用于基于控制介质流动的三维组织测量的装置和方法

用于基于控制介质流动的三维组织测量的装置和方法
【专利摘要】本申请公开了一种包括多个井的、用于进行三维细胞试样(例如组织试样)分析的装置以及用于通过三维试样来进行实验的方法。与该装置一起使用的可拆卸插入件使得能够进行由柱塞驱动的、三维试样的灌注。
【专利说明】用于基于控制介质流动的三维组织测量的装置和方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 根据35U.S. C § 119(e)，本申请要求美国临时专利申请No. 61/725781的优先权， 该美国临时专利申请No. 61/725781的申请日为2012年11月13日，该文献的全部内容结 合到本申请中，作为参考。

【技术领域】
[0003] 本发明通常涉及用于进行三维细胞试样（即组织试样）的分析的装置和方法。

【背景技术】
[0004] 长期以来认为，癌细胞的新陈代谢表现型的明显不同与基础机理相关联，该基础 机理提供了用于存活和增殖的选择优点。不过，激发肿瘤发生的精确机理并不很好理解。 已经假定糖酵解适应是允许肿瘤在特征为低PH和氧张力的微观环境中增殖的存活机理。 "Warburg转换"的这些适应通过增加葡萄糖摄取和ATP合成以便满足用于生物合成、能量 和减少等效物的要求、而对于肿瘤提供了选择优点。
[0005] 在测量关键分析物（该关键分析物指示在微环境中的有氧代谢（O2)、糖酵解（H +) 和中间代谢（CO2))流量的仪器发展的最近进步可以提供对恶性转变的基础原理的理解。不 过，这些系统设计和优化成用于基于细胞的化验，可能缺少环境控制，并通常并不方便测量 多细胞组织试样（由于腔室尺寸限制、试样的稳定和灌注困难）。
[0006] Seahorse Bioscience，Billerica，Mass.在 2007 年发布了 XF96"Extracellular Flux Analyzer"。从那时起，已经采用该产品作为用于定量测量线粒体功能和细胞生物能 的技术平台。XF测量在完全集成的仪器中进行，该仪器测量在基于细胞的化验的细胞外介 质中的多种分析物（0 2、H+、CO2)的浓度。分析物浓度在细胞周围的较小容积内非侵入地测 量，从而提供了作为时间（从该时间起能够确定生物能流量（例如：d0 2/dt =氧消耗速率； dpH/dt=细胞外酸化速率）函数的分析物浓度变化的定量测量。XF测量基于这样的方法， 其中，在细胞周围产生很小的暂时测量容积，或者传感器布置成紧邻细胞。在这种情况下的 测量放大了浓度的变化，从而能够从一组光学传感器中收集高度灵敏的且时间分辨的测量 值。一旦进行测量，柱塞（探针）升高，细胞周围的介质恢复至它的初始状态。这种非破坏 性方法能够在多种刺激条件下（基本的环境变化、化合物刺激物）对于生物试样连续地收 集多个测量值。
[0007] 通过测量关键的代谢参数例如氧消耗速率（OCR)和细胞外酸化速率（ECAR)，可以 根据用于产生能量和生物合成的基质和通路（糖酵解或氧化磷酸化）来发展生物能表现型 的轮廓。产品能够定量测量线粒体功能和细胞的细胞生物能。
[0008] 还需要一种系统，它能够测量在多细胞组织中的、例如有氧代谢、糖酵解和中间代 谢的关键分析物的测量值。


【发明内容】

[0009] 这里介绍的仪器和方法能够测量组织试样或细胞群体（例如肿瘤组织试样）的生 物能参数，以便产生它的代谢轮廓，从而能够例如更好地理解恶性发展的机理。因此，本发 明的实施例能够测试生理上相关的假设，该假设直到现在都不能通过其它方法来测试，例 如能够测量和定量肿瘤中的表现型转换。
[0010] 本发明的实施例包括用于进行三维细胞试样分析的装置。该装置可以包括井板， 这些井装载组织试样，该组织试样通过将板布置在如这里所述专门用于在板的井中的化验 的机器中而进行测试。板通常确定多个井，该井用于保持各试样和试样介质，其中，至少一 个井（通常整组井）包括布置于其中的试样嵌套部位。孔布置在试样嵌套部位上面，该孔 的尺寸设置成与柱塞相互配合，该柱塞在孔内和在布置于所述井中的试样介质内竖直向下 运动。实际上，优选是使得井或井板在台架或平台上保持就位，并自动化地运动柱塞，但是 也可以（但并不优选）使得柱塞保持静止和使得板运动。结构还确定了介质槽道，该介质 槽道与所述试样嵌套部位流体连通。该介质槽道允许介质由柱塞移动而流过，并允许试样 在柱塞运动时暴露于新鲜介质。
[0011] 可以包括一个或多个以下特征。柱塞优选是相对于嵌套部位运动，以便引起在试 样周围的介质灌注，优选是在向下和向上冲程中。也可选择，柱塞和试样嵌套部位可以一起 运动，以便使得试样暴露于介质的不同区域。介质槽道可以包括流体通路，该流体通路使得 在试样周围灌注的介质返回至布置于井中的介质。孔、试样嵌套部位和/或介质槽道可以 由可拆卸的井插入件来确定。
[0012] 试样嵌套部位可以包括由可拆卸的井插入件的一部分确定或者作为该插入件一 部分的、介质可透过的平台。井可以包括与介质槽道流体连通的贮槽。试样嵌套部位可以 布置在贮槽中，介质收集在该贮槽中，并流过介质槽道。
[0013] 介质槽道可以包括流体通路，该流体通路确定在井中的介质表面下面的闭合环 路，以便当柱塞在所述孔内向上和向下运动时都允许介质在所述试样周围灌注流动。止回 阀可以包含在介质槽道中，以便防止耗尽的介质在柱塞的向上运动过程中从槽道回流至试 样。
[0014] 装置可以包括传感器，用于检测布置在试样周围的介质中的、由试样分泌或吸收 的溶质的浓度。传感器可以设置在至少一个井的底部。传感器可以包括对于在介质中的 一种或多种溶质的浓度敏感的荧光团，该荧光团安装在柱塞上，以便测量在组织试样附近 的区域中的、例如氧、〇) 2或H+的浓度。传感器可以包括小珠，该小珠涂覆有特定细胞活素、 趋化素、激素或由组织吸收或分泌的其它生物分子（它们将固定在小珠上）的特殊胶合剂。 小珠可以就地在井中的贮槽内用探针探测，以便能够检测由组织分泌或吸收（take up)的 感兴趣分子的浓度。也可选择，小珠可以与介质分离并进行分析。在一些实施例中，标出的 (spotted)抗体可以代替小珠布置在井的底部部分中，并与灌注通过井的介质流体连通。标 出的抗体可以用于检测其它感兴趣的分子。
[0015] 装置可以包括柱塞，该柱塞用于在各井的孔内往复运动。在优选实施例中，荧光团 传感器可以布置在柱塞上，用于检测布置在试样周围的介质中的溶质浓度。传感器可以测 量溶解在试样周围的介质中的氧、二氧化碳和/或氢离子的浓度。
[0016] 多个井可以确定多井板，例如包括24或96个井。
[0017] 氧、二氧化碳和/或生物惰性气体的源可以与井中的介质或在井中的介质表面上 面的顶部空间流体连通，用于控制在该顶部空间中或介质中的气体的组成。生物活性物质 的溶液源与井中的介质流体连通，用于使得试样暴露于所述物质。
[0018] 三维细胞生长支架（scaffold)可以布置在所述试样嵌套部位上。
[0019] 在另一方面，本发明的实施例可以包括一种用于进行三维细胞试样的分析的装 置。该装置可以包括井，用于保持试样和试样介质，该井包括试样嵌套部位。孔可以布置在 所述嵌套部位上面，该孔的尺寸设置成与柱塞相互配合，该柱塞在孔内和在布置于所述井 中的介质内竖直向下运动。装置还可以包括：介质槽道，该介质槽道与所述试样嵌套部位流 体连通，该介质槽道允许介质灌注至所述试样周围；以及柱塞，用于在所述孔中往复运动， 以便推动介质灌注至所述试样周围。
[0020] 装置可以选择地包括传感器，用于检测在试样嵌套部位周围的介质中的溶解介质 组分的浓度。
[0021] 在还一方面，本发明实施例的特征在于一种用于培养板的井的插入件，用于使得 井适合实施布置于其中的三维细胞培养试样的灌注。该插入件包括这样的结构，该结构确 定了 ：（i)试样嵌套部位，该试样嵌套部位包括介质可透过的平台；和（ii)布置在其上面的 孔，该孔的尺寸设置成与柱塞相互配合，该柱塞在孔内和在布置于井中的介质内竖直向下 运动。插入件还可以确定介质槽道，该介质槽道与所述试样嵌套部位流体连通，该介质槽道 允许介质由柱塞推动灌注至所述试样周围。
[0022] 在另一方面，本发明实施例的特征在于一种对于三维细胞培养试样例如组织试 样、活检试样或保持细胞的细胞支架进行试验的方法，以便保持试样的生存力和对它的微 环境进行控制。该方法包括提供一种结构，该结构限定井，该井包括：试样嵌套部位；孔，该 孔的尺寸设置成与布置在试样嵌套部位上面的柱塞相互配合；介质槽道，该介质槽道与所 述试样嵌套部位流体连通；以及柱塞，该柱塞用于在孔中往复运动。将试样布置在井内的介 质中的试样嵌套部位上。使得柱塞在孔内运动，以便推动介质在试样周围流动和流过所述 槽道，从而以介质灌注试样。
[0023] 可以包括一个或多个以下特征。气体可以添加给介质或在井中在介质上面的顶部 空间，以便通过改变溶解气体组分来改变试样周围的微环境。生物活性物质（例如药物、候 选药物或毒素）的溶液可以添加给介质，以便通过使得试样暴露于生物活性物质而改变试 样周围的微环境。
[0024] 还可以测量在所述试样周围的介质中的一种或多种溶质的浓度。还可以进行在所 述试样周围的介质中的一种或多种溶质的浓度的多次测量，这些测量在时间上分开。
[0025] 可以将计量量的一种或多种气体和/或一种或多种溶质添加给所述井中的介质， 从而将所述试样周围的介质中的微环境设置成预定点。微环境可以设置成缺氧条件。氧清 除剂可以添加给介质。
[0026] 可以将人体活检组织试样布置在所述嵌套部位上，可以将可能的治疗药物添加给 介质，以及可以估计药物对试样的效果。
[0027] 试样可以是肿瘤试样，还可以将计量量的一种或多种气体和/或一种或多种溶质 添加给所述井中的介质，从而将所述试样周围的介质中的微环境设置成预定点，从而模拟 肿瘤试样在活体内的微环境。
[0028] 该方法还可以通过提供多个井来进行多路复用，该井包括：试样嵌套部位；孔，该 孔的尺寸设置成与布置在相应试样嵌套部位上面的柱塞相互配合；介质槽道，该介质槽道 与各试样嵌套部位流体连通；以及柱塞，该柱塞用于在所述孔中往复运动。可以将试样布置 在多个井中的每一个内的介质中的试样嵌套部位上。可以使得多个柱塞在孔内运动，以便 推动介质在试样周围流动和流过所述槽道，从而以介质灌注试样。在多个所述井中在所述 试样周围的介质中的一种或多种溶质的浓度可以进行一次或多次测量。

【专利附图】

【附图说明】
[0029] 图Ia和Ib是根据本发明实施例的多井板的单个井的示意剖视图，其中柱塞处于 向下位置（Ia)和向上位置（Ib)，且插入件布置于其中。图Ic以剖视图表示了插入件的底 部。
[0030] 图Id是根据本发明实施例的插入件和插入件的底部部分的示意剖视图，表示了 某些当前优选的尺寸。
[0031] 图Ie和If是多井板的单个井的下部部分的两个实施例的示意剖视图，且插入件 布置于其中，表示了在井的底部的贮槽中的试样嵌套部位（Ie)和布置在插入件底部的筛 网上的试样嵌套部位（和嵌套支架）（If)。
[0032] 图Ig是本发明的井的可选实施例的结构的示意剖视图，表示了用作止回阀的环， 以便阻止消耗的介质在柱塞的向上运动过程中从介质槽道回流至试样部位。
[0033] 图2是多井板的单个井的下部部分的示意剖视图，且插入件布置于其中，试样嵌 套在插入件上，表示了用于检测存在于介质中的生物分子的小珠（bead)，该介质从布置于 贮槽中的组织试样灌注。
[0034] 图3是多井板的单个井的下部部分的示意剖视图，且插入件布置于其中，试样嵌 套在插入件上（"3D支架"），传感器在贮槽中布置在井的底部。
[0035] 图4a和4b分别是多井板和覆盖盒的竖立和颠倒分解透视图，该覆盖盒用于与板 匹配，表示了根据本发明的板的多个特征。
[0036] 图5是井板的井的示意剖视图，该井板包括布置在其上的口，用于控制井中的气 体含量，并将外来物质气动控制添加至溶液中。
[0037] 图6是根据本发明实施例的测量系统和装置的示意图。
[0038] 图7包括表示比较HCT116细胞的2D和3D培养的线粒体应力测试结果的曲线图 和显微照片。
[0039] 图8包括表示在根据本发明实施例的原型灌注板中测量的、对于单胰岛的葡萄糖 响应的曲线图。
[0040] 图9包括根据本发明实施例的井的示意剖视图和俯视图，细胞能够在该井中聚 结。
[0041] 图10包括表示支架盘的产生的曲线图和显微照片。
[0042] 图11是表示肝脏微组织的测量呼吸能力的曲线图，作为羰氰三氟甲氧苯腙 (FCCP)浓度的函数。

【具体实施方式】
[0043] 本发明的实施例能够测量一个或多个三维细胞试样（例如组织试样、活检试样或 者保持细胞的细胞支架）的一个或多个特性，该三维细胞试样布置在例如多井板的一个或 多个井中。实施本发明的多种特殊形状的板以及使得更普通的板适用于实施本发明的结构 的井插入件可以由本领域技术人员根据本说明书来设计，并可以使用普通的模制技术由聚 合物材料来制造，例如由聚对苯二甲酸乙二醇酯或聚苯乙烯制造。
[0044] 图Ia-Ig表示了单独（图Id)或布置在井110(例如多井板的单个井）中的可拆卸 插入件100。插入件可以确定介质灌注槽道120,以方便介质灌注130至三维细胞试样上， 例如沉积在井中的组织140上。槽道可以包括形成于插入件自身的本体中的多个通道，或 者更优选是，包括确定于井的内表面和插入件的外表面之间的通道。灌注槽道可以包括止 回阀，该止回阀用于在柱塞的向上冲程中限制介质从槽道回流至试样。插入件还可以包括 试样嵌套部位150,以便在插入件插入井中之前接收试样。在一些实施例中，试样嵌套部位 布置在井自身中，例如在独立于插入件的凹入部分或贮槽中。插入件或者井本体自身确定 了孔150,该孔150与柱塞160相互配合。柱塞160、井110和孔150优选是设置成或尺寸 设置成装配在一起，以使得柱塞插入井中和往复运动能够搅拌和混合介质。柱塞和孔装配 在一起，以便当柱塞向下或向上运动时引起灌注，且介质灌注试样和经过灌注槽道。在一些 实施例中，柱塞还可以设置成引入一个或多个传感器180,用于监测在布置于井中的介质中 的一个或多个分析物的存在或浓度。来自传感器180的信息可以通过布置在柱塞170中的 光纤探针182来传送。在一些实施例中，复合传送结构185可以布置在井上面，从而能够通 过例如传送口引入生物活性物质或者气体的井中至三维试样周围的介质中。
[0045] 下面更详细地介绍本发明的实施例的这些元件。井110的底表面可以确定凹入部 分，该凹入部分在使用过程中用作贮槽。凹入部分可以用于定向和控制试样在井中的位置， 且它的底表面用作试样嵌套部位150。井可以是多井板的多个井中的一个，它可以设计成 标准"生物筛协会" SBS基底面（footprint)，具有6mm的井直径，且在井底部处的凹入部分 具有例如0. 5_的深度和例如3_的直径。凹入部分的尺寸可以根据要在井中进行的分析 来选择。例如，容积应当足以保持试样。上面所述的示例尺寸适合保持大约300 μ m厚的试 样。根据分析要求，也可以提供其它尺寸。
[0046] 可拆卸插入件100可以为大致圆柱形，且尺寸和结构设置成滑动到井中，且与井 内壁稍微过盈配合。见图Id。例如，插入件可以有大约0.2英寸的高度hi和大约0.247英 寸的外径0D。插入件的高度可以选择为使得由孔（柱塞在该孔中产生流体静压力）的长度 确定的冲程距离（即灌注冲程190)可以增加或减小，以便控制灌注容积。插入件的外径可 以选择成使得插入件紧贴地装配至井中。例如，凸起195可以布置在插入件的外侧壁上，以 便帮助将插入件固定和定心在井中，从而使得在一些点处的外径0D'为0. 251英寸。插入 件的顶边缘可以较薄，例如有0. 002英寸的厚度tl，以便帮助将柱塞引导至插入件中。插 入件的内表面可以有上部的锥形部分和下部的竖直部分，该竖直部分确定了具有例如0. 15 英寸直径dl的孔。上部锥形部分可以确定具有例如0. 1英寸直径d2的开口。插入件的孔 的底部可以确定例如〇. 080英寸直径d3的开口。该开口可以包括介质可透过的平台，例如 筛网，该平台的尺寸和位置设置成支承支架，该支架保持三维细胞培养物或组织试样。插入 件确定了多个灌注槽道120,该灌注槽道120开始于插入件的底部，并沿插入件的外径壁向 上延伸，以便形成槽道，从而在柱塞的向下冲程过程中，通过具有直径d3的开口泵送的流 体能够排出，以便产生横过试样的灌注。各灌注槽道可以有例如〇. 004英寸的高度h2。
[0047] 一组当前优选的尺寸将确定在3mm孔内的3mm的柱塞冲程，因此泵的排出体积 (稍微超过20mm 3或20 μ 1)是槽道容积的近似4倍。因此，如当前所考虑，柱塞和插入件的 尺寸设置成使得柱塞在插入孔中时使得至少20 μ 1的介质运动。在孔和柱塞之间的间隙越 小，泵的效率越好，因此，合理的范围是最小间隙0. 001英寸和最大0. 01英寸。在一些实施 例中也考虑更大间隙，以便允许新鲜介质在活塞的向上冲程中在该活塞周围向下流动，特 别是在包括止回阀功能的实施例中，如后面所述。
[0048] 参考图le，插入件100紧贴装配至井110中使得插入件能够牢固保持就位，且在使 用中可以使得试样140固定和定向在试样嵌套部位150中，该试样嵌套部位150布置在由 交接面（该交接面由在井底部的凹入部分和插入件的底部部分产生）形成的小的微腔室或 贮槽中。如图所示，贮槽与灌注槽道120流体连通，即与介质槽道流体连通，灌注流130通 过该灌注槽道120进行。在一些实施例（未示出）中，介质槽道可以导向用于收集耗尽的 介质的排放部。因此，在一些实施例中，介质可以通过介质槽道而运动至废物部位，而不是 返回至井中。
[0049] 如后面更详细所述（包括参考图If)，在其它实施例中，试样嵌套部位150布置在 插入件100自身上。例如，插入件可以包括在孔160的底部处的筛网190,具有细胞的组织 试样或支架200可以布置在该筛网上。在其它实施例（未示出）中，试样嵌套部位可以布 置在柱塞上，例如刚性悬挂在它的底表面上，从而试样嵌套部位与柱塞一起运动，以便使得 试样暴露于介质的不同区域。因此，可能但并不优选的结构包括将试样嵌套部位悬挂在柱 塞上。
[0050] 可以由插入件确定的介质槽道允许通过柱塞而移动的介质离开试样附近，例如通 过沿周边壁向上流过由插入件的外表面和井的内侧壁确定的环带。在一些实施例（未示 出）中，介质槽道可以从插入件的底部部分延伸至插入件的较高部分。参考图1C，在示例实 施例中，介质槽道可以包括确定于插入件100的底部部分中的多个（例如四个）灌注槽道 120。灌注槽道可以是确定于插入件的底表面上的凹坑。也可选择，灌注槽道可以是确定于 插入件的底部部分中的圆柱形开口。各介质槽道可以确定流动通路，该流动通路使得灌注 在试样周围的介质返回至布置于井中的介质，或者也可选择，至废物储存器。介质槽道与试 样嵌套部位流体连通，从而允许介质流过该试样嵌套部位。介质流由柱塞170推动，从而在 柱塞运动时允许试样暴露于新鲜介质。
[0051] 参考图If，插入件可以包括试样嵌套部位150。例如，插入件可以包括介质可透过 的平台，例如筛网190,该平台跨过在插入件的底表面中的开口。筛网可以由任意数目的材 料来制造，例如聚合物如聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET)或聚苯乙烯、纤维素、纸张等，并通 过超声波焊接、热融、粘接剂粘接或机械夹住而附接。在某些实施例中，试样粘附在嵌套部 位可以通过使用附接促进剂或组织粘接剂来加强，例如MatriGelTM或Cell-TakTM。在可选 实施例中，如上所述，试样嵌套部位可以在井底部处的凹入部分内。
[0052] 各介质槽道可以包括流动通路，该流动通路确定了在井中的介质表面下面的闭 环，从而当柱塞在孔内向上和向下运动时允许介质在试样周围灌注流动。
[0053] 插入件可以通过注射模制来制造。表面润湿性可以通过自身已知的处理来增加， 例如执行插入件的等离子体预处理，以便通过产生更亲水性的表面来消除气泡在灌注槽道 中的夹带。
[0054] 优选是，孔布置在嵌套部位的上面，引导柱塞竖直向下进入插入件中至布置于井 中的试样介质内，并产生液体静压力和介质在试样周围的运动。因此，柱塞可以用于在布 置于井中的孔（例如由插入件确定的孔）内往复运动。图Ia表示了伸入孔160内的柱塞 170,其紧邻试样，而图Ib表示了稍微退回的柱塞170。当柱塞沿确定灌注冲程190的距离 上下运动时，通过液体静压力而迫使一定体积的介质横过组织或支架，并沿在插入件和井 的内表面之间的周边壁向上（或向下）。
[0055] 图Ig表示了一种形式的止回阀210,该止回阀210用于在柱塞的向上冲程中防止 介质从灌注槽道回流至试样。可选的止回阀210采取自由浮动的环形环的形式，该环形环 包括例如弹性体聚合物，它套装在培养介质本体内的槽道的环形开口上。在向下冲程中，来 自槽道的液体静压力使得环移动，并允许耗尽的介质向上和径向向内流动，以便往回混合 至井中的介质体积中。在向上的柱塞冲程中，吸力将环保持成与槽道的开口基本密封接合， 从而防止介质从槽道回流。因此，介质通过在柱塞和孔之间的环形间隙空间而环绕柱塞向 下吸入。其它的止回阀结构也可考虑，且当容许一些介质回流时，止回阀功能也可以省略。 用于防止回流的止回阀的还一可选方式是省却耗尽介质的重新循环，并将灌注槽道设计成 用于单向排出至井板（未示出）本体中的储存器中。
[0056] 在一些实施例中，试样嵌套部位可以包括附接在插入件上或贮槽底部的支架200。 支架是三维多孔固体，例如胶原薄膜，它模拟在活体中的组织薄壁组织和它周围的结构。 这样的支架在市场上可获得，并可以由凝胶或纤维/多孔介质来制造，例如Alvetex? Scaffold或3D BioTek支架材料。Alvetex? Scaffold是高孔隙度的交联聚苯乙烯支架， 它的截面为200 μπι厚薄膜。形成的材料为惰性，且不会在正常使用过程中退化。它已经用 于适合多种普通细胞培养塑料物品的规格。Alvetex? Scaffold提供了合适的3D结构， 在该3D结构中，细胞能够在合适的小环境中增殖、移动、区分和起作用。细胞保持与相邻细 胞紧密地相互作用的3D形状和形式。
[0057] 参考图2,在可选实施例中，包括对于感兴趣的生物分子的特殊胶合剂的小珠 220 可以布置在井110中并在试样下面或附近，作为用于帮助试样分析的装置。特别是，支架 200或组织可以固定在插入件上，以使得介质能够通过和环绕它灌注。在该结构中，介质例 如包含关键营养、信号分子、药物等。小珠例如可由Luminex?获得，其包含附接分子， 可以布置在井的底部，从而多种信号分子可以被捕获，并随后被检测或定量。人们可以利用 与试样紧密接触的贮槽和小体积介质，以便有效放大信号分子的浓度和将它们捕获在小珠 上。小珠优选是留在井的底部，因为它们捕获在支架和环绕周边的小槽道之间。在化验结 束时，插入件或一组插入件可以除去，且小珠能够使用已知技术来阅读，例如在流动血细胞 计数器中分析。
[0058] 除了上述可选的小珠之外，装置优选是还包括传感器180,例如布置在柱塞上，用 于检测在布置于试样周围的介质中的溶质浓度。传感器可以测量在试样周围的介质中溶解 的氧、二氧化碳、氢离子的浓度。随时间间隔开的测量值能够评估试样在它的微环境的各种 条件下的健康或代谢效率。
[0059] 参考图3,传感器180可以布置在井或贮槽的底部，以便检测溶质在介质中的浓 度。例如，人们可以将O^pH传感器布置在插入件100的底部和井110的底部之间的空 间中。具有传感器的板在市场上可获得，但缺陷是人们必须使得细胞在传感器上生长。具 有可水溶的传感器的工具包（该工具包将置于介质中）也可获得，但是也有缺点。这里所 述实施例能够使得微井板设有在底部的传感器和在它上面的插入件，从而使得微井板在标 准板阅读器中阅读，例如BioTek Synergy线的板阅读器。这些类型的传感器结构可以用于 支架或在隔膜上生长的二维或三维培养物。
[0060] 根据要进行的分析和它的选择结构，多种类型的传感器可以用于该装置，包括氧 传感器（例如氧熄灭荧光传感器）、pH传感器（包括荧光传感器、ISFET和阻抗传感器）、 CO2传感器（包括连接重碳酸盐缓冲剂和铵染料的荧光传感器以及其它CO 2传感器）、多种 离子和小分子传感器、大分子传感器（包括表面等离子体共振传感器和利用Wood异常原理 的传感器）、声音传感器以及微波传感器。在某些实施例中，可以使用普通的板阅读器。
[0061] 优选的传感器是荧光团。很多荧光感测化合物和制剂在本领域中介绍，很多可由 市场获得，例如来自Molecular Probes Inc和Frontier Scientific Inc。当前优选的氧 传感器是信号与氧浓度成反比的荧光团，例如卟啉或若丹明化合物，稳定为颗粒或均匀分 布在氧可透过的聚合物中，例如硅酮橡胶。当前优选的化合物是卟啉。当前优选的pH传感 器是荧光指示器染料、荧光素（它的信号在染料质子化时减小，且它捕获在悬浮于载体聚 合物中的颗粒内，或者共价附接在亲水性聚合物上。有利的荧光CO 2指示器传感器通常基 于PH敏感换能器，其中荧光通过产生碳酸（由于二氧化碳与水反应）而间接调节。例如见 0. S. Wolfbeis，Anal. Chem. 2002, 74, 2663-2678。检测葡萄糖的荧光团也能够使用，例如基 于使用与葡萄糖复合的硼探针的无酶转换的荧光团，从而导致电荷传递，这调节探针的荧 光，或者使用酶葡萄糖换能器，它使得葡萄糖氧化酶与荧光氧传感器连接，具有葡萄糖粘接 和氧化，导致氧传感器的定量调节。在本发明实施例的范围内还使用对于生物分子敏感的 荧光团或其它类型传感器，例如乳酸、氨或尿素。乳酸传感器能够基于酶传感器结构，具有 与荧光氧传感器相连的乳酸氧化酶，且乳酸的粘接和氧化导致氧传感器的定量调节。氨或 铵离子传感器能够设置成将质子化PH指示器固定在憎水性和气体可透过的聚合物中，其 中荧光输出通过与瞬变氨反应而定量调节。尿素传感器能够基于酶传感器结构，具有与荧 光氨换能器相连的尿素酶，且通过尿素与氨的粘接和反应，从而导致氨传感器荧光的调节。 传感器的性质通常并不形成本发明实施例的方面。
[0062] 在使用中，插入件引导柱塞，以便通过在插入件中和/或在井底部处的凹入部分 中在组织试样上面的介质柱内产生液体静压力而提供灌注。当柱塞竖直地往复运动通过该 柱时，迫使介质横过和（有时）穿过组织流动，并通过环绕插入件周边的一系列槽道以及在 插入件的外表面和井的内壁之间向上离开腔室。通过使得柱塞向上和向下运动，介质横过 组织运动，从而补充营养物、提供氧和冲走废物。因此，在试样周围的微环境在测量过程之 间连续灌注。当柱塞运动至底部位置时（搁置在插入件上或恰好在插入件上面），它的运动 停止，产生较小的瞬时容积，并进行测量。灌注通过插入件的效率可以通过改变冲程高度、 速度以及在柱塞和插入件之间的间隙而提高。
[0063] 参考图4a和4b，图中表示了适用于接收上述插入件和实现本发明实施例的井板 结构。它包括井板400,该井板400确定了多个井110。井板可以与盒410和可拆卸盖420 组合。在所示实施例中，多井板400有24个井。在板中的井110的数目可以从1至几百而 变化。在一些实施例中，可以制造几乎任意尺寸的单个井，或者可以制造多个井，或者多个 井可以一维或二维布置而制造。在多个实施例中，人们可以利用与例如由生物分子筛网协 会的、用于微板的标准（"SBS-1基底面"和"SBS-4井位置"，提出的两个标准更新至2003 年5月20日）所述的微板的图形和尺寸相对应的、二维图形的井。板可以包括12、24、96、 384、1536或者任意其它数目的各个井。更大数目的井有工程难题，因为实现本发明实施例 需要的细小结构。盒410为大致平的元件，包括由例如模制塑料制造的框架430。平的表面 440确定了与在多井板400中确定的多个井110的多个相应开口相对应（即对齐）的多个 区域450。在所示实施例中，在各区域450中，平的元件确定了 ：第一、第二、第三和第四口 460,它们用作储存器，用于传送气体或试剂；以及中心孔470,用于柱塞170。各口用于根据 要求而保持和将测试流体释放至它下面的相应井110中。口 460的尺寸和位置设置成使得 多组的四个口可以定位在井110上面，气体或测试流体可以从四个口中的任意一个传送给 相应井110。在一些实施例中，在各区域中的口的数目可以小于4或大于4。口 460和柱塞 170可以相对于微板400顺应地安装，以便使它能够通过适应侧向运动而嵌套在微板内。微 板包括顺应区域的结构使得它的制造能够有较松的公差，并使得盒能够用于稍微不同尺寸 的微板。顺应性例如能够通过使用弹性体聚合物来形成平的元件440、以便允许在框架430 以及各区域中的柱塞和口之间相对运动而实现。
[0064] 各口 460可以有圆柱形、圆锥形或立方体形状，在顶部穿过平的元件430开口，在 底部除了小孔之外关闭，即毛细孔，通常定心在底表面中。毛细孔用于例如通过表面张力而 将测试流体保持在口中，而没有外部力，例如正压差力、负压差力或可能的离心力。各口可 以由气体、测试化合物不可透过的聚合物材料来制造，或者由任意其它固体材料来制造。当 设置成用于多井微板400时，由各口容纳的液体体积可以在从500 μ 1至（只有）2 μ 1的范 围内，尽管在该范围外的体积也可考虑。
[0065] 参考图4b，在盒110的各区域中，可浸入柱塞170(即传感器套筒或屏障）布置在 口之间并与一个或多个口 460相连，用于布置在相应井110中。柱塞170可以有布置在其 下表面上的一个或多个传感器180,用于插入在井110中的介质内。传感器能够用于检测在 试样嵌套部位周围的介质中的溶解介质组分的浓度。用于该目的的传感器的一个示例是荧 光指示器，例如氧熄灭荧光团，嵌入氧可透过的物质中，例如硅橡胶。荧光团根据在井110 中的成分存在和/或浓度而有荧光特性。也可以使用其它类型的已知传感器，如上所述，例 如电化学传感器、Clark电极等。柱塞170可以限定用于接收传感器的孔和内部容积。
[0066] 盒410可以附接在柱塞上，或者可以布置在柱塞附近而并不附接，以便允许独立 运动。盒410可以包括一组化合物储存和传送口，这些化合物储存和传送口装配成单个单 元，并与类似组的柱塞相连。
[0067] 装置还可以具有的特征为有用于盒110或用于多井板400的可拆卸盖420。作为 用于多井板400的盖的盒110的结构可以帮助防止布置在井110中的试样或介质蒸发或被 污染。盖420也可以设置成套装在盒110上，从而减少可能的污染，并保持井中的气体含量， 或者减少布置在盒410的口 460中的流体的蒸发。
[0068] 图5表示了本发明实施例的井110的示意剖视图，表示了结构185用于将药物或 气体添加至井中，以便改变进行检验的试样的微环境。现有的传送系统（市场上可获得的 Seahorse XF Analyzer)的细节在US20080014571中介绍，该文献的内容结合到本申请中， 作为参考。药物传送歧管510可以变化成传送环境气体，例如外部气体520,即来自气缸，或 者内部空气530,至直接在各井上面的顶部空间。内部空气可以是例如来自仪器内部的环境 空气，该空气通过较小的内部压缩机来压缩，以便增压药物口，从而传送药物化合物。空气 向顶部空间的传送可以允许控制在测试试样周围的环境，以便产生模拟缺氧（〈5 % O2)或者 氧正常和/或低pH的条件。在一些实施例中，氧、二氧化碳和/或生物惰性气体的源可以 注入井中的介质中或井中的介质表面上面的顶部空间中，用于控制在顶部空间中或在介质 中的气体组分。气体可以从口 460注入介质或顶部空间中。
[0069] 特别是，用于实现它的一种方式是通过参考图2a和2b所述的结构，其中，盒410 包含一组4个口 460,这4个口 460可以用于将多种化合物传送给井板中的试样。例如，在 XF仪器上进行的普通测试是线粒体应力测试。在这种试验中，一系列的注入通过盒的药物 口来传送，以便测量生物试样对各种化合物（寡霉素、FCCP、鱼藤酮和抗霉素）的响应。这 些化合物在执行试验之前预装载至XF盒上的药物储存器（口）中。当盒插入仪器内时，它 与歧管连接，当由电磁阀驱动时，该歧管向储存器的顶部空间提供气动压力，从而迫使化合 物通过小孔进入容纳生物试样的井中。气动歧管和阀系统可以变化，以便将这些口中的一 个重新导向外部气体供应部（气缸或瓶）。气体供应部可以通过在后部连接器面板上的口 而与仪器连接。瓶可以布置在仪器附近，并可以包含调节器和起泡器，用于使得进入的气体 湿润。当驱动时，电磁阀可以打开，从而使得气体能够流过歧管/盒交接面，通过药物口孔， 并进入生物试样上面的顶部空间中。通过使得柱塞（探针）竖直振荡，气体将与介质混合， 从而能够使得试样可控制地获得氧。例如，通过将氩气灌注至顶部空间中，在介质中可获得 的〇 2将被排出，在试样周围产生更缺氧的条件。通过关闭气体和混合，可以重新建立环境 水平的O2。
[0070] 在一些实施例中，生物活性物质的溶液源可以与井中的介质流体连通，用于使得 试样暴露于该物质。
[0071] 为了控制电磁阀的操作和正时，仪器软件可以变化，以方便控制阀/正时，并暴露 一些在标定过程中使用的计算变量。例如，为了计算在介质中的O2的摩尔浓度，在标定时 的浓度优选是已知，并输入计算表中。在一些条件下，初始标定值（F或当前环境浓度）可 能并不知道。在这种情况下，标定和方程（1)(见下面的示例2)的解可以通过将亚硫酸钠 注入一组控制井中以及根据已知的值标定该系统而获得。为了计算这些结果，在软件中 可存取某些系数。单独的窗口可以在软件中产生，以方便存取这些变量、值控制和标定系数 的计算。
[0072] 仪器可以使用井来测试，该井的特征在于细胞线（鼠标C2C12)，以便验证气体系 统的合适操作和控制。可以进行一系列的测试，以便证明从介质中清除〇2和在试样周围产 生缺氧微环境的能力。这些测试可以包括：
[0073] 1.在已知和未知的环境O2浓度下标定仪器；
[0074] 2.验证气体传送系统的性能和将环境O2水平驱动至所需值（〈5% ΡΡ0)的能力。 这可以在仪器中通过查看〇2水平数据来验证。仪器的读数可以提供呈现该数据的视图。
[0075] 用于控制在试样环境中的02和pH的可选方式可以是将整个仪器封装在环境腔室 中，并将腔室抽气至所需水平。这种可选方法可能并不是希望的，因为它可能非常昂贵，占 据大量的实验室空间，并需要较长时间来获得组织周围的所需水平。在达到这些〇 2水平时， 组织可能死去。
[0076] 图6表示了结合本发明实施例使用的分析器的示意图。它包括装置600,该装置 600包括布置在壳体615 (以虚线表示）中的化合物储存和传送装置610,它还包括盒410， 该盒410确定了用于接收传感器结构的多个孔和柔顺安装的多个流体口（在图4a和4b中 详细表示），还包括台架或基部130,用于接收多井板400,例如细胞培养板。盒410布置在 多井板400上面，并用于与多井板400配合。盒410选择地由用于接收该盒410的盒保持 器630来保持。装置还包括安装块640,该安装块640能够往复运动，如由双头箭头所示，优 选是由马达（未示出）提供动力，包括升降机机构650。升降机机构650可以用于使得盒 410相对于台架620或井板400运动。安装块包括气体多路复用器660,该气体多路复用器 660附接在气体供应部或气体储存器670上。气体供应部670与盒流体连通，并用于将测 试流体的传送从盒中的口推向多井板400中的井，或者使得气体组分固定在一个或多个井 中。具有传感器的多个探针或柱塞170用于插入盒410中的多个孔内，并可以用于收集表 示布置在多井板400的井中的细胞的状态的数据。
[0077] 化合物储存和传送装置610由控制器680来控制，该控制器680可以与计算机690 成一体，并可以控制升降机机构、多路复用器和压力源。因此，当相连传感器布置在井中时， 控制器680可以允许测试流体从口传送给相应的井。
[0078] 这里所述的装置是在上面参考的US20080014571中公开的装置的变化形式，并能 够进行三维细胞培养试样的试验和分析，例如组织试样、活检试样或保持细胞的细胞支架。 可以保持试样的存活力，该存活力可控制它的微环境。在某些实施例中，气体可以添加给介 质，或者添加给在井中在介质上面的顶部空间，以便通过改变溶解的气体组分来改变试样 周围的微环境。在某些其它实施例中，生物活性物质的溶液可以添加给介质，以便通过使得 试样暴露于生物活性物质而改变试样周围的微环境。计量量的一种或多种气体和/或一种 或多种药物或其它溶质可以添加给井中的介质，以便将试样周围的介质中的微环境设置成 预定点。在井中的微环境可以设置成缺氧条件。在试样周围的介质中的一种或多种溶质的 浓度可以进行测量。可以进行在试样周围的介质中的一种或多种溶质的浓度的多次测量 (在时间上分开）。
[0079] 在某些其它实施例中，方法包括将氧清除剂（例如亚硫酸钠）添加给介质。
[0080] 人的活检组织试样可以布置在嵌套位置上，可能的治疗药物可以添加给介质，可 以化验药物对试样的效果。
[0081] 示例
[0082] 下面的示例说明了本发明的特定示例、优选实施例和用途，但是并不将说明所有 实施例和用途。
[0083] 示例1 :设计成用于组织灌注和固定的定制注射模制井板和灌注插入件的发展
[0084] Seahorse XF96流量分析器发展和优化以测量在基于细胞的化验中的生物能活 性。XF测量基于专利方法，其中，在单层细胞周围产生较小的暂时测量容积，该层细胞粘 附在井板的底部。当柱塞（探针）降低至井的底部（3. 8mm直径）并与一组架（standoff) (0. 20mm高）接合时产生较小容积，以便产生大约2. 25微升的容积。井板的该设计并没 有优化成用于组织试样，因为（1)试样需要固定和定向，以便防止它们在测量过程中移动； (2)三维试样没有一致和均匀的营养物质供给（灌注）；以及（3)需要较大测量腔室，该测 量腔室将容纳直到200微米厚的试样。为了使得井的几何形状适用于组织试样，这里公开 了一次性的96井板和柱塞（探针）系统，以便在Seahorse XF96仪器内工作，该Seahorse XF96仪器固定、调整方向和提供组织试样的灌注。
[0085] 上面介绍的定制井板和灌注插入件适合用于组织试样。如上所述，井板可以设计 成标准"生物筛网协会" SBS基底面，具有6mm井直径，有在井的底部处的凹入部分（0. 5mm 深、3mm直径），用于定向和控制试样在井的底部处的凹入部分中的定位。灌注插入件设计 成滑入井中，且与壁稍微干涉，因此插入件在试样上面保持就位，并将试样固定在井底部处 的凹入部分中。
[0086] 示例2 :确定pH和氧传感器标定系数
[0087] 井板、插入件和柱塞（探针）可以装配和安装在专用散热器中，该专用散热器提供 了试样的对齐和热控制。可以发展用于传感器的合适位置偏移和标定协议。标定协议包括 确定合适容积、扩散常数和传感器放大率，它们对于该板、插入件和探针的几何形状是唯一 的。这些常数可以使用滴定法测量成已知浓度的标定试剂来计算，以便发展一组系数，该组 系数介绍了作为分析物浓度（〇 2或11+)的函数的信号输出。例如，当标定pH传感器时，通过 确定用于各探针的激励强度（该激励强度在PH7. 4下提供所需的开始信号），光学信号（基 于16位读数）标准化为开始H+浓度（pH7. 4)。在不同H+浓度下的信号进行记录，以便发 展标准曲线。用于标准曲线的系数再装入仪器中，从而各传感器在要测量的一定浓度范围 内进行标定。用于氧传感器的类似标定可以这样进行，即通过使得在环境O 2浓度（PPO = 155mmHg)下的输出标准化，并通过注射亚硫酸钠（或氧清除剂）以产生为零的标定点（ΡΡ0 = OmmHg)来确定第二标定点。Stern Volmer媳灭常数可以根据下面的等式1来计算，该关 系用于在试验过程中在各时间点计算O2水平。
[0088] K = l/02(F〇/F-l) (等式 1)
[0089] 其中：
[0090] K = Stern Volmer 常数
[0091] Ftl =在零O2下的信号输出
[0092] F=在环境下的信号输出
[0093] O2 =在环境下的0 2浓度
[0094] 示例3 :最佳插入件几何形状的确认和选择
[0095] -旦建立标定系数和上传至仪器，就可以进行一系列测试，以便确定用于灌注插 入件的最佳几何形状。这些测试可以涉及对标准的、良好特征细胞线（例如C2C12成纤维 细胞）进行重复0CR/ECAR测量。在各测量之后，柱塞（探针）可以振荡，以便灌注测量腔 室和优化正时、Z行程和速度，从而获得最佳灌注。最佳灌注可以根据系统使得测量腔室恢 复至O 2和pH的开始浓度的能力来确定。
[0096] 示例4-6 :使用本发明实施例的试验研宄
[0097] 制造原型装置，以便评价本发明实施例的各种几何特征和用途，如下面在示例4-6 中所述。装置包括多个圆柱形容器，该圆柱形容器装配有聚碳酸酯灌注插入件。插入件装配 在容器的底部，以便在容器内形成一对腔室，该对腔室通过I. 5_的口连接。上部腔室包括 介质储存器，该介质储存器的容积为下部腔室容积的大约30倍。插入件的内径与Seahorse 传感器盒接合，以便形成活塞状泵，该泵有大约5mm的冲程长度和3mm的直径。当穿过插入 件的内径运动时，Seahorse传感器盒的柱塞迫使介质从腔室的上部部分穿过口进入下部腔 室，它通过在容器的内径和插入件的外径之间的一系列周边通气孔而从该下部腔室离开。 对于盒的各冲程，一定体积的流体灌注通过下部腔室，从而流体周转最少2倍的静止体积。 在下部腔室的底部布置了在容器中的凹入部分（lmmXO. 25mm)，其中，在使用过程中，球形 微组织定位成用于测量。在测量过程中，盒搁置在表面上，传感器在该表面上定位在口（该 口使得顶部腔室与底部腔室隔开）的中心。因此，传感器定位在微组织上面，使得下部腔室 与上部腔室密封。在这样减小的流体体积内，测量值由传感器采集，以便记录在多个时间间 隔中的氧和pH浓度。由这些数据确定氧和pH流量（dO/dT)、（dpH/dT)。该方法用于评价 插入件的几何特征，以便优化流体周转，同时保持组织位置和方便组织代谢特征的测量。
[0098] 示例 4
[0099] 已经证明了使用原型插入件和板来测量单个3D球体的可行性。例如，参考图7,在 2D单层培养物中生长的结肠癌细胞（HTC116)与使用Seahorse生物科学线粒体应力测试 (MST)在3D球体（使用悬挂下降方法）中形成的细胞比较。在右侧的球体图像表示了位于 井的底部的l_X〇. 25_释放部分中的单个微组织（尺寸大约200微米）。信号揭示了在 两种培养类型（最大呼吸、基础）之间的备用呼吸能力上的明显差异。可能的理论解释是， 在2D中生长的细胞具有较高增殖，因此使用更高百分率的基础OCR来支承生长，而在3D (η =3)中的细胞具有两倍更高的备用能力。在该示例中，3D培养物在对于药物暴露（寡霉素 注入）的动态响应中也明显不同，如由3D培养球体中的更缓慢响应所证明。
[0100] 示例 5
[0101] 已经证明了使用原型腔室来灌注、保持和测量单个岛的代谢轮廓的能力。例如，参 考图8,单个胰岛（近似100微米直径）插入板（每个井1个）中，并受到15mM葡萄糖的 系列注射，从而引入FCCP和抗霉素 A。这些信号揭示了测量响应15mM葡萄糖注射的呼吸 的离散变化的能力。而且，通过测量单个岛（每个井1个），人们能够直接比较和询问在岛 群体之间的代谢信号中的不同，以便确定功能。例如，在图表中在上部左侧的岛响应葡萄 糖，而在上部右侧的岛并不响应。这些测量方便根据响应葡萄糖的氧消耗的倍数增加而分 成（binning)组，从而使得岛能够分级，用于在移植之前进行质量控制。在将来的工作中， 该数据可以与共同布置在灌注通路中的一组胰高血糖素和胰岛素的生物标志物相关联，从 而使用原地ELISA化验来使得氧消耗与胰岛素和胰高血糖素分泌相关联。
[0102] 示例 6
[0103] 已经产生了尺寸范围为从50-600微米的3D微组织。例如，使用悬挂下降 方法，细胞与40 μ 1介质一起种入市场上可获得的接种盖中，该接种盖由Insphero Bioscience (Zurich，Switzerland)提供。参考图9,细胞与介质能够结合在液滴的底部，而 在4天后，它们形成一体的球形，包含细胞和自己产生的额外细胞基体（ECM，即当它们形成 组织时包围/覆盖细胞的材料，通常包括蛋白质基体，它确定了细胞周围的微环境）。一旦 形成球形，它们与另外100 μ 1的介质一起置于储存板中，它们将保持在该储存板中直到准 备使用。利用这种方法，3D球体由H印G2(人的肝癌）和HCT116(人的结肠直肠癌）产生。 这些细胞线表示为形成均匀尺寸的球体，作为单培养物和共同培养物。另外，参考图10,包 含MCF-7(乳腺导管癌）的支架盘已经成功产生。这些支架使用2_直径的纤维素滤纸（沃 特曼114)来产生，布置在Seahorse灌注微腔室的底部，并使用Seahorse MST协议来测量 生物能函数。这证明组装、保持和测量自组装球体和支架微盘的生物能函数是可行的。
[0104] 参考图11，球体可以用于执行用于线粒体毒性的测试。在该示例中，肝细胞与无实 质（Kupffer细胞等）细胞共同培养，以便形成具有功能免疫响应的肝微组织。系统用于通 过引入FCCP并测量呼吸能力（FCCP刺激相对于基础OCR)来遮掩毒性组织。这种测试证明 化验可以优化成用于通过首先找到FCCP的最佳浓度来测量线粒体功能，该FCCP的最佳浓 度给出了在刺激和未刺激OCR之间的最大不同。
[0105] 在不脱离本发明的精神或基本特征的情况下，本发明可以以其它特殊形式来实 施。因此，前述实施例将被认为在所有方面示例说明了这里所述的本发明。不同实施例的 多个特征和元件能够以不同组合和排列来使用，如本领域技术人员所知。因此，本发明的范 围由附加权利要求来表示，而不是前述说明，因此，在权利要求的等效意思和范围内的所有 变化都将包含在本发明中。
【权利要求】
1. 一种用于进行=维细胞试样的分析的装置，所述装置包括： 多个井，用于保持相应试样和试样介质，所述多个井中的至少一个井包括： 布置于井中的试样嵌套部位； 布置在试样嵌套部位上面的孔，所述孔的尺寸设置成与柱塞相互配合，所述柱塞在孔 内相对于所述孔和在布置于所述井中的试样介质内竖直向下运动；W及 介质槽道，所述介质槽道与所述试样嵌套部位流体连通，所述介质槽道允许介质由柱 塞推动而流动通过，并允许所述试样在柱塞运动时暴露于新鲜介质。
2. 根据权利要求1所述的装置，其中准塞相对于试样嵌套部位运动，W便引起试样介 质在试样周围的灌注。
3. 根据权利要求1所述的装置，其中：柱塞和试样嵌套部位一起运动，W便使得试样暴 露于试样介质的不同区域。
4. 根据权利要求1所述的装置，其中；所述介质槽道包括流体通路，所述流体通路使得 在试样周围灌注的介质返回至布置于井中的介质。
5. 根据权利要求1所述的装置，其中；至少所述孔由可拆卸的井插入件来限定。
6. 根据权利要求1所述的装置，其中：至少所述试样嵌套部位和所述孔由可拆卸的井 插入件来限定。
7. 根据权利要求1所述的装置，其中；所述试样嵌套部位、所述孔和所述介质槽道由可 拆卸的井插入件来限定。
8. 根据权利要求1所述的装置，其中：所述试样嵌套部位包括由可拆卸的井插入件限 定的、介质可透过的平台。
9. 根据权利要求1所述的装置，其中：井包括与介质槽道流体连通的贬槽。
10. 根据权利要求1所述的装置，其中：所述试样嵌套部位布置在用于收集介质并与所 述介质槽道流体连通的贬槽中。
11. 根据权利要求1所述的装置，其中；所述介质槽道包括流体通路，所述流体通路限 定在井中的介质表面下面的闭合环路，W便当柱塞在所述孔内向上和向下运动时都允许介 质在所述试样周围灌注流动。
12. 根据权利要求1所述的装置，还包括；传感器，用于检测布置在所述试样周围的介 质中的溶质浓度。
13. 根据权利要求12所述的装置，其中：传感器布置在井的底部。
14. 根据权利要求1所述的装置，还包括；柱塞，所述柱塞用于在相应井的孔内往复运 动。
15. 根据权利要求14所述的装置，还包括；传感器，所述传感器布置在柱塞上，用于检 测布置在所述试样周围的介质中的溶质浓度。
16. 根据权利要求12或15所述的装置，其中：所述传感器测量在所述试样周围的介质 中溶解的氧、二氧化碳或氨离子的浓度。
17. 根据权利要求1所述的装置，其中：所述多个井限定了包括24或96个井的多井板。
18. 根据权利要求1所述的装置，还包括：氧、二氧化碳和/或生物惰性气体的源，所述 源与井中的介质或在井中的介质表面上面的顶部空间流体连通，用于控制在所述顶部空间 中或介质中的气体的组成。
19. 根据权利要求1所述的装置，还包括：生物活性物质的溶液源，所述溶液源与井中 的介质流体连通，用于使得试样暴露于所述物质。
20. 根据权利要求1所述的装置，还包括：布置在所述试样嵌套部位上的=维细胞生长 支架。
21. -种用于进行=维细胞试样的分析的装置，所述装置包括： 井，用于保持试样和试样介质，所述井包括： 试样嵌套部位； 布置在所述试样嵌套部位上面的孔，所述孔的尺寸设置成与柱塞相互配合，所述柱塞 在孔内和在布置于所述井中的介质内竖直向下运动；W及 介质槽道，所述介质槽道与所述试样嵌套部位流体连通，所述介质槽道允许介质在所 述试样周围灌注；W及 柱塞，用于在所述孔中往复运动，W便推动介质在所述试样周围灌注。
22. 根据权利要求21所述的装置，还包括；传感器，用于检测在试样嵌套部位周围的介 质中的溶解介质成分的浓度。
23. -种用于培养板的井的插入件，用于使得井适合对于布置于其中的=维细胞培养 试样进行灌注，所述插入件包括该样的结构，所述结构限定了： 试样嵌套部位，所述试样嵌套部位包括介质可透过的平台； 布置在试样嵌套部位上面的孔，所述孔的尺寸设置成与柱塞相互配合，所述柱塞在孔 内和在布置于井中的介质内竖直向下运动；W及 介质槽道，所述介质槽道与所述试样嵌套部位流体连通，所述介质槽道允许介质由柱 塞推动而在所述试样周围灌注。
24. -种对于=维细胞培养试样例如组织试样、活检试样或保持细胞的细胞支架进行 试验、W便保持试样的生存力和对它的微环境进行控制的方法，所述方法包括W下步骤： 提供井，所述井包括：试样嵌套部位；孔，所述孔的尺寸设置成与布置在试样嵌套部位 上面的柱塞相互配合；介质槽道，所述介质槽道与所述试样嵌套部位流体连通；W及柱塞， 所述柱塞用于在所述孔中往复运动； 将试样布置在井内的介质中的试样嵌套部位上；W及 使得所述柱塞在孔内运动，W便推动介质在试样周围流动和通过所述介质槽道，从而 W介质灌注试样。
25. 根据权利要求24所述的方法，还包括W下附加步骤；将气体添加给介质或在井中 在介质上面的顶部空间，W便通过改变溶解气体组分来改变试样周围的微环境。
26. 根据权利要求24所述的方法，还包括W下附加步骤；将生物活性物质的溶液添加 给介质，W便通过使得试样暴露于生物活性物质而改变试样周围的微环境。
27. 根据权利要求24所述的方法，还包括W下附加步骤；测量在所述试样周围的介质 中的一种或多种溶质的浓度。
28. 根据权利要求24所述的方法，还包括W下附加步骤；对在所述试样周围的介质中 的一种或多种溶质的浓度进行多次测量，该些测量在时间上分开。
29. 根据权利要求24所述的方法，还包括W下附加步骤；将计量量的一种或多种气体 和/或一种或多种溶质添加给所述井中的介质，从而将所述试样周围的介质中的微环境设 置成预定点。
30.根据权利要求29所述的方法，还包括；将微环境设置成缺氧条件。
31.根据权利要求29所述的方法，还包括；将氧清除剂添加给介质。
32.根据权利要求24所述的方法，还包括；将人体活检组织试样布置在所述嵌套部位 上；将可能的治疗药物添加给介质；W及估计药物对试样的效果。
33.根据权利要求32所述的方法，还包括W下附加步骤；将计量量的一种或多种气体 和/或一种或多种溶质添加给所述井中的介质，从而将所述试样周围的介质中的微环境设 置成预定点。
34.根据权利要求24或32所述的方法，其中：试样是肿瘤试样，所述方法还包括W下 附加步骤：将计量量的一种或多种气体和/或一种或多种溶质添加给所述井中的介质，W 将所述试样周围的介质中的微环境设置成预定点，从而模拟肿瘤试样在活体内的微环境。
35.根据权利要求24所述的方法，还包括，使得所述方法通过W下步骤来多路复用： 提供多个所述井，所述井包括：试样嵌套部位；孔，所述孔的尺寸设置成与布置在试样 嵌套部位上面的柱塞相互配合；介质槽道，所述介质槽道与所述试样嵌套部位流体连通； W及柱塞，所述柱塞用于在所述孔中往复运动； 将试样布置在多个井内的介质中的试样嵌套部位上； 使得多个所述柱塞在孔内运动，W便推动介质在试样周围流动和通过所述介质槽道， 从而W介质灌注试样；W及 一次或多次测量在多个所述井中在所述试样周围的介质中的一种或多种溶质的浓度。
36.根据权利要求24所述的方法，还包括W下附加步骤；将一个或多个载有固定不动 的胶合剂的小珠布置在介质中，所述胶合剂用于由试样分泌或吸收的感兴趣生物分子；W 及使用所述小珠来检测所述生物分子在试样的微环境中的存在性或浓度。
37.根据权利要求1所述的装置，还包括；止回阀，所述止回阀布置在所述介质槽道中， W便防止介质相对于试样从介质槽道往回灌注。
【文档编号】B01L3/00GK104471052SQ201380003973
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年11月13日 优先权日:2012年11月13日
【发明者】P·麦克戈尔, A·C·尼尔森, J·S·泰希 申请人:海马生物科学公司