一种磁性金属有机骨架复合材料的合成方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提出了具有三明治结构的磁性微球四氧化三铁表面包覆聚多巴胺和以锆离子为中心金属离子的金属有机骨架复合材料的合成方法及其应用。首先用水热合成法合成四氧化三铁磁性微球；将磁球分散在聚多巴胺盐酸盐的水溶液中，使其表面包覆上聚多巴胺层；将聚多巴胺包覆的磁球分散在氯化锆和对苯二甲酸的N,N-二甲基甲酰胺混合溶液中，制得具有三明治结构的磁性金属有机骨架材料。该合成方法简单快捷，合成所得的磁性金属有机骨架材料具有高比表面积和良好生物相容性，可用于生物样品中磷酸化肽的选择性富集和MALDI-TOFMS检测。
【专利说明】一种磁性金属有机骨架复合材料的合成方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于先进纳米材料与纳米【技术领域】，具体涉及一种用于磷酸化肽富集与MALD1-TOF MS检测的一种磁性微球四氧化三铁表面包覆聚多巴胺和以锆离子为中心金属离子的金属有机骨架复合材料的合成方法及其应用。
【背景技术】
[0002]磷酸化是生物细胞中最普遍的翻译后修饰之一，在信号传导、基因表达、新陈代谢、细胞生长、分裂和分化中发挥着重要作用。据估算一个细胞中有30-50%的蛋白质会在任意时刻发生磷酸化，因此对于蛋白质磷酸化的探索是蛋白质组学研究中的重大课题。质谱是磷酸化分析的主要手段。但是磷酸化蛋白/磷酸化肽的丰度非常低，并且一个蛋白质在单个位点的磷酸化信息通常是不完整的，此外磷酸化肽的质谱信号往往为非磷酸化肽段残基所掩蔽，使得磷酸化肽的电离效率非常低。因此在质谱分析前对于复杂生物样品中的磷酸化蛋白/磷酸化肽进行选择性富集是成功鉴定磷酸化蛋白/磷酸化肽的前提。
[0003]近年来，许多方法被用来选择性分离富集磷酸化蛋白/磷酸化肽，如免疫沉淀法、化学修饰方法、强阳离子交换色谱法、固定金属离子亲和色谱法、金属氧化物亲和色谱法等。其中固定金属离子亲和色谱法(IMAC)得到了最广泛的应用，该方法通过磷酸根基团与固定在吸附剂上的金属离子间的亲和作用进行选择性吸附。IMAC方法具有快速、操作简便、成本低廉的特性，相比于其它方法显示出优越性。传统IMAC方法在样品处理过程中需要借助高速离心，从而造成麻烦费力的预处理步骤和不必要的样品损失。为了解决这一问题，功能化磁性纳米材料被广泛应用于磷酸化蛋白/磷酸化肽的富集研究。磁性基质可以将捕获到的磷酸化肽从样品溶液中方便地分离出来，免去了最易造成样品损失的离心过程。迄今为止，有许多功能化磁性纳米材料被成功合成并用于磷酸化肽的富集，但它们富集磷酸化肽的能力常常受制于有限的比表面积和较差的亲水性。
[0004]金属有机骨架材料(MOFs)是一类多孔的晶体材料，由中心金属离子与有机配体通过配位键连接而成。MOF材料近十年来发展迅速，因具有大的比表面积、富含能与含有电子的被分析物质相互作用的路易斯酸性位点和芳香性有机配体、孔道和外表面易于修饰和优良的机械稳定性等特点，MOF材料成为了分析化学领域的研究热点之一。MOF材料和磁性MOF材料先后被成功应用于低丰度肽的分离富集。MOF材料也被成功应用于磷酸化肽的富集。因此，迫切需要一种新的金属有机骨架复合材料的合成方法及其应用。
【发明内容】
[0005]本发明目的在于提供一种磁性金属有机骨架复合材料的合成方法，尤其是一种磁性微球四氧化三铁表面包覆聚多巴胺和以锆离子为中心金属离子的金属有机骨架复合材料的合成方法。
[0006]本发明提供的一种磁性微球四氧化三铁表面包覆聚多巴胺和以锆离子为中心金属离子的金属有机骨架复合材料的合成方法，具体步骤如下: (1)六水合三氯化铁溶于乙二醇中，磁力搅拌至澄清后，加入醋酸钠，充分搅拌后转移至水热反应釜中，190-200°c下加热10-18小时，取出反应釜，冷却10-12小时；从反应釜中倒出反应所得的四氧化三铁磁球，并用去离子水充分洗涤，40-60°C下真空干燥；其中，六水合三氯化铁和醋酸钠的重量比为:(1.0-1.5): (3.0-10.0)；
(2)配制三羟甲基氨基甲烷-盐酸Tris-HCl缓冲液，溶剂为去离子水，pH=8.5，将步骤(I)所得四氧化三铁磁球分散在Tris-HCl缓冲液中，超声数分钟，加入多巴胺盐酸盐，四氧化三铁磁球和多巴胺盐酸盐的重量比为1:4室温下机械搅拌6-20小时，制得四氧化三铁表面包覆聚多巴胺，反应完毕后用磁铁分离，产物用去离子水和无水乙醇充分洗涤，40-60°C下真空干燥；
(3)配制氯化锆和对苯二甲酸的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)混合溶液，N，N-二甲基甲酰胺溶液中氯化锆和对苯二甲酸的重量比为(1-8):1
(4)将步骤(2)所得产物四氧化三铁表面包覆聚多巴胺分散在步骤(3)所得混合溶液中，四氧化三铁表面包覆聚多巴胺和混合溶液的重量比为(1-10):1，140-160°C下加热20-40分钟；
(5)步骤(4)所得产物用无水乙醇充分洗涤，40-60°C下真空干燥，即得所需材料。
[0007]本发明中，步骤(I)中六水合三氯化铁和醋酸钠的重量比为1.35:3.6。
[0008]本发明还提出了一种磁性微球四氧化三铁表面包覆聚多巴胺和以锆离子为中心金属离子的金属有机骨架复合材料的在磷酸化肽富集与质谱鉴定中的应用。
[0009]本发明还提出了一种磁性微球四氧化三铁表面包覆聚多巴胺和以锆离子为中心金属离子的金属有机骨架复合材料的在磷酸化肽富集与质谱鉴定中的应用:将产物磁性微球四氧化三铁表面包覆聚多巴胺和以锆离子为中心金属离子的金属有机骨架复合材料配成浓度为10 mg/mL的分散液，溶剂为超纯水，将该分散液和目标磷酸化肽溶液加入50%乙腈/0.1%三氟乙酸缓冲液中，混合，在酶解仪中孵育；通过外加磁场分离出磁性微球，用50%乙腈/0.1%三氟乙酸缓冲液洗涤，用0.4M氨水洗脱洗脱液点在MALD1-TOF MS靶板上，自然干燥后再滴加0.8 μ L浓度为20 mg/mL的2，5- 二羟基苯甲酸(DHB)溶液于被分析物液滴上，形成薄基质层，干后进行质谱分析。
[0010]本发明的有益效果在于:所提供的磁性微球包覆聚多巴胺和金属有机骨架复合材料的合成方法简单，制备所得材料具有良好的磁响应性、亲水性和大比表面积，对磷酸化肽具有很强的吸附作用，可作为富集分离磷酸化肽的固相微萃取吸附剂。该材料以锆离子为中心离子、对苯二甲酸为配体的金属有机骨架作为壳层，提供了对目标磷酸化肽的强烈吸附作用，具有高的磁响应性和优越的富集灵敏度和选择性，可取得I fmol的检测限和对于非磷酸化肽1:500 (摩尔质量比)的选择性。其合成方法简单、成本低，在磷酸化肽富集与MALD1-TOF MS鉴定中具有灵敏度高、信噪比放大倍数高、选择性高、适用于复杂生物样品等特点。
[0011]本发明首次合成了具有强的磁响应性的磁性MOF材料并应用于磷酸化肽的富集。通过外加磁场，捕获了磷酸化肽的磁性复合材料可以方便地从样品溶液中分离出来，使富集和后续的洗脱过程变得快速简便，大大缩短了富集分离的时间。同时，金属有机骨架中的锆离子对目标磷酸化肽具有很强的亲和力，使得经过该磁性MOF材料富集后，肽段分子的质谱信号显著增强，而聚多巴胺层使材料具有良好亲水性，对磷酸化肽的分析检测限可达Ifmol，对于非磷酸化肽的选择性达到了 1:500 (摩尔质量比)。
[0012]本发明中所涉及的具有四氧化三铁内核和金属有机骨架壳层的磁性微球包覆聚多巴胺和金属有机骨架复合材料，合成方法简单新颖，以锆离子为中心离子的金属有机骨架对磷酸化肽的富集具有高灵敏度和特异性，而金属有机骨架提高了材料的比表面积，聚多巴胺增强了材料的亲水性，磁性微球的引入简化了分离步骤，可将此复合材料用于低丰度磷酸化肽的富集与MALD1-TOF MS检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为实施例1的透射电子显微镜照片，其中(a)和(b)为磁性微球四氧化三铁表面包覆聚多巴胺的透射电子显微镜照片；(C)和(d)为磁性微球四氧化三铁表面包覆聚多巴胺和以锆离子为中心金属离子的金属有机骨架复合材料的透射电子显微镜照片；
图2为实施例1的扫描电子显微镜照片，其中(a)为磁性微球四氧化三铁表面包覆聚多巴胺的透射电子显微镜照片，(b)为磁性微球四氧化三铁表面包覆聚多巴胺和以锆离子为中心金属离子的金属有机骨架复合材料的扫描电子显微镜照片；
图3为实施例2中100 nM的β -casein酶解液经磁性微球四氧化三铁表面包覆聚多巴胺和以锆离子为中心金属离子的金属有机骨架复合材料选择性富集后的质谱图；
图4为实施例2中10 nM的β -casein酶解液经磁性微球四氧化三铁表面包覆聚多巴胺和以锆离子为中心金属离子的金属有机骨架复合材料选择性富集后的质谱图；
图5为实施例4中摩尔质量比为1:100的β -casein和BSA蛋白酶解液混合溶液经磁性微球四氧化三铁表面包覆聚多巴胺和以锆离子为中心金属离子的金属有机骨架复合材料选择性富集前后的质谱图；其中(a)为富集前的质谱图；(b)为经磁性微球四氧化三铁表面包覆聚多巴胺和以锆离子为中心金属离子的金属有机骨架复合材料选择性富集后的质谱图；
图6为实施例4中摩尔质量比为1:200的β -casein和BSA蛋白酶解液混合溶液经磁性微球四氧化三铁表面包覆聚多巴胺和以锆离子为中心金属离子的金属有机骨架复合材料选择性富集前后的质谱图；其中(a)为富集前的质谱图；(b)为经磁性微球四氧化三铁表面包覆聚多巴胺和以锆离子为中心金属离子的金属有机骨架复合材料选择性富集后的质谱图；
图7为实施例4中摩尔质量比为1:400的β -casein和BSA蛋白酶解液混合溶液经磁性微球四氧化三铁表面包覆聚多巴胺和以锆离子为中心金属离子的金属有机骨架复合材料选择性富集前后的质谱图；(a)为富集前的质谱图；(b)为经磁性微球四氧化三铁表面包覆聚多巴胺和以锆离子为中心金属离子的金属有机骨架复合材料选择性富集后的质谱图；
图8为实施例4中摩尔质量比为1:500的β -casein和BSA蛋白酶解液混合溶液经磁性微球四氧化三铁表面包覆聚多巴胺和以锆离子为中心金属离子的金属有机骨架复合材料选择性富集前后的质谱图；(a)为富集前的质谱图；(b)为经磁性微球四氧化三铁表面包覆聚多巴胺和以锆离子为中心金属离子的金属有机骨架复合材料选择性富集后的质谱图；
图9为实施例6中肝癌病人血清溶液中的肽段经磁性微球四氧化三铁表面包覆聚多巴胺和以锆离子为中心金属离子的金属有机骨架复合材料选择性富集前后的质谱图；其中Ca)为富集前的质谱图；(b)为经磁性微球四氧化三铁表面包覆聚多巴胺和以锆离子为中心金属离子的金属有机骨架复合材料选择性富集后的质谱图。
【具体实施方式】
[0014]下面的实施例是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。
[0015]实施例1:一种磁性微球四氧化三铁表面包覆聚多巴胺和以锆离子为中心金属离子的金属有机骨架复合材料的合成
(I)将1.35 g六水合三氯化铁(FeCl3.6H20)溶于75 mL乙二醇中，磁力搅拌至澄清后，加入3.6 g醋酸钠，搅拌至溶解后继续搅拌0.5h，超声5分钟后转移至水热反应釜中，200°C下加热16小时。取出反应釜，冷却10小时；从反应釜中倒出反应所得的磁球，用去离子水洗涤5次。50°C下真空干燥。
[0016](2)配制三羟甲基氨基甲烷-盐酸(TriS-HCl)缓冲液(溶剂为去离子水，pH=8.5)，将步骤(I)所得磁球0.1 g分散在TriS-HCl缓冲液80 mL中，超声数分钟，加入多巴胺盐酸盐0.4 g，室温下机械搅拌10小时，制得四氧化三铁表面包覆聚多巴胺。反应完毕后用磁铁分离，产物用去离子水和无水乙醇充分洗涤。50V下真空干燥。
[0017](3)配制氯化锆和对苯二甲酸的N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)混合溶液40 mL，其中含有氯化锆0.078 g和对苯二甲酸0.013 g0
[0018](4)将步骤(2)所得产物0.1 g分散在步骤(3)所得混合溶液中，140°C下加热30分钟；
(5)步骤(4)所得产物用无水乙醇充分洗涤，50°C下真空干燥，即得所需材料。
[0019]图1为所得的磁性微球四氧化三铁表面包覆聚多巴胺和以锆离子为中心金属离子的金属有机骨架复合材料的透射电子显微镜照片；透射电镜型号为JEM-2100F (JOEL),将纯化后的磁性微球的乙醇分散液滴在覆有碳膜的铜网上，自然干燥后用透射电子显微镜观察并拍照。
[0020]图2为所得的磁性微球四氧化三铁表面包覆聚多巴胺和以锆离子为中心金属离子的金属有机骨架复合材料的扫描电子显微镜照片；扫描电镜型号为Philips XL30,将纯化后的样品均勻涂布在导电胶上，SEM表征前表面喷涂一层金。
[0021]实施例2:将实施例1得到的磁性微球四氧化三铁表面包覆聚多巴胺和以锆离子为中心金属离子的金属有机骨架复合材料作为固相微萃取吸附剂用于低浓度β -casein酶解液的富集与MALD1-TOF MS检测。
[0022](I)标准蛋白酶解液的制备:准确称取2 mg标准蛋白β -casein溶于25mM碳酸氢铵缓冲液中，煮沸10分钟，用25mM碳酸氢铵缓冲液稀释到0.2 mg/mL，然后按照与蛋白质量比1:40加入适量的胰蛋白酶(trypsin), 37°C下酶解16小时。
[0023](2)试样的富集:用25mM碳酸氢铵缓冲液稀释标准蛋白酶解液至浓度为100 nM或10 nM，取I μ L酶解液的稀释液加到200 μ L 50%乙腈/0.1%三氟乙酸缓冲液中，再加入10 μ L磁性微球四氧化三铁表面包覆聚多巴胺和以锆离子为中心金属离子的金属有机骨架复合材料的分散液(浓度为10 mg/mL), 37°C下混旋20分钟；通过外加磁场分离出磁性微球，用200 μ L 50%乙腈/0.1%三氟乙酸缓冲液洗涤三次后，用0.4Μ氨水10 μ L洗脱10分钟，磁铁分离。
[0024](3)点靶步骤(2)所述洗脱液点到MALD1-TOF MS靶板上，室温下置于空气中自然干燥后，再取0.8μ L浓度为20 mg/mL的2，5-二羟基苯甲酸(DHB)溶液作为基质滴于被分析物液滴上，产生薄基质层，干后进行质谱分析。
[0025](4)质谱分析以磁性微球包覆金属有机骨架复合材料作为吸附剂富集到的磷酸化肽分子。
[0026]浓度为100 nM的β-casein酶解液经磁性微球包覆金属有机骨架复合材料富集后，质谱图中出现了三条源于β-casein蛋白的磷酸化肽峰(m/z= 3122.27，m/z=2556.09和m/z= 2061.83)以及两条源于a-casein蛋白的磷酸化肽峰(m/z= 1660.79和m/z= 1253.11)。浓度为10 nM的β-casein酶解液经磁性微球包覆金属有机骨架复合材料富集后，质谱图中出现了三条源于β-casein蛋白的磷酸化肽峰(m/z= 3122.27，m/z=2556.09 和 m/z= 2061.83)。
[0027]实施例3:—种磁性微球四氧化三铁表面包覆聚多巴胺和以锆离子为中心金属离子的金属有机骨架复合材料的合成
(I)将1.0 g六水合三氯化铁(FeCl3WH2O)溶于55 mL乙二醇中，磁力搅拌至澄清后，加入3.0 g醋酸钠，搅拌至溶解后继续搅拌0.5h，超声5分钟后转移至水热反应釜中，1900C下加热18小时。取出反应爸,冷却12小时；从反应爸中倒出反应所得的磁球,用去离子水洗涤9次。60°C下真空干燥。
[0028](2)配制三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液(溶剂为去离子水，ρΗ=8.5)，将步骤(I)所得磁球0.05 g分散在Tris-HCl缓冲液40 mL中，超声数分钟，加入多巴胺盐酸盐0.2 g，室温下机械搅拌20小时，制得四氧化三铁表面包覆聚多巴胺。反应完毕后用磁铁分离，产物用去离子水和无水乙醇充分洗涤。60V下真空干燥。
[0029](3)配制氯化锆和对苯二甲酸的N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)混合溶液50 mL，其中含有氯化锆0.1 g和对苯二甲酸0.02 g。
[0030](4)将步骤(2)所得产物0.1 g分散在步骤(3)所得混合溶液中，150°C下加热25分钟；
(5)步骤(4)所得产物用无水乙醇充分洗涤，60°C下真空干燥，即得所需材料。
[0031]实施例4:将实施例3得到的磁性微球四氧化三铁表面包覆聚多巴胺和以锆离子为中心金属离子的金属有机骨架复合材料作为固相微萃取吸附剂用于β -casein酶解液和牛血清白蛋白(BSA)酶解液混合溶液的富集与MALD1-TOF MS检测。
[0032](I)标准蛋白酶解液的制备:准确称取2mg标准蛋白β -casein和5mg标准蛋白BSA溶于25mM碳酸氢铵缓冲液中，煮沸10分钟，用25mM碳酸氢铵缓冲液将β -casein溶液稀释到0.2 mg/mL,按照与蛋白质量比I:40向0.2 mg/mL β -casein蛋白溶液和5 mg/mLBSA蛋白溶液中加入适量的胰蛋白酶(trypsin), 37°C下酶解16小时。
[0033](2)试样的富集:分别按蛋白摩尔质量比1:100、1:200、1:400和1:500将β -casein酶解液与BSA酶解液混合，取2 μ L标准蛋白酶解液混合溶液加到200 μ L 50%乙腈/0.1%三氟乙酸缓冲液中，再加入10 μ L磁性微球四氧化三铁表面包覆聚多巴胺和以锆离子为中心金属离子的金属有机骨架复合材料的分散液(浓度为10 mg/mL), 37°C下混旋20分钟；通过外加磁场分离出磁性微球，用200 μ L 50%乙腈/0.1%三氟乙酸缓冲液洗涤三次后,用0.4M氨水10 μ L洗脱10分钟,磁铁分离。
[0034](3)点靶步骤(2)所述洗脱液点到MALD1-TOF MS靶板上，室温下置于空气中自然干燥后，再取0.8 μ L浓度为20 mg/mL的2，5-二羟基苯甲酸(DHB)溶液作为基质滴于被分析物液滴上，产生薄基质层，干后进行质谱分析。
[0035]( 4 )质谱分析以磁性微球包覆金属有机骨架复合材料作为吸附剂从标准蛋白酶解液混合溶液中富集到的肽段，同时与富集之前酶解液混合溶液肽段的质谱图进行对比。
[0036]摩尔质量比为1: 100的β -casein和BSA蛋白酶解液混合溶液经磁性微球包覆金属有机骨架复合材料富集后，质谱中清楚地呈现了三条源于β -casein蛋白的磷酸化肽峰(m/z= 3122.27，m/z= 2556.09 和 m/z= 2061.83)和三条去磷酸化峰(m/z= 3024,2458,1963)以及 5 条源于 a-casein 蛋白的磷酸化肽峰(m/z= 1951.95，1660.79，1466.51，1278.60，1253.11)。摩尔质量比为1:200的β -casein和BSA蛋白酶解液混合溶液经磁性微球包覆金属有机骨架复合材料富集后，质谱中清楚地呈现了三条源于β -casein蛋白的憐酸化妝峰(m/z= 3122.27，m/z= 2556.09和m/z= 2061.83)和一条去憐酸化峰(m/Z= 2458)以及 5 条源于 a -casein 蛋白的磷酸化肽峰(m/z= 1951.95，1660.79，1466.51，1278.60，1253.11)。摩尔质量比为1:400的β -casein和BSA蛋白酶解液混合溶液经磁性微球包覆金属有机骨架复合材料富集后，质谱中清楚地呈现了三条源于β -casein蛋白的憐酸化妝峰(m/z= 3122.27，m/z= 2556.09和m/z= 2061.83)和一条去憐酸化峰(m/Z= 2458)以及 3 条源于 a -casein 蛋白的磷酸化肽峰(m/z= 1951.95，1466.51，1278.60)。摩尔质量比为1:500的β -casein和BSA蛋白酶解液混合溶液经磁性微球包覆金属有机骨架复合材料富集后，质谱中清楚地呈现了两条源于β-casein蛋白的磷酸化肽峰(m/z=2556.09 和 m/z= 2061.83)和一条去磷酸化峰(m/z= 2458，1963)以及 3 条源于 a -casein蛋白的磷酸化肽峰(m/z= 1951.95，1660.79，1466.51)。
[0037]实施例5:—种磁性微球四氧化三铁表面包覆聚多巴胺和以锆离子为中心金属离子的金属有机骨架复合材料的合成
(I)将1.2 g六水合三氯化铁(FeCl3WH2O)溶于60 mL乙二醇中，磁力搅拌至澄清后，加入3.2 g醋酸钠，搅拌至溶解后继续搅拌0.5h，超声5分钟后转移至水热反应釜中，200°C下加热18小时。取出反应爸,冷却12小时；从反应爸中倒出反应所得的磁球,用去离子水洗涤5次。50°C下真空干燥。
[0038](2)配制三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液(溶剂为去离子水，ρΗ=8.5)，将步骤(I)所得磁球0.08 g分散在Tris-HCl缓冲液40 mL中，超声数分钟，加入多巴胺盐酸盐0.32 g，室温下机械搅拌10小时，制得四氧化三铁表面包覆聚多巴胺。反应完毕后用磁铁分离，产物用去离子水和无水乙醇充分洗涤。50V下真空干燥。
[0039](3)配制氯化锆和对苯二甲酸的N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)混合溶液80 mL，其中含有氯化锆0.06 g和对苯二甲酸0.05 g0
[0040](4)将步骤(2)所得产物0.1 g分散在步骤(3)所得混合溶液中，160°C下加热25分钟；
(5)步骤(4)所得产物用无水乙醇充分洗涤，50°C下真空干燥，即得所需材料。
[0041]实施例6:将实施例5得到的磁性微球四氧化三铁表面包覆聚多巴胺和以锆离子为中心金属离子的金属有机骨架复合材料作为固相微萃取吸附剂用于肝癌病人血清样品溶液中磷酸化肽的富集与MALD1-TOF MS检测。
[0042](I)试样的准备:将2 μ L肝癌病人的血清加到200 μ L 50%乙腈/0.1%三氟乙酸缓冲液中。配制浓度为lOmg/mL的金属有机骨架复合材料的悬浊液，溶剂为超纯水，并用混旋仪混旋。
[0043](2)试样的富集:向含有肝癌病人血清的50%乙腈/0.1%三氟乙酸缓冲液中加入10 μ L磁性微球四氧化三铁表面包覆聚多巴胺和以锆离子为中心金属离子的金属有机骨架复合材料的分散液，37°C下混旋20分钟；通过外加磁场分离出磁性微球，用200 μ L 50%乙腈/0.1%三氟乙酸缓冲液洗涤三次后，用0.4Μ氨水10 μ L洗脱10分钟，磁铁分离。
[0044](3)点靶:取I μ L步骤(2)所述洗脱液点到MALD1-TOF MS靶板上，室温下置于空气中自然干燥后，再取0.8μ L浓度为20 mg/mL的2，5-二羟基苯甲酸(DHB)溶液作为基质滴于被分析物液滴上，产生薄基质层，干后进行质谱分析。
[0045](4)质谱分析以磁性微球包覆金属有机骨架复合材料作为吸附剂从肝癌病人血清溶液中富集到的磷酸化肽，同时与富集之前肝癌病人血清溶液中肽段的质谱图进行对比。
[0046]肝癌病人血清溶液富集前，磷酸化肽在质谱中的信号受到非磷酸化肽的严重干扰而无法检测到；经磁性微球四氧化三铁表面包覆聚多巴胺和以锆离子为中心金属离子的金属有机骨架复合材料富集后，质谱分析结果显示只有四条肝癌病人的特征磷酸化肽峰(m/Z= 1389， 1460， 1545， 1616)。
[0047]实施例7:—种磁性微球四氧化三铁表面包覆聚多巴胺和以锆离子为中心金属离子的金属有机骨架复合材料的合成
(I)将1.4g六水合三氯化铁(FeCl3.6Η20)溶于85mL乙二醇中，磁力搅拌至澄清后，力口入9.0g醋酸钠，搅拌至溶解后继续搅拌0.5h，超声5分钟后转移至水热反应釜中，200°C下加热10小时。取出反应爸,冷却11小时；从反应爸中倒出反应所得的磁球,用去离子水洗涤11次。60°C下真空干燥。
[0048](2)配制三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液(溶剂为去离子水，pH=
8.5)，将步骤(I)所得磁球0.2 g分散在Tris-HCl缓冲液40 mL中，超声数分钟，加入多巴胺盐酸盐0.8 g，室温下机械搅拌12小时，制得四氧化三铁表面包覆聚多巴胺。反应完毕后用磁铁分离，产物用去离子水和无水乙醇充分洗涤。60V下真空干燥。
[0049](3)配制氯化锆和对苯二甲酸的N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)混合溶液60 mL，其中含有氯化锆0.1 g和对苯二甲酸0.05 go
[0050](4)将步骤(2)所得产物0.2 g分散在步骤(3)所得混合溶液中，160°C下加热30分钟；
(5)步骤(4)所得产物用无水乙醇充分洗涤，60°C下真空干燥。
【权利要求】
1.一种磁性金属有机骨架复合材料的合成方法，其特征在于具体步骤如下: (1)六水合三氯化铁溶于乙二醇中，磁力搅拌至澄清后，加入醋酸钠，充分搅拌后转移至水热反应釜中，190-200°c下加热10-18小时，取出反应釜，冷却10-12小时；从反应釜中倒出反应所得的四氧化三铁磁球，并用去离子水充分洗涤，40-60°C下真空干燥；其中，六水合三氯化铁和醋酸钠的重量比为:(1.0-1.5): (3.0-10.0)； (2)配制三羟甲基氨基甲烷-盐酸Tris-HCl缓冲液，溶剂为去离子水，pH=8.5，将步骤(1)所得四氧化三铁磁球分散在Tris-HCl缓冲液中，超声数分钟，加入多巴胺盐酸盐，四氧化三铁磁球和多巴胺盐酸盐的重量比为1:4室温下机械搅拌6-20小时，制得四氧化三铁表面包覆聚多巴胺，反应完毕后用磁铁分离，产物用去离子水和无水乙醇充分洗涤，40-60°C下真空干燥； (3)配制氯化锆和对苯二甲酸的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)混合溶液，N，N-二甲基甲酰胺溶液中氯化锆和对苯二甲酸的重量比为(1-8):1 ； (4)将步骤(2)所得产物四氧化三铁表面包覆聚多巴胺分散在步骤(3)所得混合溶液中，四氧化三铁表面包覆聚多巴胺和混合溶液的重量比为(1-10):1，140-160°C下加热20-40分钟；
(5)步骤(4)所得产物用无水乙醇充分洗涤，40-60°C下真空干燥，即得所需材料。
2.根据权利要求1所述的一种磁性金属有机骨架复合材料的合成方法，其特征在于步骤(1)中六水合三氯化铁和醋酸钠的重量比为1.35:3.6。
3.—种如权利要求1所述的合成方法得到的磁性金属有机骨架复合材料在磷酸化肽富集与质谱鉴定中的应用。
4.根据权利要求3所述合成方法得到的磁性金属有机骨架复合材料在磷酸化肽富集与质谱鉴定中的应用，其特征在于:将产物磁性微球四氧化三铁表面包覆聚多巴胺和以锆离子为中心金属离子的金属有机骨架复合材料配成浓度为10 mg/mL的分散液，溶剂为超纯水，将该分散液和目标磷酸化肽溶液加入50%乙腈/0.1%三氟乙酸缓冲液中，混合，在酶解仪中孵育；通过外加磁场分离出磁性微球，用50%乙腈/0.1%三氟乙酸缓冲液洗涤，用.0.4M氨水洗脱；取I μ L洗脱液点在MALD1-TOF MS靶板上，自然干燥后再滴加0.8 μ L浓度为20 mg/mL的2，5-二羟基苯甲酸溶液于被分析物液滴上，形成薄基质层，干后进行质谱分析。
【文档编号】B01D15/10GK103894161SQ201410139869
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月9日 优先权日:2014年4月9日
【发明者】邓春晖, 赵曼 申请人:复旦大学