、丙磺酸键合硅胶中的至少一种;所述亲 水性键合相硅胶为选自乙二胺基-N-丙基键合硅胶、氨丙基键合硅胶、氰基键和硅胶、二醇 基键和硅胶中的至少一种。上述强阳离子交换填料和所述亲水性键合相硅胶的比例为重量比1 0.5 1 10。同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相萃取小柱的制备方法,包括以下步骤分别 称取一定量30 100微米强阳离子交换填料和40 100微米亲水性键合相硅胶,填充于 底端为聚乙烯筛板的聚丙烯小柱内,填料上端再以聚乙烯筛板固定。利用上述的固相萃取小柱同时萃取样品中三聚氰胺和三聚氰酸的方法,包括以下 步骤a、从样品中提取三聚氰胺和三聚氰酸获得待净化液;b、固相萃取小柱的活化将所述固相萃取小柱依次用2 6mL甲醇、2 6mL乙 腈-水活化;C、过柱转移所述待净化液至所述固相萃取柱的顶部,以每秒一滴的流速过柱,用 1 3mL乙腈-水淋洗小柱,低真空抽干固相萃取柱后,依次用1 3mL甲醇和1 3mL 5% 氨水甲醇溶液洗脱柱上的待分析成分,合并收集洗脱液,在氮吹浓缩装置上蒸干后供液相 色谱-质谱测定。上述的同时萃取样品中三聚氰胺和三聚氰酸的方法,其中所述样品为食品(饮 料)和饲料;优选地,所述食品是原料乳及乳制品,或植物源性食品,或动物源性食品如猪 肉、肝脏、肠衣、水产品,或蜂蜜,其既可以是液态的,如液态奶、豆浆,也可以是固态的,如奶 粉、乳酪、炼乳、奶油、奶糖、豆奶粉、豆粉、蛋白粉。上述同时萃取样品中三聚氰胺和三聚氰酸的方法,可通过以下步骤从所述动物源 性食品中提取三聚氰胺和三聚氰酸获得待净化液称取1 2g试样于具塞塑料离心管中, 加4 8mL乙腈水(1 1)和200 500 μ L 2moL/L盐酸,超声提取,冷冻离心5 8min, 取上清液;残渣再用4 SmL乙腈水(1 1)提取超声,冷冻离心5 8min,取上清液; 合并两次提取液,加入5 IOmL乙腈饱和正己烷,混勻后冷冻离心5 8min,弃去正己烷 层,下层经乙腈水(1 1)润湿的滤纸过滤后用乙腈水(1 1)稀释后作待净化液。
可通过以下步骤从所述液态食品中提取三聚氰胺和三聚氰酸获得待净化液称取 1 2g试样于具塞塑料离心管中,加2 4mL乙腈和50 500 μ L 2moL/L盐酸溶液,超声 提取,冷冻离心5 8min,取上清液;经乙腈水(1 1)润湿的滤纸过滤后用乙腈水 (1 1)稀释后作待净化液。可通过以下步骤从蜂蜜中提取三聚氰胺和三聚氰酸获得待净化液称取1 2g试 样于具塞塑料离心管中,加4 SmL乙腈水(1 1)和50 500 μ L2moL/L盐酸溶液,超 声提取,冷冻离心5 8min,取上清液;经乙腈水(1 1)润湿的滤纸过滤后用乙腈水 (1 1)稀释后作待净化液。可通过以下步骤从固体食品或饲料中提取三聚氰胺和三聚氰酸获得待净化液称 取1 2g试样于具塞塑料离心管中,加2 4mL去离子水溶解,然后加2 4mL乙腈和50 500 μ L 2moL/L盐酸溶液,超声提取,冷冻离心5 8min,取上清液;经乙腈水(1 1)润 湿的滤纸过滤后用乙腈水(1 1)稀释后作待净化液。上述的固相萃取小柱以及上述的同时萃取样品中三聚氰胺和三聚氰酸的方法可 以应用于三聚氰胺和三聚氰酸含量测定中。本发明由于采用了上述的技术方案,使之与现有技术相比,具有以下的优点和积 极效果本发明所制得的同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱,用于萃取各 类食品基质中的三聚氰胺和三聚氰酸,简单、快速、准确、高效。与以往的方法比较,前处理 的萃取过程由两根不同的固相萃取柱(强阳离子交换小柱和强阴离子交换小柱)分开萃取 简化成一根固相萃取柱一次性萃取,节省了一半以上的时间,一根同时萃取三聚氰胺和三 聚氰酸分子的固相萃取小柱的价格也只有不到两根离子交换萃取柱总价格的一半,总的效 率比FDA方法高了 75%以上,使三聚氰胺和三聚氰酸的定性和定量更准确更高效更稳定。
具体实施例方式实施例1.一、同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相萃取小柱的制备方法(1)同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的功能性填料的制备分别称取IOOmg 40微米丙磺酸化的苯乙烯二乙烯苯聚合物和50mg 50微米乙二 胺基-N-丙基键合硅胶,充分混勻。(2)同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱的制备称取150mg上述功能性填料,填充于底端为聚乙烯筛板的聚丙烯小柱内,填料上 端再以聚乙烯筛板固定。二、同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱,应用于牛奶中三聚氰胺 和三聚氰酸的分离、富集和纯化(1)称取2g(精确至O.Olg)液体试样于50mL具塞塑料离心管中,加4mL乙腈和 500 μ L 2moL/L盐酸,混勻后超声提取15min,在4°C下9500r/min冷冻离心5min,取上清 液,经乙腈水(1 1)润湿的滤纸过滤后用去离子水稀释至SmL作待净化液。(2)将同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱依次用3mL甲醇、3mL乙 腈水(1 1)活化备用。(3)转移SmL样液至固相萃取柱的顶部,以每秒一滴的流速过柱。用2mL乙腈水(1 1)淋洗小柱,低真空抽干后,依次用2mL甲醇和两次2mL 5%氨水甲醇溶液洗脱柱上 的待分析成分,合并收集洗脱液。(4)洗脱液在氮吹浓缩装置上40°C的温度下蒸干,加入1. OmL 100mmol/L甲酸 铵乙腈(1 9) pH3. 2振荡溶解残渣后,过0.22 μ m滤膜。滤液供液相色谱-质谱测定三
聚氰胺和三聚氰酸的含量。所制得的固相萃取小柱对牛奶中的三聚氰胺和三聚氰酸具有专一选择性的富集 和纯化,对每克牛奶加标三个添加浓度(三聚氰胺为25 μ g/kg,1000 μ g/kg,2500 μ g/kg, 三聚氰酸为50 μ g/kg, 250 μ g/kg, 2500 μ g/kg),选择三聚氰胺-1%和三聚氰酸」%为 内标,浓度分别为100 μ g/kg和200μ g/kg,以三聚氰胺和三聚氰酸与其内标物在液相色 谱-质谱仪上响应值的比值作对照,三聚氰胺的相对回收率为82.3%,78. 1%,78.5%,三 聚氰酸的相对回收率为83. 2 %,80. 5 %,79. 6 %。实施例2.一、同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相萃取小柱的制备方法(1)同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的功能性填料的制备分别称取120mg 40微米苯磺酸化的苯乙烯二乙烯苯聚合物和80mg 50微米乙二 胺基-N-丙基键合硅胶,充分混勻。(2)同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱的制备称取200mg上述功能性填料,填充于底端为聚乙烯筛板的聚丙烯小柱内,填料上 端再以聚乙烯筛板固定。二、同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱,应用于猪肉中三聚氰胺 和三聚氰酸的分离、富集和纯化(1)称取2g(精确至O.Olg)试样于50mL具塞塑料离心管中,加4mL乙腈水 (1 1) ^P 500 μ L 2moL/L 盐酸,超声提取 15min,在 4°C下 9500r/min 冷冻离心 5min,取 上清液。残渣再用4mL乙腈水(1 1)提取一次,超声15min,9500r/min离心5min,取 上清液,合并两次提取液,加入5mL乙腈饱和正己烷,混勻anin,4°C下9500r/min冷冻离心 5min,弃去正己烷层,下层经乙腈水(1 1)润湿的滤纸过滤后用乙腈水(1 1)稀释 至SmL后作待净化液。(2)将同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱依次用3mL甲醇、3mL乙 腈水(1 1)活化备用。(3)转移SmL样液至固相萃取柱的顶部,以每秒一滴的流速过柱。用2mL乙腈水 (1 1)淋洗小柱,低真空抽干后,依次用2mL甲醇和两次2mL 5%氨水甲醇溶液洗脱柱上 的待分析成分,合并收集洗脱液。(4)洗脱液在氮吹浓缩装置上40°C的温度下蒸干,加入1. OmL 100mmol/L甲酸 铵乙腈(1 9) pH3. 2振荡溶解残渣后,过0.22 μ m滤膜。滤液供液相色谱-质谱测定三
聚氰胺和三聚氰酸的含量。所制得的固相萃取小柱对猪肉中的三聚氰胺和三聚氰酸具有专一选择性的富集 和纯化,对每克猪肉加标三个添加浓度(三聚氰胺为25μ g/kg,75y g/kg,100y g/kg,三聚 氰酸为50 μ g/kg, 150 μ g/kg, 200 μ g/kg),选择三聚氰胺-15N3和三聚氰酸-13C3为内标,浓 度分别为50 μ g/kg和100 μ g/kg,以三聚氰胺和三聚氰酸与其内标物在液相色谱-质谱仪上响应值的比值作对照,三聚氰胺的相对回收率为82. 9 %,88. 1 %,78. 9%,三聚氰酸的相 对回收率为 93. 4%,90. 3%,95. 6%。实施例3.一、同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相萃取小柱的制备方法(1)同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的功能性填料的制备分别称取IOOmg 50微米苯磺酸键合硅胶和IOOmg 50微米氨丙基键合硅胶,充分 混勻。(2)同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱的制备称取200mg上述功能性填料,填充于底端为聚乙烯筛板的聚丙烯小柱内,填料上 端再以聚乙烯筛板固定。二、同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱,应用于虾肉中三聚氰胺 和三聚氰酸的分离、富集和纯化(1)称取2g(精确至O.Olg)试样于50mL具塞塑料离心管中,加4mL乙腈水 (1 1) ^P 500 μ L 2moL/L 盐酸,超声提取 15min,在 4°C下 9500r/min 冷冻离心 5min,取 上清液。残渣再用4mL乙腈水(1 1)提取一次,超声15min,9500r/min离心5min,取 上清液,合并两次提取液,加入5mL乙腈饱和正己烷,混勻anin,4°C下9500r/min冷冻离心 5min,弃去正己烷层,下层经乙腈水(1 1)润湿的滤纸过滤后用乙腈水(1 1)稀释 至SmL后作待净化液。(2)将同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱依次用3mL甲醇、3mL乙 腈水(1 1)活化备用。(3)转移SmL样液至固相萃取柱的顶部,以每秒一滴的流速过柱。用2mL乙腈水 (1 1)淋洗小柱,低真空抽干后,依次用2mL甲醇和两次2mL 5%氨水甲醇溶液洗脱柱上 的待分析成分,合并收集洗脱液。(4)洗脱液在氮吹浓缩装置上40°C的温度下蒸干,加入1. OmL 100mmol/L甲酸 铵乙腈(1 9) pH3. 2振荡溶解残渣后,过0.22 μ m滤膜。滤液供液相色谱-质谱测定三
聚氰胺和三聚氰酸的含量。所制得的固相萃取小柱对虾肉中的三聚氰胺和三聚氰酸具有专一选择性的富集 和纯化,对每克虾肉加标三个添加浓度(三聚氰胺为25 μ g/kg,75 μ g/kg,100 μ g/kg,三聚 氰酸为50 μ g/kg, 150 μ g/kg, 200 μ g/kg),选择三聚氰胺-15N3和三聚氰酸-13C3为内标,浓 度分别为50 μ g/kg和100 μ g/kg,以三聚氰胺和三聚氰酸与其内标物在液相色谱-质谱仪 上响应值的比值作对照,三聚氰胺的相对回收率为94. 6 %,90. 6 %,90. 1 %,三聚氰酸的相 对回收率为 97. 9%,92. 3%, 100. 2%。实施例4.一、同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相萃取小柱的制备方法(1)同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的功能性填料的制备分别称取50mg 50微米丙磺酸键合硅胶和200mg 50微米氨丙基键合硅胶,充分混 勻。(2)同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱的制备称取250mg上述功能性填料,填充于底端为聚乙烯筛板的聚丙烯小柱内,填料上端再以聚乙烯筛板固定。二、同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱,应用于蜂蜜中三聚氰胺 和三聚氰酸的分离、富集和纯化(1)称取Ig试样于50mL具塞塑料离心管中,加8mL乙腈水(1 1) ^P 50 μ L 2moL/L盐酸,混勻后超声提取15min,经乙腈水(1 1)润湿的滤纸过滤后作待净化液。(2)将同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱依次用3mL甲醇、3mL乙 腈水(1 1)活化备用。(3)转移SmL样液至固相萃取柱的顶部,以每秒一滴的流速过柱。用2mL乙腈水 (1 1)淋洗小柱,低真空抽干后,依次用2mL甲醇和两次2mL 5%氨水甲醇溶液洗脱柱上 的待分析成分,合并收集洗脱液。(4)洗脱液在氮吹浓缩装置上40°C的温度下蒸干,加入1. OmL 100mmol/L甲酸 铵乙腈(1 9) pH3. 2振荡溶解残渣后,过0.22 μ m滤膜。滤液供液相色谱-质谱测定三
聚氰胺和三聚氰酸的含量。所制得的固相萃取小柱对蜂蜜中的三聚氰胺和三聚氰酸具有专一选择性的富集 和纯化,对每克蜂蜜加标三个添加浓度(三聚氰胺为25 μ g/kg,75 μ g/kg,100 μ g/kg,三聚 氰酸为50 μ g/kg, 150 μ g/kg, 200 μ g/kg),选择三聚氰胺-15N3和三聚氰酸-13C3为内标,浓 度分别为50 μ g/kg和100 μ g/kg,以三聚氰胺和三聚氰酸与其内标物在液相色谱-质谱仪 上响应值的比值作对照,三聚氰胺的相对回收率为83. 6 %,76. 2 %,89. 5%,三聚氰酸的相 对回收率为 85. 9%,78. 3%,78. 5%。实施例5.一、同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相萃取小柱的制备方法(1)同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的功能性填料的制备分别称取50mg 40微米丙磺酸化的苯乙烯二乙烯苯聚合物和500mg 50微米氨丙 基键合硅胶,充分混勻。(2)同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱的制备称取550mg上述功能性填料,填充于底端为聚乙烯筛板的聚丙烯小柱内,填料上 端再以聚乙烯筛板固定。二、同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱,应用于奶粉中三聚氰胺 和三聚氰酸的分离、富集和纯化(1)称取lg(精确至O.Olg)奶粉于50mL具塞塑料离心管中,加入4mL去离子水 溶解,然后加4mL乙腈和500 μ L 2moL/L盐酸,混勻后超声提取15min,在4°C下9500r/min 冷冻离心5min,取上清液2mL,经乙腈水(1 1)润湿的滤纸过滤后用去离子水稀释5mL 作待净化液。(2)将同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱依次用3mL甲醇、3mL乙 腈水(1 1)活化备用。(3)转移5mL样液至固相萃取柱的顶部,以每秒一滴的流速过柱。用2mL乙腈水 (1 1)淋洗小柱,低真空抽干后,依次用2mL甲醇和两次2mL 5%氨水甲醇溶液洗脱柱上 的待分析成分,合并收集洗脱液。(4)洗脱液在氮吹浓缩装置上40°C的温度下蒸干,加入1. OmL 100mmol/L甲酸铵乙腈(1 9) pH3. 2振荡溶解残渣后,过0.22 μ m滤膜。滤液供液相色谱-质谱测定三
聚氰胺和三聚氰酸的含量。所制得的固相萃取小柱对奶粉中的三聚氰胺和三聚氰酸具有专一选择性的富集 和纯化,对每克奶粉加标三个添加浓度(三聚氰胺为50 μ g/kg,1000 μ g/kg,2500 μ g/kg, 三聚氰酸为100 μ g/kg, 250 μ g/kg, 2500 μ g/kg),选择三聚氰胺-1%和三聚氰酸」%为 内标,浓度分别为100 μ g/kg和200μ g/kg,以三聚氰胺和三聚氰酸与其内标物在液相色 谱-质谱仪上响应值的比值作对照,三聚氰胺的相对回收率为82.3%,78. 1%,75.5%,三 聚氰酸的相对回收率为113.2%,110.5%,109.6%o实施例6.一、同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相萃取小柱的制备方法(1)同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的功能性填料的制备分别称取50mg 30微米苯磺酸化的苯乙烯二乙烯苯聚合物和IOOmg 50微米乙二 胺基-N-丙基键合硅胶,充分混勻。(2)同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱的制备称取150mg上述功能性填料,填充于底端为聚乙烯筛板的聚丙烯小柱内,填料上 端再以聚乙烯筛板固定。二、同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱,应用于饲料中三聚氰胺 和三聚氰酸的分离、富集和纯化(1)称取lg(精确至0. Olg)饲料于50mL具塞塑料离心管中,加入4mL去离子水混 合,然后加4mL乙腈和500 μ L 2moL/L盐酸,混勻后超声提取15min,在4°C下9500r/min冷 冻离心5min,取上清液,经乙腈水(1 1)润湿的滤纸过滤后用去离子水稀释至SmL作待 净化液。(2)将同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱依次用3mL甲醇、3mL乙 腈水(1 1)活化备用。(3)转移SmL样液至固相萃取柱的顶部,以每秒一滴的流速过柱。用2mL乙腈水 (1 1)淋洗小柱,低真空抽干后,依次用2mL甲醇和两次2mL 5%氨水甲醇溶液洗脱柱上 的待分析成分,合并收集洗脱液。(4)洗脱液在氮吹浓缩装置上40°C的温度下蒸干,加入1. OmL 100mmol/L甲酸 铵乙腈(1 9) pH3. 2振荡溶解残渣后,过0.22 μ m滤膜。滤液供液相色谱-质谱测定三
聚氰胺和三聚氰酸的含量。所制得的固相萃取小柱对饲料中的三聚氰胺和三聚氰酸具有专一选择性的富集 和纯化,对每克饲料加标三个添加浓度(三聚氰胺为50 μ g/kg, 1000 μ g/kg, 2500 μ g/kg, 三聚氰酸为100 μ g/kg, 250 μ g/kg, 2500 μ g/kg),选择三聚氰胺-1%和三聚氰酸」%为 内标,浓度分别为100 μ g/kg和200μ g/kg,以三聚氰胺和三聚氰酸与其内标物在液相色 谱-质谱仪上响应值的比值作对照,三聚氰胺的相对回收率为92. 3%,98. 1%,91.5%,三 聚氰酸的相对回收率为103. 2%, 100. 5%, 109. 6%0实施例7.一、同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相萃取小柱的制备方法(1)同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的功能性填料的制备
分别称取IOOmg 50微米苯磺酸化的苯乙烯二乙烯苯聚合物和150mg 60微米氰基 键合硅胶,充分混勻。(2)同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱的制备称取250mg上述功能性填料,填充于底端为聚乙烯筛板的聚丙烯小柱内,填料上 端再以聚乙烯筛板固定。二、同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱,应用于肠衣中三聚氰胺 和三聚氰酸的分离、富集和纯化(1)称取2g(精确至O.Olg)试样于50mL具塞塑料离心管中,加4mL乙腈水 (1 1) ^P 500 μ L 2moL/L 盐酸,超声提取 15min,在 4°C下 9500r/min 冷冻离心 5min,取 上清液。残渣再用4mL乙腈水(1 1)提取一次,超声15min,9500r/min离心5min,取 上清液,合并两次提取液,加入5mL乙腈饱和正己烷,混勻anin,4°C下9500r/min冷冻离心 5min,弃去正己烷层,下层经乙腈水(1 1)润湿的滤纸过滤后用乙腈水(1 1)稀释 至SmL后作待净化液。(2)将同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱依次用3mL甲醇、3mL乙 腈水(1 1)活化备用。(3)转移SmL样液至固相萃取柱的顶部,以每秒一滴的流速过柱。用2mL乙腈水 (1 1)淋洗小柱,低真空抽干后,依次用2mL甲醇和两次2mL 5%氨水甲醇溶液洗脱柱上 的待分析成分,合并收集洗脱液。(4)洗脱液在氮吹浓缩装置上40°C的温度下蒸干,加入1. OmL 100mmol/L甲酸 铵乙腈(1 9) pH3. 2振荡溶解残渣后,过0.22 μ m滤膜。滤液供液相色谱-质谱测定三
聚氰胺和三聚氰酸的含量。所制得的固相萃取小柱对肠衣中的三聚氰胺和三聚氰酸具有专一选择性的富集 和纯化,对每克肠衣加标三个添加浓度(三聚氰胺为25 μ g/kg,75 μ g/kg,100 μ g/kg,三聚 氰酸为50 μ g/kg, 150 μ g/kg, 200 μ g/kg),选择三聚氰胺-15N3和三聚氰酸-13C3为内标,浓 度分别为50 μ g/kg和100 μ g/kg,以三聚氰胺和三聚氰酸与其内标物在液相色谱-质谱仪 上响应值的比值作对照,三聚氰胺的相对回收率为79. 9 %,85. 3 %,80. 9%,三聚氰酸的相 对回收率为 103. 5%, 100. 3%, 105. 8% 0实施例8.一、同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相萃取小柱的制备方法(1)同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的功能性填料的制备分别称取200mg 30微米丙磺酸化的苯乙烯二乙烯苯聚合物和150mg 40微米二醇 基键合硅胶,充分混勻。(2)同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱的制备称取350mg上述功能性填料,填充于底端为聚乙烯筛板的聚丙烯小柱内,填料上 端再以聚乙烯筛板固定。二、同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱,应用于蛋白粉中三聚氰 胺和三聚氰酸的分离、富集和纯化(1)称取Ig (精确至0. Olg)蛋白粉于50mL具塞塑料离心管中,加入4mL去离子水 溶解,然后加4mL乙腈和500 μ L 2moL/L盐酸,混勻后超声提取15min,在4°C下9500r/min
12冷冻离心5min,取上清液2mL,经乙腈水(1 1)润湿的滤纸过滤后用去离子水稀释5mL 作待净化液。(2)将同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸分子的固相萃取小柱依次用3mL甲醇、3mL乙 腈水(1 1)活化备用。(3)转移5mL样液至固相萃取柱的顶部,以每秒一滴的流速过柱。用2mL乙腈水 (1 1)淋洗小柱,低真空抽干后,依次用2mL甲醇和两次2mL 5%氨水甲醇溶液洗脱柱上 的待分析成分,合并收集洗脱液。(4)洗脱液在氮吹浓缩装置上40°C的温度下蒸干,加入l.OmL 100mmol/L甲酸 铵乙腈(1 9) pH3. 2振荡溶解残渣后,过0.22 μ m滤膜。滤液供液相色谱-质谱测定三
聚氰胺和三聚氰酸的含量。所制得的固相萃取小柱对蛋白粉中的三聚氰胺和三聚氰酸具有专一选择性的富 集和纯化,对每克蛋白粉加标三个添加浓度(三聚氰胺为50 μ g/kg,1000 μ g/kg,2500 μ g/ kg,三聚氰酸为100 μ g/kg, 250 μ g/kg, 2500 μ g/kg),选择三聚氰胺-15N3和三聚氰酸」% 为内标,浓度分别为100μ g/kg和200μ g/kg,以三聚氰胺和三聚氰酸与其内标物在液相色 谱-质谱仪上响应值的比值作对照,三聚氰胺的相对回收率为92. 2 %,88. 5 %,95. 6 %,三 聚氰酸的相对回收率为109. 3%, 106. 5%,99.8%0
权利要求
1.一种同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相萃取小柱,包括外壳、筛板和填料,其特征 在于所述填料为强阳离子交换填料和亲水性键合相硅胶。
2.如权利要求1所述的同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相萃取小柱,其特征在于, 所述强阳离子交换填料为选自苯磺酸化的苯乙烯二乙烯苯聚合物、丙磺酸化的苯乙烯二乙 烯苯聚合物、苯磺酸键合硅胶、丙磺酸键合硅胶中的至少一种。
3.如权利要求2所述的同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相萃取小柱,其特征在于, 所述强阳离子交换填料粒径为30 100微米。
4.如权利要求1所述的同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相萃取小柱,其特征在于, 所述亲水性键合相硅胶为选自乙二胺基-N-丙基键合硅胶、氨丙基键合硅胶、氰基键和硅 胶、二醇基键和硅胶中的至少一种。
5.如权利要求4所述的同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相萃取小柱,其特征在于, 所述亲水性键合相硅胶粒径为40 100微米。
6.如权利要求1-5中任一权利要求所述的同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相萃取 小柱,其特征在于,所述强阳离子交换填料和所述亲水性键合相硅胶的重量比为1 0.5 1 10。
7.一种同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相萃取小柱的制备方法,其特征在于包括以 下步骤分别称取强阳离子交换填料和亲水性键合相硅胶,填充于底端具有筛板的小柱内, 填料上端再以筛板固定。
8.如权利要求7所述的同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相萃取小柱的制备方法,其 特征在于,所述强阳离子交换填料为选自苯磺酸化的苯乙烯二乙烯苯聚合物、丙磺酸化的 苯乙烯二乙烯苯聚合物、苯磺酸键合硅胶、丙磺酸键合硅胶中的至少一种。
9.如权利要求7所述的同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相萃取小柱的制备方法,其 特征在于,所述强阳离子交换填料粒径为30 100微米。
10.如权利要求7所述的同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相萃取小柱的制备方法, 其特征在于,所述亲水性键合相硅胶为选自乙二胺基-N-丙基键合硅胶、氨丙基键合硅胶、 氰基键和硅胶、二醇基键和硅胶中的至少一种。
11.如权利要求7所述的同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相萃取小柱的制备方法, 其特征在于,所述亲水性键合相硅胶粒径为40 100微米。
12.如权利要求7-11中任一项权利要求所述的同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相 萃取小柱的制备方法,其特征在于,所述强阳离子交换填料和所述亲水性键合相硅胶的比 例为重量比1 0. 5 1 10。
13.一种利用如权利要求1所述的固相萃取小柱同时萃取样品中三聚氰胺和三聚氰酸 的方法,其特征在于包括以下步骤a、从样品中提取三聚氰胺和三聚氰酸获得待净化液;b、将所述固相萃取小柱依次用2 6mL甲醇、2 6mL乙腈-水活化;c、转移所述待净化液至所述固相萃取柱的顶部,以每秒一滴的流速过柱,用1 3mL乙 腈-水淋洗小柱,低真空抽干固相萃取柱后,依次用1 3mL甲醇和1 3mL 5%氨水甲醇 溶液洗脱柱上的待分析成分,合并收集洗脱液,在氮吹浓缩装置上蒸干后供液相色谱-质 谱测定。
14.如权利要求13所述的同时萃取样品中三聚氰胺和三聚氰酸的方法,其特征在于, 所述乙腈-水中乙腈与水的体积比为1 1。
15.如权利要求13所述的同时萃取样品中三聚氰胺和三聚氰酸的方法,其特征在于, 用1 3mL 5%氨水甲醇溶液洗脱2次。
16.如权利要求13-15中任一项权利要求所述的同时萃取样品中三聚氰胺和三聚氰酸 的方法,其特征在于,所述样品是动物源性食品。
17.如权利要求16所述的同时萃取样品中三聚氰胺和三聚氰酸的方法,其特征在于可 通过以下步骤从样品中提取三聚氰胺和三聚氰酸获得待净化液a、称取1 2g试样于具塞塑料离心管中,加4 SmL乙腈-水和50 500μ L盐酸溶 液,超声提取,冷冻离心5 8min,取上清液;b、残渣再用4 SmL乙腈-水提取超声,冷冻离心5 8min,取上清液;c、合并两次提取液,加入5 IOmL乙腈饱和正己烷,混勻后冷冻离心5 8min,弃去正 己烷层,下层经乙腈-水润湿的滤纸过滤后用乙腈-水稀释后作待净化液。
18.如权利要求13-15中任一项权利要求所述的同时萃取样品中三聚氰胺和三聚氰酸 的方法,其特征在于,所述样品是液态食品。
19.如权利要求18所述的同时萃取样品中三聚氰胺和三聚氰酸的方法,其特征在于可 通过以下步骤从样品中提取三聚氰胺和三聚氰酸获得待净化液a、称取1 2g试样于具塞塑料离心管中,加2 4mL乙腈和50 500μ L盐酸溶液, 超声提取,冷冻离心5 8min,取上清液;b、经乙腈-水润湿的滤纸过滤后用乙腈-水稀释后作待净化液。
20.如权利要求13-15中任一项权利要求所述的同时萃取样品中三聚氰胺和三聚氰酸 的方法,其特征在于,所述样品是蜂蜜。
21.如权利要求20所述的同时萃取样品中三聚氰胺和三聚氰酸的方法,其特征在于可 通过以下步骤从样品中提取三聚氰胺和三聚氰酸获得待净化液a、称取1 2g试样于具塞塑料离心管中,加4 SmL乙腈-水和50 500μ L盐酸溶 液,超声提取,冷冻离心5 8min,取上清液;b、经乙腈-水润湿的滤纸过滤后用乙腈-水稀释后作待净化液。
22.如权利要求13-15中任一项权利要求所述的同时萃取样品中三聚氰胺和三聚氰酸 的方法,其特征在于,所述样品是选自固体食品和饲料的至少一种。
23.如权利要求22所述的同时萃取样品中三聚氰胺和三聚氰酸的方法,其特征在于可 通过以下步骤从样品中提取三聚氰胺和三聚氰酸获得待净化液a、称取1 2g试样于具塞塑料离心管中,加2 4mL去离子水溶解,然后加2 4mL 乙腈和50 500 μ L盐酸溶液,超声提取,冷冻离心5 8min,取上清液;b、经乙腈-水润 湿的滤纸过滤后用乙腈-水稀释后作待净化液。
24.如权利要求17、19、21、23中任一项权利要求所述的同时萃取样品中三聚氰胺和三 聚氰酸的方法,其特征在于,所述盐酸溶液的浓度为2mol/L,所述乙腈-水中乙腈与水的体 积比为1 1。
25.如权利要求1所述的固相萃取小柱在三聚氰胺和三聚氰酸含量测定中的应用。
26.如权利要求13所述的同时萃取样品中三聚氰胺和三聚氰酸的方法在三聚氰胺和三聚氰酸含量测定中的应用。
全文摘要
本发明涉及分析化学、食品安全领域,具体涉及同时萃取三聚氰胺和三聚氰酸的固相萃取小柱及制备方法和应用,该固相萃取小柱包括强阳离子交换填料和亲水性键合相硅胶,制备时分别称取一定量30~100微米强阳离子交换填料和40~100微米亲水性键合相硅胶,填充于底端具有筛板的小柱内,填料上端再以筛板固定。本发明萃取小柱可应用于各类食品和饲料中三聚氰胺和三聚氰酸的分离、富集和纯化,主要包括提取和净化两个步骤。本发明能够快速、准确、高效地萃取各类食品中的三聚氰胺和三聚氰酸,结合质谱方法实现快速同时检测,使三聚氰胺和三聚氰酸的定性和定量更准确更高效。
文档编号B01D15/22GK102133488SQ20101010130
公开日2011年7月27日 申请日期2010年1月26日 优先权日2010年1月26日
发明者夏敏勇, 张晓梅, 赵善贞, 邓晓军, 郭德华 申请人:上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心, 上海安谱科学仪器有限公司
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