氟表面活性剂及其制备方法和应用与流程

本发明涉及高分子表面活性剂技术领域，特别是涉及一种氟表面活性剂及其制备方法和应用。

背景技术：

微滴式数字PCR系统在传统的PCR扩增前对样品进行微滴化处理。在微流控芯片中利用油包水的原理，将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微滴，其中每个微滴含或不舍待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。在经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行检测，利用泊松分布对荧光信号进行处理。

而表面活性剂通过降低油水界面张力，可以避免液滴发生融合，甚至可以在加热加压条件下保持液滴系统的稳定，稳定的液滴可以使液滴内部成为一个反应仓，利于将DNA模板细分成单一进行扩展。目前报道有全氟聚醚酯化物，全氟聚醚酰胺化物等非离子型氟表面活性剂。

微滴式数字PCR系统作为21世纪科研含量极高，备受生物医疗界关注的一项技术，现阶段仅有Bio-Rad及RainDance外国品牌具备相关成熟产品，因此市面上数字PCR仪器所需生成油，包括探针法及染料法，几乎全部都来源于以上厂家。

现有的氟表面活性剂中非离子型产品以聚氧乙烯链为亲水基团的类型为主。从专利文献可知该类活性剂制备工艺非常复杂，一般制作步骤在两步以上且中间产物市面上并无销售，因此导致该液滴生成所需的耗材价格高昂，满足不了更广阔的市场。

杜克大学的Ya-Ling Chui等在ACS NANO期刊中提到，可将含氟聚醚羧酸与二氯亚砜反应生成酰氯完成第一步之后，接着溶解于三氟甲苯与HFE-7100混合液中，再加入三(羟甲基)氨基甲烷在惰性气体保护下进行反应生成含氟聚醚羧酸酰胺。但反应过程中间产物酰氯非常容易与水发生反应，导致后续步骤效果不佳甚至产物报废。

技术实现要素：

基于此，有必要针对上述问题，提供一种氟表面活性剂，该氟表面活性剂具有制备简单，性能优越的特点。

具有式I所示结构特征的氟表面活性剂：

所述氟表面活性剂的平均分子量为4000-9000。

上述氟表面活性剂可作为PCR探针法油相使用，实现在液滴式数字PCR上应用，且液滴稳定性可以得到保证，该氟表面活性剂具有优越的表面性能。

在其中一个实施例中，所述氟表面活性剂的平均分子量为6000-9000。

本法明还公开了上述的氟表面活性剂的制备方法，包括如下反应步骤：

在其中一个实施例中，以4-二甲氨基吡啶作为上述反应的催化剂。以4-二甲氨基吡啶作为催化剂，对反应物实现酰化，其具有较高的催化能力，对提高收率有极其明显的效果。

在其中一个实施例中，所述反应的具体条件为：在惰性气体保护下，将式II的全氟聚醚、式III的三羟甲基氨基甲烷与4-二甲氨基吡啶溶于反应溶剂中，在60℃-120℃的范围下搅拌反应12hr-36hr，回收溶剂，即得；所述反应溶剂为氟油。反应温度优选80℃-100℃。控制反应按照上述条件进行，能够减少副反应的发生，提高产物得率。

在其中一个实施例中，所述反应溶剂还包括极性有机溶剂，所述极性有机溶剂选自：三氟甲苯、二甲基甲酰胺、四氢呋喃和二甲基亚砜中的至少一种。优选三氟甲苯。将极性有机溶剂和氟油混合作为反应溶剂使用，能够提高最终得到产物的纯度。进一步优选的，所述氟油与所述极性有机溶剂的体积此为1.2-2.0。

在其中一个实施例中，所述氟油为甲氧基-九氟代丁烷。以甲氧基-九氟代丁烷作为反应溶剂，具有溶解性好，易控的优点。

在其中一个实施例中，上述制备方法还包括纯化步骤，所述纯化步骤中，将反应步骤得到的产物再次加入氟油溶解，然后滴加二氯甲烷，使产物中的式I化合物析出，干燥后即得所述氟表面活性剂。通过上述纯化步骤，可以大幅度提高产物纯度。

本发明还公开了上述的氟表面活性剂在PCR扩增的微滴化处理过程中的应用。将上述氟表面活性剂应用于液滴式数字PCR中，作为PCR探针法油相使用，能够降低液滴表面张力，提高微滴稳定性。

本发明还公开了上一种液滴生成油，包括上述的氟表面活性剂作为溶质的氟油溶液，所述氟表面活性剂的质量百分浓度为1.5％-2.5％。

上述液滴生成油能够保证液滴的稳定性，具有较好的效果。

在其中一个实施例中，作为液滴生成油使用的氟油型号为HFE-7500。

与现有技术相此，本发明具有以下有益效果：

本发明的氟表面活性剂，可作为PCR探针法油相使用，实现在液滴式数字PCR上应用，且液滴稳定性可以得到保证。

本发明的氟表面活性剂的制备方法，为创新的一步法制备工艺，具有工艺简单，成本低廉的优点。

选用上述方法制备的氟表面活性剂制备液滴生成油，具有成本低，稳定性好的特点。

附图说明

图1为实施例1中反应原料与产物红外光谱对此图。

其中：实线表示产物PFPE-Tris红外光谱，虚线表示原料PFPE-COOH红外光谱。

图2为实施例1中产物PFPE-Tris氟谱图。

图3为实施例2中产物PFPE-Tris氢谱图。

图4为实施例3中液滴生成后及时取样显微镜下观察图，图中图例长度为200μm。

图5为实施例3中液滴生成静置7天后取样显微镜下观察图，图中图例长度为200μm。

图6为实施例3中液滴生成后及时取样显微镜下观察图，图中图例长度为100μm。

图7为实施例3中液滴生成静置7天后取样显微镜下观察图，图中图例长度为100μm。

图8为实施例3中微流控芯片生成均一的油包水液滴示意图。

图9为实施例3中PCR扩增热循环前显微镜下观察图，图中图例长度为200μm。

图10为实施例3中PCR扩增热循环后显微镜下观察图，图中图例长度为200μm。

图11为图10虚线框放大视野图，图中图例长度为100μm。

图12为图11在汞灯环境下调整曝光率后液滴荧光示意图。

图13为液滴进行荧光信号采集波形图。

图14为图13经滤波处理后的波形图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

以下实施例中所用原料均为市售购得。

实施例1

一种氟表面活性剂，通过以下方法制备得到：

一、反应。

按照如下反应线路进行：

所述反应的具体条件为：在惰性气体保护下，将式II的全氟聚醚(购自杜邦，型号为FSH157，该全氟聚醚的平均分子量为7000-7500)、式III的三羟甲基氨基甲烷(tris)与4-二甲氨基吡啶溶(DMAP)于氟油(购自杜邦，型号为HFE-7100)与三氟甲苯的混合反应溶剂中，所述HFE-7100与所述三氟甲苯的体积此为1.6，在80℃-100℃的范围下搅拌反应24hr，抽滤后旋干溶剂。

二、纯化。

将步骤一得到的产物再次加入HFE-7100溶解，滴加二氯甲烷清洗将最终产物析出并进行旋蒸，然后真空干燥12小时后得到白色透明油状物的最终产物，即得式I的氟表面活性剂(PFPE-Tris)。

三、验证。

将上述PFPE-Tris进行红外图谱及核磁图谱(氟谱、氢谱)检测核实。

从图谱中可以看出，如图1所示，在红外图谱中可以清晰观察到在1675cm-1位置上有明显的产物酰胺C＝O特征吸收峰。如图2所示，氟谱中虚线图框内即化学位移在-83～-74范围的一系列共振峰可以核实是PFPE该成分；此外氢谱中化学位移3.5～5范围中的两个单峰的积分面积此值约为3∶4，可以证实为Tris结构，即验证所得产物即为式I的PFPE-Tris。

实施例2

一种液滴生成油，将实施例1制备得到的氟表面活性剂按质量百分浓度2％的量溶于HFE-7500氟油(购自杜邦，型号为HFE-7500)中，即得。

实施例3

利用实施例2的液滴生成油进行液滴生成实验。

一、静置稳定性测试。

对实施例2的液滴生成油进行了液滴静置稳定性的测试，使用生成后立即取样的液滴与放置7天后的液滴进行对比，如图4-7所示，在显微镜可以观察到两者几乎没有区别，液滴照样能呈现蜂巢式均一性排布，可以说明该油相所制液滴具备优秀的静置稳定性能。

二、液滴式数字PCR测试。

对实施例2的液滴生成油进行液滴式数字PCR测试。具体为：以Hotstart master mix配合引物、探针及DNA模板作为水相，如图8所示，在微流控芯片中生成均一的油包水液滴，进行PCR扩增热循环。

PCR扩增热循环前显微镜下观察到液滴形态如图9所示，PCR扩增热循环后显微镜下观察到液滴形态如图10所示。在显微镜下观察到，液滴经30至50圈热循环后，其均一性状态依然保持良好，仍然呈现规律的蜂窝形貌，破损及融合液滴的存在率(CV值)远低于5％。

将图10中虚线框的局部放大，得到图11的局部视图。在汞灯环境下调整曝光率，清晰观察到，扩增后呈阳性的液滴荧光强度相对其他阴性液滴更加明亮，如图12所示，该图12为图11相同视野图。

再对液滴荧光强度进行定量分析，利用光机模块对每个通过的液滴进行荧光信号采集并进行滤波处理，如图13-14所示，在随机一段采集片段中可以清晰看到，几个阳性峰的峰值强度是众多阴性峰值的4倍左右，符合显微镜观察结果。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。