石墨烯基蛋白吸附海绵的制作方法

本发明涉及蛋白质化学和生物化学领域，具体的，本发明描述了用于蛋白质分离、吸附、纯化领域的海绵材料。

背景技术：

一般来说，分离纯化某一蛋白质首先要将蛋白质从原来的组织中释放出来，将杂质吸附去除，再根据需求采用适当的办法分离纯化。因为生物体液环境的复杂性很高，在实际工作中，很难用单一的方法实现蛋白质的分离纯化，往往要综合几种方法才能提纯出一种蛋白质，因此，蛋白质生物大分子的纯化分离过程十分繁琐，耗时很长。由于蛋白质纯化体系操作时间长，大规模纯化所需纯化系统体积巨大，工作条件不易控制，蛋白质经常失去活性；而且当前蛋白质分离纯化成本偏高，致使蛋白药物价格居高不下。因此，蛋白分离纯化技术成了蛋白质等多种生物药物的生产瓶颈；开发新型高效的蛋白质纯化方案成为当务之急。

目前，在医药品制造工序等工艺中，对蛋白质等有价值物质的吸附回收或者对杂质的吸附去除等操作是通过将被处理液通入多孔性凝胶颗粒作为吸附体来进行的。此类凝胶颗粒内部具有很多细孔，通过细孔增加比较面积，从来确保蛋白质的吸附容量。将在培养皿中的含有目的蛋白质和杂质的粗原料填充入上述多孔凝胶颗粒柱中，液体通过细孔时，通过细孔表面具有蛋白吸附能力的官能团来吸附目标蛋白，分离杂质。

但是，通常来讲凝胶颗粒阻力大，若粗原料液注入速度过快，凝胶颗粒的吸附无法完全进行，造成吸附容量的大幅降低。所以只能是原料液慢慢流动，而速度慢的后果直接导致整个实验过程耗时很长，难以满足工业生产需求。另外，凝胶颗粒其内部为多孔网状结构。一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外。洗脱时，大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小，小分子则在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大。即目前常规用的蛋白分离纯化载体单位质量的负载率较低，整个装置体积庞大，分离纯化时间长，而生物分子对温度等环境因素比较敏感，极易造成分离纯化过程中的蛋白分子变性。

石墨烯是由单层碳原子形成的二维平面型纳米材料，易于进行各种功能化，目前已经广泛应用于生物化学领域。本项目研究团队的前期研究结果发现：通过将石墨烯与多种金属或非金属纳米粒子（如金、铂、银、钯、金属氧化物、半导体纳米晶等）复合制作成水溶性的纳米复合物/杂化体，这种复合物/杂化体具有很高的疏水性及黏着性，可以像“万能胶水”一样快速、大量的吸附蛋白质，同时也表现了很好的水溶性和稳定性。同时，石墨烯比表面积大，可以大大减小分离装置的体积。但是由于操作上并未得到质的改善，操作方案依旧复杂。尤其是石墨烯载体在填充色谱柱之后，由于石墨烯的片层结构，容易造成层析柱堵塞。通过研究前期工作中所取得的结果和充实的文献资料的调研，发明人认为，通过合理修饰，完全可以设计一种全新的石墨烯海绵离子交换树脂，解决目前凝胶颗粒吸附量低、历程长的问题；为蛋白分离纯化开辟另一条道路。

因此本发明提出石墨烯海绵状载体的设计思路以及制造方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于石墨烯基海绵状蛋白吸附载体的设计制备，并将其应用于层析柱，请参考说明书附图1。本发明基于化学修饰的原理，在石墨烯或者氧化石墨烯基地上修饰离子交换官能团，构建石墨烯基蛋白吸附海绵。

即，本发明如下：

本发明的目的在于提供一种新型石墨烯基蛋白吸附海绵，该材料为三维海绵形态，可直接用于工业蛋白层析整体柱，改善目前层析柱出现的堵塞过滤网眼的问题。

所述的石墨烯基蛋白吸附海绵，具体以氧化石墨烯为载体；氧化石墨烯技术指标如下：单颗载体的尺寸为10纳米-100微米，片层厚度0.8 nm；含氧量> 30%。

上述所述的石墨烯基蛋白吸附海绵，其特征在于：需要对氧化石墨烯基地进行离子化修饰，该修饰过程可以在制备海绵之前，或制备海绵之后进行。修饰基团的种类分为强酸型(-SO3H)、弱酸型(-COOH)、强碱型(-NR3)、弱碱型(-NRH2, NR2H)等。

上述所述的石墨烯蛋白吸附海绵，所述石墨烯与离子官能团的结合方式可以为复合物，亦可以为杂化物。

上述所述的石墨烯蛋白吸附海绵，其制备方法包含以下步骤：

（1）氧化石墨烯基本载体的制备：氧化石墨烯采用Hummers法进行制备。方法如下：鳞片石墨（200目，5 g），KMnO4（22.5 g），KNO3（5 g），H2SO4（200 g）混合，室温搅拌5天，即可制得氧化石墨烯。加水（1L）稀释，过滤，稀硫酸（10L）洗涤，H2O（1L）洗涤，干燥即可。氧化石墨烯与阴凉干燥处保存。注：鳞片石墨的选择很重要，原则上选择2000目以下，这样制备的石墨烯泡沫机械强度更大；

（2）将步骤1得到的氧化石墨烯分散于水中，制备10mg/ml的氧化石墨烯水溶液，后用无水乙醇将溶液中的水完全置换出以制备相同浓度的氧化石墨烯乙醇溶液，并将溶液置于内衬有聚四氟乙烯的反应釜中与180℃作用24h。后再用水将反应后的乙醇置换出来，冷冻干燥后经350℃煅烧即可的石墨烯海绵；

（3）将步骤（2）得到的石墨烯海绵地进行离子化修饰，该修饰过程可以在制备海绵之前，或制备海绵之后进行。修饰基团的种类分为强酸型(-SO3H)、弱酸型(-COOH)、强碱型(-NR3)、弱碱型(-NRH2, NR2H)等；

（4）将步骤（3）得到的结合好的材料进行纯化、表征后即得到石墨烯基蛋白吸附海绵。

附图说明

图1. 本发明所述石墨烯蛋白吸附海绵的设计制备及应用流程图。

图2. 实施例样品外观图。其中A、B、C分别为煅烧后的石墨烯海绵、GS-0.2PEI1800、GS-0.2PEI-QAS。

图3. 实施例1样品拉曼光谱图。

图4. 石墨烯基蛋白吸附海绵SEM图谱 A为强酸型，B为强碱型。

图5. 实施例1酸碱滴定测试图。

图6. 实施例2酸碱滴定测试图。

图7. 石墨烯蛋白吸附海绵应用于层析柱示意图。

图8. 石墨烯基蛋白吸附海绵对离子功能化的靶标的俘获：其中1为细胞裂解液中蛋白，2为纯的石墨烯，3-8为连续增加功能化石墨烯海绵的量对纯化的影响。约200K位置的信号为目标导航蛋白蛋白，3、4中的蛋白质纯度在95%以上。

本发明优势

本发明利用石墨烯巨大的比表面积，且易于修饰的特点，将其与离子官能团合理复合组装，得到了一种蛋白吸附海绵。改蛋白吸附海绵具有以下优点。

该材料具备三维石墨烯海绵结构，具有很高的机械性能，防止局部团聚堵塞层析柱网眼；

该材料具有制备简单性质稳定的优点；且对环境友好；

该材料具体较高的比表面积，可以快速吸附大量蛋白，不仅可用于蛋白分离等试验研究和分析使用，还可直接用于工业蛋白层析整体柱，改善目前层析柱吸附量低、历程长的问题。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明做进一步的说明。

实施例1、一种强酸型石墨烯基蛋白吸附海绵（GO-PABS）的制备与表征：

本发明实施例包括以下部分，（1）石墨烯基蛋白吸附海绵的制备，（2）石墨烯基蛋白吸附海绵的结构与性能表征，（3）石墨烯基蛋白吸附海绵的层析柱填料应用。研究方法流程如说明书附图1所示。

1、强酸型石墨烯基蛋白吸附海绵的制备

本实施例制造方法主要包括氧化石墨烯多孔海绵结构制备和离子交换官能团制备。

（1）氧化石墨烯基本载体的制备：氧化石墨烯采用Hummers法进行制备。方法如下：鳞片石墨（200目，5 g），KMnO4（22.5 g），KNO3（5 g），H2SO4（200 g）混合，室温搅拌5天，即可制得氧化石墨烯。加水（1L）稀释，过滤，稀硫酸（10L）洗涤，H2O（1L）洗涤，干燥即可。氧化石墨烯与阴凉干燥处保存。注：鳞片石墨的选择很重要，原则上选择2000目以下，这样后续步骤（2）制备的石墨烯泡沫机械强度更大。

（2）将步骤1得到的氧化石墨烯分散于水中，制备10mg/ml的氧化石墨烯水溶液，后用无水乙醇将溶液中的水完全置换出以制备相同浓度的氧化石墨烯乙醇溶液，并将溶液置于内衬有聚四氟乙烯的反应釜中与180℃作用24h。后再用水将反应后的乙醇置换出来，冷冻干燥后经350℃煅烧即可的石墨烯泡沫。参考说明书附图2A。

石墨烯海绵制备的关键技术，制备适当浓度的石墨烯乙醇溶液，该过程使用离心机的转速在10000 r.p.m.以确保水完全被乙醇置换。反应用水置换出乙醇的过程尽量慢，过程大约需3-4天。

（3）对石墨烯的离子化修饰，可以对石墨烯在制备海绵之前，或制备海绵之后进行。强酸型修饰离子基团为-SO3H。修饰操作：在500mL圆底烧瓶中加入一定体积的0.1M HCl，然后加入一定质量的间氨基苯磺酸、一定量的苯胺和适量的过硫酸铵，于0-5℃反应24h可得粉红色的溶液，然后通过大量的丙酮洗涤沉淀，50℃下干燥的PABS。

使50mg的GS溶于入到200mL无水DMF中，超声分散均匀后置于500mL圆底烧瓶中，依次计入一定量的PyBOP、10mg PABS和DIEA，变频恒温摇床下反应24h。然后去除反应后的石墨烯泡沫，依次用DMF和去离子水分别洗涤3次，冻干即得GO-0.2PABS。请参考说明书附图2B。

2、强酸型石墨烯基蛋白吸附海绵（GO-PABS）的结构表征与性能测试

（1）结构表征：该蛋白吸附海绵的基本载体为氧化石墨烯，使用拉曼光谱仪（光谱分辨率 0.2nm；光谱扫描范围： 186～5000cm-1）测试粉体试剂；从拉曼光谱图上可以清晰看到石墨烯特征峰，如说明书附图3。

（2）结构表征：样品SEM图谱，见说明书附图4A。

（3）负载量性能测试：蛋白负载量可由对应的离子交换量可以推算得到，测试离子交换量采用常规的酸碱滴定的测试方法。

参考说明书附图5，,其中GO-PABS1是石墨烯基蛋白吸附海绵样品第一次滴加NaOH的曲线，下方会有很浅的颜色出现，GO-PABS2和GO-PABS3为后续循环滴定中，加NaOH对应的pH值变化曲线。

GO-0.2PABS的负载量计算如下：

滴定到中性的耗酸量 V=1150 μL

所用的标准酸浓度 C=0.1 M

GO-0.2PABS量 m=7.0 mg

负载量=13.143wt% SO3-/GO-PABS。

实施例2、一种强碱型石墨烯基蛋白吸附海绵（GO-PEI）的制备与应用。

1、强碱型石墨烯基蛋白吸附海绵的制备

本步骤与实施例1的制备相比，制备步骤步骤（1）、（2）完全相同；步骤（3）修饰基团采用-NR3。

（1）氧化石墨烯基本载体的制备：氧化石墨烯采用Hummers法进行制备。方法如下：鳞片石墨（200目，5 g），KMnO4（22.5 g），KNO3（5 g），H2SO4（200 g）混合，室温搅拌5天，即可制得氧化石墨烯。加水（1L）稀释，过滤，稀硫酸（10L）洗涤，H2O（1L）洗涤，干燥即可。氧化石墨烯与阴凉干燥处保存。注：鳞片石墨的选择很重要，原则上选择2000目以下，这样制备的石墨烯泡沫机械强度更大。

（2）将步骤1得到的氧化石墨烯分散于水中，制备10mg/ml的氧化石墨烯水溶液，后用无水乙醇将溶液中的水完全置换出以制备相同浓度的氧化石墨烯乙醇溶液，并将溶液置于内衬有聚四氟乙烯的反应釜中与180℃作用24h。后再用水将反应后的乙醇置换出来，冷冻干燥后经350℃煅烧即可的石墨烯泡沫。

（3）取50mg的未经煅烧的石墨烯海绵加入到100mL无水DMF中，超声分散均匀后置于250mL 的圆底烧瓶中，依次计入一定量的50mg PyBOP、50mg聚乙酰亚胺和10mg DIEA，变频恒温摇床下反应24个小时。然后离心依次用DMF和去离子水分别洗涤数次，冻干即得GO -0.1PEI。

2、强碱型石墨烯基蛋白吸附海绵（GO-0.1PEI）的结构表征与性能测试

（1）结构表征：本实施例表征方法与实施例1中表征方法一致，请参考附图4B。

（2）性能测试，依然采用酸碱滴定方法。测试曲线参考说明书附图6。

GO-0.2PEI负载量计算：

滴定到中性的耗酸量 V=1000 μL

所用的标准碱浓度 C=0.1 M

GO-PEI量 m=7.0mg

计算得负载量=2.29wt% NH2/GO-PEI-1800。

3、石墨烯基蛋白吸附海绵的层析柱填料应用

将上述测试完成的石墨烯基蛋白吸附海绵进行形状加工，作为层析柱填料制备小型试验用蛋白纯化层析柱。选用干法装柱，直接往柱子里填入海绵；然后再轻轻敲打柱子两侧，至填料界面不再下降为止，然后再填入填料至合适高度，最后再用油泵直接抽，这样就会使得柱子装的很结实。详情参考说明书附图7。

本实施例装柱孔径为12mm，长度59mm。装柱后非加压状态下测试液体流动性达到20 ml/ml。目前已经测试了该蛋白吸附层析柱神经细胞中导航蛋白的吸附纯化，测试结果表明其纯度高于95%，如图8所示。附图8石墨烯基蛋白吸附海绵对离子功能化的靶标的俘获：其中1为细胞裂解液中蛋白，2为纯的石墨烯，3-8为连续增加功能化石墨烯海绵的量对纯化的影响。约200K位置的信号为目标导航蛋白蛋白。从信号颜色深度计算得知，3、4中的蛋白质纯度在95%以上。

产业上的可利用性

本发明的石墨烯基蛋白吸附海绵可用于层析柱填料，或者蛋白分离纯化整体柱，因此可用作各个领域中的目标物质的分离纯化用填充剂。本发明实施例仅是优选的试验用层析柱，相关领域技术人员还可以依据本发明技术方案做其它变化，依据本发明技术方案所做的变化，都应包含在本技术方案所保护的范围之内。