一种糖甲基化用氢氧化钠涂覆毛细管空心微反应器的制备与应用的制作方法
【专利摘要】蛋白质的糖基化修饰是细胞中最重要、最常见和最复杂的蛋白质翻译后修饰之一，而甲基化是糖类研究最常用的衍生化分析手段。本发明设计和制作了一种糖甲基化用毛细管空心微反应器。将氢氧化钠饱和溶液与甲醇按一定比例混合，注入到毛细管中，真空干燥后使毛细管内壁形成一层多孔的氢氧化钠固体层，制得氢氧化钠涂覆毛细管空心微反应器。当含有糖类物质的反应液流过反应器时，在氢氧化钠的催化作用下完成反应。本发明通过反应器内壁的多孔氢氧化钠结构提供大接触面积的碱性环境，而空心柱的整体结构保证了反应器的高通透性和稳定性，适用于糖类样品的甲基化反应处理。反应器制备简单，可重复使用，且便于批量操作，且拥有在线应用的潜力。
【专利说明】一种糖甲基化用氢氧化钠涂覆毛细管空心微反应器的制备与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于糖类甲基化的毛细管空心微反应器及其制备方法。通过将氢氧化钠晶体附着于毛细管内壁，形成表面多孔结构，制备得一种高比表面积、高通透性的固相糖甲基化微反应器。
【背景技术】
[0002]蛋白质的糖基化修饰是细胞中最重要、最常见和最复杂的蛋白质翻译后修饰之一。糖基化对于蛋白质的折叠、运输、定位起着重要作用[文献1.Helenius A et al.Science, 2001, 291(5512): 2364-2369]，并参与受体激活、信号转导等诸多重要的生物进程[文献 2.0htsubo K et al.Cell.2006, 126(5): 855-867]，因此对蛋白质糖基化的研究具有重要意义。甲基化是糖类研究中所采用的常用衍生化分析手段。目前普遍采用的甲基化方法是将氢氧化钠粉末悬浮于DMSO溶液中，固相催化完成反应[文献3.Ciucanu
I,Kerek F.Carbohydr.Res.1984; 131: 209]。该方法在反应结束后需要除去氢氧化钠粉末、以SPE柱除盐等操作，增大了样品的损失，并不适用于对微量糖链样品的甲基化处理。
[0003]最近，多种新型固相甲基化方法被发展。固相甲基化方法将氢氧化钠固体固定于反应器中，避免了反应后除氢氧化钠的操作，极大地提升了甲基化分析方法对微量糖链样品的适用性。Kang等[文献4.Pilsoo Kang, Yehia Mechref et al.Rapid Commun.MassSpectrom.2008; 22: 721 - 734]设计了一种离心柱式固相甲基化反应器,该反应器制备简单，可重复使用，且便于批量操作，已被广泛使用。他们[文献5.Pilsoo Kang, YehiaMechref et al.Rapid Commun.Mass Spectrom.2005; 19: 3421 - 3428]也将氢氧化钠粉末填充到毛细管中制备成填充式毛细管固相甲基化微反应器，可获得更好的甲基化结果，且拥有在线应用的潜力。但氢氧化钠填充式毛细管反应器制备过程较为复杂，且其通透性较差，而所使用的溶剂DMSO具有较高的凝固点，在实际应用时，容易因为高压而造成溶剂凝结。这些缺陷极大地限制了其应用。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于制备高通透性、可在线应用的糖甲基化毛细管微反应器，通过在毛细管内壁涂覆氢氧化钠晶体层，为糖类物质的甲基化反应提供强碱性环境，满足微量至痕量糖类样品全甲基化衍生反应的需求。
[0005]为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案为:
将氢氧化钠饱和溶液与甲醇以一定比例混合后，注入到毛细管柱中。在高温下，溶剂迅速汽化，氢氧化钠晶体析出，附着于毛细管内壁表面，形成多孔的氢氧化钠固体涂层，得到具有多孔氢氧化钠固体涂层内壁的空心毛细管微反应器。在该反应器中多孔氢氧化钠涂层可提供较大的比表面积，有利于反应物与氢氧化钠表面充分接触，保证反应在强碱性环境下快速进行。空心柱的整体结构保证了反应器的高通透性，避免了因为高压所导致的DMSO凝结等不利于反应进行的问题出现。
[0006]该反应器的具体制备方法如下:
1)氧化钠饱和溶液与甲醇按比例混合，其比例范围为氢氧化钠饱和溶液:甲醇=1:3?2:1，具体比例根据毛细管的内径及长度进行调节，使涂敷过程中析出的氢氧化钠晶体能够充分均匀涂敷在毛细管内壁表面，且避免氢氧化钠晶体彻底堵死毛细管；
2)细管充满涂敷溶液后，置于真空干燥箱中，于18(T210°C下进行烘制，使溶剂完全汽化，干燥的氢氧化钠固体在毛细管内壁表面析出，形成多孔的涂层结构。重复上述操作3-6次，使毛细管内壁表面充分地附着一层厚度范围为5?50μπι的氢氧化钠固体涂层，涂层厚度可根据毛细管内径及长度进行调整，保证反应器具有良好的通透性。
[0007]氢氧化钠涂敷毛细管空心微反应器的保存方法为:以无水乙腈充满微反应器，两端用娃橡胶封口，存放于干燥器内。
[0008]本发明的优点在于:
氢氧化钠涂敷毛细管空心微反应器制作简便，通透性好，可重复使用。在本反应器中中进行的甲基化反应反应迅速，全甲基化率高。本反应器适用于对微量至痕量的糖样品进行全甲基化。
[0009]【专利附图】
【附图说明】
图1为氢氧化钠涂覆毛细管空心微反应器的扫描电镜图，图中I为氢氧化钠固体涂层，2为毛细管壁，3为毛细管外壁涂层；
图2为氢氧化钠涂覆毛细管空心微反应器的操作示意图，将反应物转移至微量进样器
(1)，通过聚四氟乙烯管(2)与氢氧化钠涂覆毛细管空心微反应器(3)相连。以微流注射泵
(4)将样品通过反应器进行反应，流出液以离心管(5)收集；
图3为本发明实施例中氢氧化钠涂覆毛细管空心微反应器对β-环糊精甲基化产物的MALD1-T0F 质谱图。
[0010]【具体实施方式】 实施例
氢氧化钠毛细管空心微反应器的制备:配置氢氧化钠饱和溶液与甲醇的1:1混合溶液，将其通入内径为500 μ m,长度为25cm的毛细管中，使混合溶液充满整个毛细管。将该毛细管在真空干燥箱中于180°C烘制30分钟，使其中溶剂彻底挥发，令氢氧化钠结晶于毛细管内壁。重复通入混合溶液并烘干的操作3次，使氢氧化钠固体涂层充分均匀地涂敷在毛细管内壁表面。以无水乙腈充满氢氧化钠涂敷毛细管空心微反应器，两端用硅橡胶封口，存放于干燥器内。
[0011]β-环糊精的全甲基化:以微流注射泵将400yL DMSO通入氢氧化钠涂敷毛细管空心微反应器，流速为15 μ L/min，置换出反应器内的乙腈。将50 μ L 5mg/mL β-环糊精的DMSO溶液与25 μ L碘甲烷混合，以微流注射泵将该混合溶液以I μ L/min的流速通过反应器，在反应器的另一端接取流出液。反应完毕后，以400 μ L DMSO分两次冲洗反应器，流速为15 μ L/min。将接收液混合。以500 μ L氯仿萃取接收液，并以1.5mL水洗3次。将有机相冻干后保存。
[0012]甲基化产物的质谱检测:反应后的样品经MALD1-T0F分析后所得质谱结果如图3 所示。全甲基化率为72.99%。
【权利要求】
1.一种糖甲基化用氢氧化钠涂覆毛细管空心微反应器的制备与应用，其特征在于:将氢氧化钠涂覆于毛细管内壁，形成具有多孔结构涂层的毛细管空心微反应器，可以为糖甲基化反应提供大接触面积的碱性环境，实现糖类物质的快速、全部甲基化衍生。
2.根据权利要求书I所述的一种糖甲基化用氢氧化钠涂覆毛细管空心微反应器的制备与应用，其特征在于:具体制备方法为: (1)涂敷溶液的制备:将氢氧化钠饱和溶液与甲醇混合，其比例范围为氢氧化钠饱和溶液:甲醇=1:3?2:1 ； (2)微反应器的制备:将毛细管充满涂敷溶液后，置于真空干燥箱中，于18(T210°C烘至彻底干燥，复该步骤3-6次，制得氢氧化钠毛细管空心微反应器。
3.根据权利要求书2所述的一种糖甲基化用氢氧化钠涂覆毛细管空心微反应器，其特征在于:毛细管内径为100?530 μ m,反应器长度为15?150cm,氢氧化钠层厚度为5?50 μ m0
4.根据权利要求书I所述的一种糖甲基化用氢氧化钠涂覆毛细管空心微反应器的制备与应用，其特征在于:在压力驱动下，使糖甲基化反应溶液从反应器一端流入，另一端流出，流体速度为0.5?30yL/min，室温下操作。
5.据权利要求书I所述的一种糖甲基化用氢氧化钠涂覆毛细管空心微反应器的制备与应用，其特征在于:反应器适用于微量至痕量样品的糖甲基化反应。
【文档编号】B01J19/00GK103623752SQ201310598452
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年11月25日 优先权日:2013年11月25日
【发明者】张维冰, 高小迪, 李伟华, 高方圆, 张凌怡, 钱俊红 申请人:华东理工大学