专利名称：微尺度颗粒特异性连续分离的方法
技术领域：
本发明属于化学领域中的富集与分离方法及装置，特别涉及一种微尺度颗粒特异性连续分离方法，特别适用于不带电中性颗粒的特异性分离。
背景技术：
在目前绝大部分应用中,所使用的介电电泳(Dielectrophoresis, DEP)力仅在空间上发生变化，而不随时间的变化而改变，是一种时间上连续的力场即连续型DEP。利用这一技术已实现了多种对颗粒进行分离和单颗粒/细胞捕捉的微器件。下面将首先简要介绍这种时间上连续的DEP力场的研究，随后阐述另外一种时间上不连续的DEP力场形式，脉冲型DEP的研究现状。微尺度下，与其他的分离手段类似，基于连续型DEP力场的颗粒分离通 常可以被分为如下两类时域上的分离和空间上的分离。I)连续型介电电泳颗粒分离现状 时域上的分离在这种分离模式中，样品一般通过缓冲液被引入，样品内的颗粒由于运动能力上的差异在流动方向逐渐分开，依次通过下游放置的检测器，最后从出口流出。例如，在DEP-FFF (Field-Flow Fractionation)方法1’2中，由于不同颗粒在垂直方向上承受不同的DEP力与重力，造成各自平衡位置的差异，它们将分别处于抛物线速度抛面的不同层，由此，颗粒具有了不同的移动速度并最终形成分离，如图I。图I是已知的一种分离多种颗粒混合物的DEP场流动分离方法，在Fdepz和颗粒重力及浮力相互作用下，不同的颗粒将分别处于抛物线速度剖面的不同层，从而形成不同的移动速度，流过一段距离后产生分离3。 空间上的分离在这种分离模式中，样品在连续进样的情况下从进口被引入，不同的颗粒在分离后呈现出与主流垂直的展向位置上的分布，可以通过预先设置不同的出口被收集。例如，通过微管道侧壁上安放电极，在水平方向上引入与主流垂直的力，就可以利用不同颗粒在横向运动能力上的差异进行分离，这一类方法统称为横向DEP分离(LateralDielectrophoresis Separation)4-6，如图 2 所不。图2是一种分离多种颗粒混合物的横向DEP方法，在横向DEP力的作用下颗粒具有不同的位置，在不同的出口处被收集，U为电压，f为频率6另外，通过在微管道内部产生溶液电导率的梯度分布，不同表面特性的颗粒会在不同位置处得到零DEP力，以此为依据进行的分离称为等介电分离(Iso-dielectricSeparation)7，如图3所不。图3是分离多种颗粒混合物的等介电分离方法7。图中，(a)图为实验布局由两个进口、一个建立电导率梯度的扩散混合器、分离通道、成对角线排列的电极和两个出口组成。(b)图为实验过程不同电导率的细胞随流体进入有倾斜电极的微通道，DEP力和流体力相互作用使细胞运动到不同的展向位置，随电导率的递减方向到达等介电点，右图是荧光聚苯乙烯颗粒在电极下偏移到达等介电点。 国内研究现状针对基于DEP的微流控芯片的研究，国内也开展了大量的研究工作。近年来，随着国家对相关领域的投入及硬件条件的改善，出现的一批很好的研究成果。国内研究机构主要包括清华大学、东南大学、中科院电子所、浙江大学、重庆大学和华中理工大学等。所涉及的主要研究内容主要包括发展新型的DEP控制方法8、设计新型DEP电极9、研究DEP应用中涉及的一些基本理论1°_12以及寻找具体的应用13，14等。 存在的问题基于连续型DEP技术的颗粒分离与捕捉研究已有相当长时间的研究积淀，积累了丰富的研究成果，但也存在一定的问题；现有方法一般会产生顺序分离 的效果，即所依赖的分离特性在分离后单调增加或减少，或者产生二元分离(图4)的效果，即样品根据所依赖的分离特性的临界值被一分为二15。如果利用连续型DEP技术实现对特定目标颗粒物的提取，整个过程至少需要经过两次分离去完成，尚缺乏在连续进样条件下单步提取所需目标颗粒物的能力和手段。图4中，二元分离15，黑色和白色圆球表示两种类型的颗粒；在电场打开的时候黑色颗粒在正介电电泳力下被吸引至电极边缘而白色颗粒随流体流出图(A);当白色颗粒完全流出的时候，关掉电场，此时黑色颗粒也随流体流出图(B )。其次，忽略了颗粒间的相互作用导致分离效果较差。当分离区域同时出现两类以上颗粒时，现有的采用调节流体粘性力与DEP力之间相对强度的办法，大都忽略了颗粒间相互作用力，这些相互作用力伴随电场和流场的存在而存在，不可避免。被冲走的颗粒将通过这种相互作用力对另一种颗粒产生影响，导致颗粒粘连，最终影响分离的纯度。2)基于脉冲型DEP的颗粒分离研究现状除了连续力场之外，时变力场也可以对颗粒进行控制。例如，在热/布朗运动棘轮(Thermal/Brownian Ratchet)中16’17，通过反复“开”、“关” 一组非对称电极可以产生间断的吸引力，通过与热运动的结合就可以实现对纳米颗粒的移动。然而，对于微米或稍大的颗粒，由于分子热运动不是很显著，热/布朗运动棘轮方法将不再适用。在宏观系统中，巴西果效应(Brazil Nut Effect, BNE)或振动流化床是应用时变力场进行颗粒分离与富集的典型方法，是软物质和工程领域的研究热点之一18_2°。通过调节振动外力的相对强度及频率，可以实现不同尺寸颗粒混合物在容器内的分层富集，形成普通的BNE效应(大粒子居于最上层)、Reversed BNE效应(大粒子居于最下层)以及介于两者之间的Sandwich结构(大粒子居于中间位置)。从上述两个例子可以，时变力场的应用会带来意想不到的效果，将它引入微尺度颗粒的控制中，会有助于发展更为灵活的控制方式。因此，借鉴上述时变力场的思想，将开关DEP方法即脉冲型DEP应用到微米级颗粒的分离中21。 基于脉冲型DEP的颗粒分离研究现状在由微通道和位于流道底部垂直于主流的条带型电极构成的微流控芯片上，利用流道顶部呈周期性分布的nDEP力场和抛物线的流体速度剖面，并以较低的频率(〈10Hz)“开”、“关^DEP力场实现了特定的颗粒分离，即脉冲型介电电泳颗粒分离技术。目前，已经实现了在单步内对3 ii m、5 ii m和10 ii m聚苯乙烯微球中任意一种进行提取21。通过已建立的简化模型可以看出该方法是由基于强度的分离模式和基于速度分离模式共同作用的结果，通过频率这个额外的参数可以灵活地控制流体和颗粒间的相互作用，而颗粒的最终状态则取决于“收”和“放”的程度。 存在的问题可以看出，脉冲型DEP技术已体现出不同于或强于连续型DEP的一些特点，但是对它的研究还停留在初期阶段，仍存在一些亟待解决的问题，比如，仅开展了针对聚苯乙烯微球或酵母菌的研究工作，需要通过更多的颗粒类型对该方法的可靠性进行检验；尚未实现在连续进样条件下颗粒的空间多路分离问题；在已开展的针对目标颗粒物进行提取的实验中，所使用的条带型电极与主流方向垂直，所提取的颗粒物停留在电极的上游，而不需要的颗粒则被冲至下游，受限于电极的宽度，如果所提取的颗粒一旦占满了整个电极或聚集成团22，该方法就会失效，如图5。这就意味着该方法仅能对非常微量的样品进行所需颗粒的提取，而解决这一问题的途径就是去建立一种在连续进样条件下针对任意目标颗粒进行提取的方法，而满足这一条件的方法同时必然是一种可调多路分离方法。
图5是电场和流场作用下的颗粒聚集22。其中图(a)是微通道和叉指型电极实验装置。图(b)的左图表示在实验过程中颗粒呈“Y”字形聚集，图(b)的右图是数值仿真揭示颗粒在静电场和流体作用下的聚集。以下是与本申请的相关参考文献IWang XB, Yang J, Huang Y, Vykoukal J, Becker FF, GascoyneP.Cell separation by dielectrophoretic field-flow-fractionationJ.AnalChem. 2000. 72(4) : 832-839。2Huang Y,ffang XB,Becker FF,Gascoyne PR. Introducingdielectrophoresisas a new force field for field-flow fractionationJ
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发明内容
本发明的目的在于，提供一种微尺度颗粒特异性分离方法，以解决颗粒的聚团问题，实现颗粒的连续可调多路分离。为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案一种微尺度颗粒特异性分离方法，其特征在于，该方法采用微尺度颗粒特异性连续分离的介电电泳微流控芯片，在连续进样条件下，通过整流速与脉冲频率，以三种不同尺寸聚苯乙烯微球的混合物为例，可实现连续可调的多路分离。由于三种粒径颗粒受到的DEP力和Stokes力不同，会运动到通道的不同展向位置。直接提取中等大小颗粒是这一方法的典型情况，此时，5 μ m会在流道上游始终沿着电极倾斜方向运动,3 μ m颗粒由于粒径较小基本随着主流向前运动，而10 μ m颗粒受到电场和流场扰动比较大，会运动到管道的另一侦牝从而使得三种颗粒从不同的出口流出，分别得到3μπι、5μπι和ΙΟμπι聚苯乙烯颗粒。通过调节参数，可以获得对其他颗粒的提取。从而避免传统方法提取中等颗粒至少需要两次分尚的过程。所述的微尺度颗粒特异性连续分离的介电电泳微流控芯片包括缓冲液进口和颗粒进口，倾斜角度介于45度到60度之间的电极，3 μ m颗粒出口、10 μ m颗粒出口、5 μ m颗粒出口和微通道，其中，微通道上表面有PDMS，电极与外加的交变信号相连接。 本发明采用的微尺度颗粒特异性连续分离的介电电泳微流控芯片，倾斜电极可以有效地克服垂直电极所产生的管道堵塞问题，可实现高通量连续可调多路颗粒分离，且倾斜角度介于45度到60度之间分离效果最佳。
图I是已知的一种分离多种颗粒混合物的DEP场流动分离方法示意图。图2是已知的一种分离多种颗粒混合物的横向DEP方法示意图。图3是已知的分离多种颗粒混合物的等介电分离方法示意图，图中，Ca)图为实验布局。(b)图为实验过程。图4为二元分离示意图。其中图(A)是在电场打开的时候黑色颗粒在正介电电泳力下被吸引至电极边缘而白色颗粒随流体流出，图(B)是当白色颗粒完全流出的时候，关掉电场，此时黑色颗粒也随流体流出。图5是电场和流场作用下的颗粒聚集22。其中图(a)是微通道和叉指型电极实验装置。图(b)的左图表示在实验过程中颗粒呈“Y”字形聚集，图(b)的右图是数值仿真揭示颗粒在静电场和流体作用下的聚集。图6是直径5 μ m的颗粒在电场和流场共同作用下所产生的在流动方向的速度分量。图7是在电极倾斜60度时，得到的颗粒分离的结果图片，其中，从左至右依次为Ca)图片，t=5s ； (b)图片，t=14s ； (c)图片，t=24s。图8是电极倾斜角度对于分离结果的影响。其中(a)图是颗粒分离后展向间距(俯视图)，(b)图是不同夹角下3μπι与10 μ m颗粒分离结束后展向间距。图9是微尺度颗粒特异性连续分离的介电电泳微流控芯片的模型示意图。图10是微尺度颗粒特异性连续分离的介电电泳微流控芯片制备工艺流程图。图11是电极与通道键合以后的微尺度颗粒特异性连续分离的介电电泳微流控芯片的图片。图12是5μπι颗粒与3μπι颗粒在倾斜电极下的运动图片，其中，从左至右依次为t=0s ；t=8s ;t=23s。图13是微尺度颗粒特异性连续分离的介电电泳微流控芯片的具体结构图，其中，图A是俯视图，图B为侧视图。
以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。
具体实施例方式按照本发明的技术方案，本发明的微尺度颗粒特异性分离方法，采用一种微尺度颗粒特异性连续分离的介电电泳微流控芯片，在连续进样条件下，通过整流速与脉冲频率，对三种不同尺寸聚苯乙烯微球混合物进行连续可调多路分离，由于三种粒径颗粒受到的DEP力和Stokes力不同，会运动到通道的不同展向位置，5 μ m颗粒会在流道上游始终沿着电极倾斜方向运动，3 μ m颗粒由于粒径较小基本随着主流向前运动,而10 μ m颗粒受到电场和流场扰动比较大，会运动到管道的另一侧，从而使得三种颗粒从不同的出口流出，分别得到3 μ m、5 μ m和10 μ m聚苯乙烯颗粒。微尺度颗粒特异性连续分离的介电电泳微流控芯片 的结构参见图13，包括缓冲液进口 I和颗粒进口 2，倾斜角度介于45度到60度之间的电极5，3 μ m颗粒出口 3、IOym颗粒出口 4、5μ m颗粒出口 6和微通道7，其中，微通道7上表面有PDMS (8)，电极5与外加的交变信号相连接。I)分离原理图6给出了直径5 μ m的颗粒在电场和流场共同作用下所产生的在流动方向的速度分量。其中，颗粒速度中流场贡献的部分为Uf，保持不变，颗粒速度中介电电泳力诱导的速度为Udep，沿流动方向呈周期性分布，而颗粒的最终速度为两部分之和，具有周期性且向上偏置了 Uf。若Udep的峰值大于Uf,图6中将出现颗粒速度为零的点，意味着此时DEP足以克服Stokes力,保留该颗粒,这是本申请所研究的情形,若Udep的峰值小于Uf,此时颗粒速度全部大于零，没有交点，意味着流场主导，颗粒将被冲至下游。在图6中，UDEP+Uf与速度为零的线有两个交点，根据方向的不同分别称为稳定点与分离点。在稳定点，颗粒上下游的速度均指向该点，即使在存在扰动的情况下，颗粒仍稳定处于该位置；在分离点，尽管该点速度为零，但上下游速度指向相反，在有扰动存在的情况下，颗粒会失稳，向上下游的稳定点运动。在动态分离过程中，分离点具有重要的作用。考虑初始电场为“开”状态且DEP力足够大时，此时颗粒将停留在稳定点，随后研究开关DEP力场过程中颗粒的运动。当DEP力场关闭后，颗粒仅受到流场的Stokes力作用，开始向下游运动，一段时间后再打开DEP力场。如果颗粒此时运动至分离点上游侧，那么它将在指向左侧的DEP力的作用下被推回到初始位置；如果颗粒运动到分离点下游侧，那么DEP打开时，颗粒将被指向右侧的DEP力推至下游另一稳定点。因此，通过调整DEP开关的周期，颗粒就有可能经历在稳定点附近的振荡或产生向下游的净运动。需要指出，在传统的连续型DEP中，被保留的颗粒始终处于稳定点，DEP力连续作用在目标颗粒上，颗粒没有机会运动到分离点，因此对该位置的研究通常没有涉及。图6中，各速度间的关系为UDEP为单纯电场作用于颗粒上的速度;Uf为单纯流体的速度；UDEP+Uf为电场和流场同时作用于颗粒所获得的速度。2)通过数值仿真得到了连续可调多路的颗粒分离结果在电极倾斜60度时，得到了颗粒分离的结果(如图7)，通过定义颗粒分离后的展向间距Λ d，并用此参数衡量颗粒分离后的纯度，证明了电极倾斜角度在45度到60度时分离效果较理想(如图8)。图7中，连续进样、倾斜电极下颗粒在不同时刻所处的位置(俯视图)；黑色条带是电极，白色为两电极之间的绝缘部分，三种圆球分别为直径是3 μ m、5 μ m和10 μ m的聚苯乙烯颗粒,平均流速30 μ m/s,电压8V,周期2. 4s。图8是电极倾斜角度对于分离结果的影响。(a)图颗粒分离后展向间距(俯视图)，灰色条状为流道底部叉指分布的电极，β为电极倾斜角度，Ad为分离后3μηι颗粒与10 μ m颗粒在展向位置上的中心间距；(b)图不同夹角下3μπι与10 μ m颗粒分离结束后展向间距；图中曲线由多个数据点拟合而得，计算参数为平均流速30 μ m/s,流道宽度100 μ m03)在数值仿真的基础上，通过实验验证了该方法的可行性。a.实验装置示意图 图9是微尺度颗粒特异性连续分离的介电电泳微流控芯片的模型示意图(俯视图)，主要由缓冲液进口、出口、颗粒悬浮液进口(微通道)和电极组成，图中的灰色条状表示电极，三种小球表示3 μ m、5 μ m和10 μ m的聚苯乙烯颗粒，电极倾斜60度。在进口处，由于缓冲液进口速度大于颗粒悬浮液进口速度，导致颗粒被引导至通道一侧，在nDEP力的作用下，由于各自运动能力和所受nDEP力的差异,5 μ m颗粒保留在流道上游,3 μ m和10 μ m颗粒进入不同的通道出口；b.根据以上微尺度颗粒特异性连续分离的介电电泳微流控芯片的结构示意图，利用图10所示的工艺流程进行制备，主要包括电极和流道的制备两个部分，其中电极制备包括的步骤有用传统的方法将ITO玻璃清洗(去离子水、丙酮)，N2或压缩空气吹干，涂胶(NR9-1000p)，均胶(800r/min，加速5s，旋转10s)，150°C前烘6min，曝光40s (不同光强曝光时间不同)，100°C后烘6min，RD6显影20s，刻蚀6_8min，用RR41去胶液去胶l_2min，冲洗(去离子水)N2或压缩空气吹干，得到ITO电极。流道制备包括的步骤有硅片涂胶(SU-8T2025)均胶第一级(800r/min，加速5s，旋转 IOs);第二级(3000r/min，加速 10s，旋转 30s);先 65°C烘干 lmin，再 95°C烘干 6min ；曝光80s (不同光强曝光时间不同),SU-8显影液4-5min,异丙醇、去离子水冲洗/N2或压缩空气吹干；65°C烘烤30min-60min ；将PDMS与固化剂按10:1混合，混合后抽真空30min，将PDMS浇筑到烘烤后的硅片上,放置24h或烘烤l_2h。按照图10的制备工艺，最后将ITO电极和硅片(通道)键合，加工得到了微尺度颗粒特异性连续分离的介电电泳微流控芯片的结构如图11所示，在图11中，引线通过导电胶带与ITO电极连接在一起。通过调整微尺度颗粒特异性连续分离的介电电泳微流控芯片的流速与脉冲频率，得到了 5 μ m颗粒与3 μ m颗粒在倾斜电极下的运动,如从图12中可看出，5 μ m的颗粒始终沿着电极倾斜方向运动，由图12可知，Stokes力的两个分量中垂直于电极方向的分量与DEP力相互抵消，另一个分量促使5 μ m的颗粒沿着倾斜电极运动。在同一电压和流速下，3 μ m颗粒由于粒径较小,DEP力相比于Stokes力很小，电场对于3 μ m颗粒的运动影响较微弱，其基本是随着主流的运动而运动。这和数值仿真得到的结果基本一致。图12中，5μπι颗粒被保留，3μπι颗粒被释放(俯视图)。图中白色圆圈内为5μπι聚苯乙烯颗粒，黑色圆圈内为3 μ m聚苯乙烯颗粒，灰色条带型的阴影部分即位于流道底部呈叉指型分布的电极，电极倾斜60度,主流的流动方向如图所示，f = I. 5Hz, V = 17Vpp,Vflow=20 μ L/ho以下是发明人给出的具体实施例。通过数值仿真和实验结果，设计并加工了微尺度颗粒特异性连续分离的介电电泳微流控芯片，具体结构按照图10的制备工艺制成(如图13所示)，主要包括缓冲液进口 I、颗粒进口 2、3μπι颗粒出口 3、10 μ m颗粒出口 4、电极5、5 μ m颗粒出口 6、微通道7、PDMS(8)。使用时，电极5与外加的交变信号相连接，通过缓冲液进口 I将颗粒导至通道一侧，在脉冲电场和流场的共同作用下，由于三种粒径颗粒受到的DEP力和Stokes力不同，会运动到通道的不同展向位置，5 μ m颗粒会在流道上游始终沿着电极5倾斜方向运动，3 μ m颗粒由于粒径较小基本随着主流向前运动，而10 μ m颗粒受到电场和流场扰动比较大，会运动到管道的另一侧，从而使得三种颗粒从不同的出口流出。其中，电极5倾斜角度为60度，且微通 道7高度为30 μ m。微通道7上表面为PDMS (8)，由于PDMS的厚度太薄会影响微通道内的电场分布及颗粒的引入，通过数值计算得到其最小厚度必须大于20 μ m。
权利要求
1.一种微尺度颗粒特异性分离方法，其特征在于，该方法采用微尺度颗粒特异性连续分离的介电电泳微流控芯片，在连续进样条件下，通过整流体流速、电场强度与脉冲频率，对三种不同尺寸聚苯乙烯微球混合物进行连续可调多路分离，由于三种粒径颗粒受到的DEP力和Stokes力不同，会运动到通道的不同展向位置；所提取的颗粒类型可通过控制参数的调整任意改变，在电场、流场参数匹配时，中等的5 y m颗粒会在流道上游始终沿着电极倾斜方向运动，3 ii m颗粒由于粒径较小基本随着主流向前运动,而10 ii m颗粒受到电场和流场扰动比较大，会运动到管道的另一侧，从而使得三种颗粒从不同的出口流出，分别得到3 u m、5 u m和10 y m聚苯乙烯颗粒。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的微尺度颗粒特异性连续分离的介电电泳微流控芯片包括缓冲液进口(I)和颗粒进口(2)，倾斜角度介于45度到60度之间的电极(5)，311111颗粒出口(3)、1011111颗粒出口(4)、511111颗粒出口(6)和微通道(7)，其中，微通道(7)上表面有PDMS (8)，电极(5)与外加的交变信号相连接。
全文摘要
本发明公开了一种微尺度颗粒特异性分离方法，该方法采用微尺度颗粒特异性连续分离的介电电泳微流控芯片，在连续进样条件下，通过整流体流速、电场强度与脉冲频率，对三种不同尺寸聚苯乙烯微球混合物进行连续可调多路分离，由于三种粒径颗粒受到的DEP力和Stokes力不同，会运动到通道的不同展向位置；所提取的颗粒类型可通过控制参数的调整任意改变，在电场、流场参数匹配时，中等的5μm颗粒会在流道上游始终沿着电极倾斜方向运动，3μm颗粒由于粒径较小基本随着主流向前运动，而10μm颗粒受到电场和流场扰动比较大，会运动到管道的另一侧，从而使得三种颗粒从不同的出口流出，分别得到3μm、5μm和10μm聚苯乙烯颗粒。
文档编号B01D57/02GK102961966SQ20121050587
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月29日 优先权日2012年11月29日
发明者刘顺东, 崔海航, 张鸿雁 申请人:西安建筑科技大学