一种用于唾液DNA离心预处理的试管及方法与流程

本发明属于基因检测技术领域，具体是涉及一种用于唾液DNA离心预处理的试管及方法。

背景技术：

理论上DNA可以从身体的任何细胞中获取。人类口腔黏膜的上皮为复层鳞状上皮，具有代谢旺盛、更新快、易脱落的特点。它由多层细胞组成，基底层具有旺盛分裂能力，最表层的角化层已衰老退化，不断脱落。角化层细胞可以自然脱落到唾液中，也在外力作用下剥落到载体上。这些脱落口腔细胞虽然细胞核固缩，但同样具有完整人类的基因组DNA序列。有报道表明，利用分别来自口腔粘膜上皮细胞与外周血的DNA进行PCR反应，结果显示二者结果完全一致。因此唾液可以代替血液成为基因组DNA的简易来源。

传统的方法把唾液添加稳定剂后放进试管里存在两大明显的缺陷：(1)试管易破碎，占用体积大；(2)液体物质不方便运输，不能带上飞机。针对这两个缺陷，通过试纸采样的技术也发展起来了，最有代表性的是美国通用公司的FTA试纸。但该试纸至少也有两个局限性：(1)价格昂贵，一片试纸超过10美元；(2)试纸能采集的唾液样本非常有限。一般做基因检测需要的2毫升的唾液根本不能放进一张比名片还小的试纸里。同样现有的冷冻干燥技术需要庞大和昂贵的设备，成本较高，操作复杂。

技术实现要素：

为了解决以上问题，本发明提供了以下技术方案：

一种用于唾液DNA离心预处理的试管，包括：试管本体和试管盖；

所述试管本体为圆筒形，且所述试管本体在其底部设有环绕底部圆周的凸起或者在其下部设有环绕管壁的凸起，用于离心时将试管本体倒挂在离心机试管孔的四周，所述试管本体在管口处具有密封连接机构；

所述试管盖包括密封连接部，所述密封连接部与所述密封连接机构二者能够相互配合从而密封连接，使得所述试管本体的管口朝下进行离心处理时，离心后得到的含有唾液DNA的细胞沉淀在所述试管盖中。

所述试管还包括密封盖，所述密封盖包括密封连接结构，所述密封连接结构与所述密封连接部二者能够相互配合从而密封连接，由此将试管盖密封，用于储存离心后得到的所述含有唾液DNA的细胞。

所述密封连接机构为一条环形卡槽，所述环形卡槽设置于试管本体上部的内壁，所述密封连接部为与所述环形卡槽相适配的卡环，所述卡环设置在试管盖边沿外侧。

所述试管盖为圆锥形。

所述环形卡槽由上限位环形台阶和下限位环形台阶组成，所述上限位环形台阶剖面为倒钩形，所述下限位环形台阶剖面为倒三角形，使试管本体内壁形成锥形坡面，试管本体内径由下向上沿锥形坡面逐渐减小，用于离心过程中，防止沉淀物卡在试管盖与试管本体的连接处，而使沉淀物质能顺利滑入试管盖中。

所述密封连接结构包括上限位环形台阶，所述上限位环形台阶设置在密封盖的内壁，与底部形成环形凹槽，该环形凹槽与试管盖密封连接部相适配。

所述密封连接机构为内螺纹结构，所述螺纹结构设置于试管本体上端的内壁，所述密封连接部包括与所述内螺纹结构相适配的外螺纹结构，所述外螺纹结构设置于试管盖的上部外侧。

所述试管盖为一个底部为圆锥形、上部为圆筒形的结构。

所述密封连接机构还包括下限位环形台阶，所述下限位环形台阶位于试管本体内螺纹结构的下方，所述下限位环形台阶剖面为倒三角形，使试管本体内壁形成锥形坡面，试管本体内径由下向上沿锥形坡面逐渐减小，用于离心过程中，沉淀物质能顺利滑入试管盖，而防止沉淀物卡在试管盖与试管本体的连接处。

所述密封连接部还包括设置于试管盖上部外侧的挡边，该挡边位于外螺纹结构的下方，所述挡边外径大于圆筒的内径，用于试管盖密封试管本体时，限定试管盖旋入试管本体的深度。

所述密封连接结构为与试管盖密封连接机构相适配的内螺纹，设置在密封盖上部的内壁。

一种利用所述试管进行唾液DNA离心预处理的方法，包括：将唾液加入所述试管的试管本体中，用试管盖密封试管本体，然后试管本体的管口朝下，进行离心处理。

进一步的，在离心之后，取所述试管盖及其中的沉淀物质，然后利用密封盖进行密封，用于保存运输。

有益效果：本发明通过试管本体和试管盖把唾液DNA浓缩成很小体积的半固体状态，并保存到试管盖中；通过密封盖与试管盖的结合用于存储含有DNA的半固体状态细胞，携带体积小，极大的方便了唾液样本的保存和室温下运输，且简单经济，同时没有影响DNA质量。

附图说明

图1为本发明用于唾液DNA离心预处理的试管的卡槽密封整体结构图；

图2为本发明的试管本体与试管盖卡槽密封结构图；

图3为本发明的密封盖与试管盖卡槽密封结构图；

图4为本发明用于唾液DNA离心预处理的试管的螺纹密封整体结构图；

图5为本发明的试管本体与试管盖螺纹密封结构图；

图6为本发明的试管盖与密封盖螺纹密封结构图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

参照图1、2和3，一种用于唾液DNA离心预处理的试管运输的试管，包括：试管本体01、试管盖02和密封盖03；

试管本体01为圆筒形，容量根据需要离心的唾液体积进行选择，例如可以为2-5ml，可采用透明高分子材料制成，如聚丙烯、聚碳酸酯等。在其底部设有环绕底部圆周的凸起04，用于离心时将试管本体01倒挂在离心机试管孔的四周，试管本体01上部的内壁设有一条环形卡槽05，所述环形卡槽05由上限位环形台阶06和下限位环形台阶07组成，所述上限位环形台阶06剖面为倒钩形，所述下限位环形台阶07剖面为倒三角形，使试管本体01内壁形成锥形坡面，试管本体01内径由下向上沿锥形坡面逐渐减小，用于离心过程中，防止沉淀物卡在试管盖02与试管本体01的连接处，而使沉淀物质能顺利滑入试管盖02中。

试管盖02与试管本体01相配合，用于唾液的离心。试管盖02为圆锥形，容量根据需要离心的唾液体积进行选择，例如可以为0.5-2ml，可采用透明高分子材料制成，如聚丙烯、聚碳酸酯等。试管盖02边沿外侧设有凸起形成卡环08，与试管本体01中环形卡槽05相适配从而将试管本体01密封，使得试管本体01的管口朝下进行离心处理时，离心后得到的含有唾液DNA的细胞沉淀在试管盖02中。

密封盖03与试管盖02相配合，用于储存唾液离心后得到的含有唾液DNA的细胞。密封盖03为圆筒形，可采用透明高分子材料制成，如聚丙烯、聚碳酸酯等。密封盖03内壁设有上限位环形台阶06，与底部形成环形凹槽09，该环形凹槽09与试管盖02的卡环08相适配，用于密封试管盖02。

参照图4、5和6，一种用于唾液DNA离心预处理的试管运输的试管，包括：试管本体01、试管盖10和密封盖03；

试管本体01为圆筒形，容量根据需要离心的唾液体积进行选择，例如可以为5ml，可采用透明高分子材料制成，如聚丙烯、聚碳酸酯等。环绕试管本体01底部圆周设有一圈凸起，用于离心时将试管本体01倒挂在离心机试管孔的四周；试管本体01上端的内壁设置有内螺纹结构13，内螺纹结构13下方设有下限位环形台阶07，所述下限位环形台阶07剖面为倒三角形，使试管本体01内壁形成锥形坡面，试管本体01内径由下向上沿锥形坡面逐渐减小，用于离心过程中，沉淀物质能顺利滑入试管盖10，而防止沉淀物卡在试管盖10与试管本体01的连接处。

试管盖10与试管本体01相配合，通过螺纹密封连接，用于唾液的离心。试管盖10为一个底部为圆锥形、上部为圆筒形的结构，容量根据需要离心的唾液体积进行选择，例如可以为0.5-2ml，采用透明高分子材料制成，如聚丙烯、聚碳酸酯等。试管盖10圆筒形上部的外壁设置有与试管本体01内螺纹结构13相适配的外螺纹结构12，圆筒形上部外壁还设有一圈挡边12，该挡边12位于外螺纹结构12的下方，挡边12外径大于圆筒的内径，用于试管盖10密封试管本体01时，限定试管盖10旋入试管本体01的深度。

密封盖03与试管盖10相配合通过螺纹密封连接，用于储存唾液离心后的沉淀物质。密封盖03为圆筒形，可以根据具体情况进行选择，采用透明高分子材料制成，如聚丙烯、聚碳酸酯等。所述密封盖03上部的内壁设有与试管盖10上部的外螺纹结构12相适配的内螺纹14。

一种利用所述试管进行唾液DNA离心预处理的方法：

(1)将唾液加入试管本体中，再加入适量磷酸缓冲盐溶液或无菌水，用移液枪吹打混匀后，用试管盖密封，试管本体的管口朝下，倒挂在离心机试管孔的四周，在离心机中离心，其中磷酸缓冲盐溶液或无菌水的加入量根据需要离心的唾液体积进行选择；

(2)离心后，丢弃试管本体及其中的液体，并取出试管盖中的上清液，保留试管盖及其中的沉淀物质，滴入DNA稳定剂，盖上密封盖后，室温下存放，其中DNA稳定剂的加入量根据需要离心的唾液体积进行选择。

同时，使用本发明收集和存放的唾液DNA的质量与传统方法相比没有受到影响，具体评价方法如下：

一、通过三种不同的方法来收集和存放DNA。在收集唾液之前，让志愿者用水漱口，以确保口腔没有异物和食物，并且确保收集前30分钟没有进食。

(1)使用Oragene试管(DNA Genotek制造，型号OGD-500)：取2毫升唾液加入Oragene试管中，并加入稳定剂混合，室温下存放；

(2)使用本发明试管(试管本体容量为3ml，试管盖容量为0.5ml，试管整体采用聚丙烯材料制成，试管本体和试管盖及试管盖和密封盖之间通过螺纹密封)：取2毫升唾液，加500μL的磷酸缓冲盐溶液，用移液枪吹打混匀后，开始离心，室温下相对离心力为8000g，离心5分钟。离心后，丢弃试管本体01及其中的液体，并取出试管盖02中的上清液，保留试管盖02及其中的沉淀物质，滴入0.2mlDNA稳定剂，盖上密封盖03后，室温下存放；

(3)冰柜冷冻干燥：取2毫升唾液，存放到-20℃冰柜。

二、七天后对上述三种方法得到的样品分别进行DNA提纯，具体步骤如下：

(1)细胞裂解：加入500μL细胞裂解液，用移液枪吹打使沉淀重新悬浮，室温放置30min，期间颠倒数次；

(2)RNA去除：加入10μL浓度为10mg/mL的RNaseA(核糖核酸酶A)溶液，37℃下育温15分钟；

(3)蛋白质和脂类的去除：加入500μL体积比为24:1的氯仿/异戊醇混合液，颠倒离心管5-10次，然后放入离心机中离心10min，离心机转速为10000rpm，离心后取上清，注意小心不要吸到下面的有机溶剂层，重复上述步骤；

(4)分离和纯化gDNA(基因组DNA)：加入等体积预冷(-20℃)的异丙醇，颠倒混匀，于-20℃静置至少30min；取出离心管，于4℃下12000rpm离心5min，离心后弃上清；然后加入500μL 70％乙醇清洗沉淀两次，弃上清，倒置风干；

(5)溶解基因组gDNA：样品干燥后，加入20μL的TE缓冲液(或者无菌水，看后续具体需要)，使gDNA沉淀溶解，所述TE缓冲液由Tris和EDTA配置而成；然后以中等速度漩涡振荡5秒，并65℃水浴一小时；从水浴锅取出，室温静置过夜。

三、DNA质量的评价：

使用NanoDrop1000(Thermo公司)超微量分光光度计检测260/280比值(正常值1.7-1.9之间)、260/230比值和核酸浓度，即通过对比DNA纯度和浓度对上述三种方法得到的DNA质量进行评价，表1为三种不同方法得到的DNA浓度和纯度。

参照表1，使用本发明收集并在常温下保存的唾液DNA，与传统方法如采用Oragene试管保存唾液样本或冰冻的方法相比，特制试管所得到的DNA纯度和浓度没有显著差异。

表1

本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的装置及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。