官能化纳米膜及其制备方法和用途与流程

本发明涉及官能化纳米膜、该官能化纳米膜的制备方法及其用途。

背景技术：

透射电镜术(tem)是用于分子和分子聚集体的结构表征，尤其是用于结构生物学的有力方法。为了通过tem确定样品的结构，将其沉积在足够薄的使电子透明的膜上。负染色的生物样品的tem被广泛用于筛选样品以及获取初步信息。为使生物样品在电子束的辐射损害中保持稳定，往往在低温下(冷冻tem)将它们包埋在非常薄的玻璃冰薄膜中。

传统的无定形碳膜经常被用作玻璃化的样品的冷冻tem的支持膜，其厚度为10-15nm。更薄的碳膜机械性能不稳定。更糟糕的是，该无定形碳膜的导电性随着温度的下降而下降。这对在液态氮或液态氦的温度下研究样品的冷冻tem来说尤其重要，以致薄的碳膜变得完全电绝缘。由于这些不良的电子和机械性能，在这些温度下的样品图像遭受到非弹性散射、静电充电和光束引起的运动的损害，严重限制了可达到的分辨率(r.henderson,ultramicroscopy1992,46,1)。尽管已开发出直接电子探测器，以实现对光束引起的运动的校正，但样品仍然是最关键的部分。

另外，在常规的支持膜上的样品沉淀是相对没有选择性地进行的，因此，在研究前，必须对样品进行富集/纯化。对于蛋白质和蛋白质复合物的情况，样品的富集/纯化常常因为低表达率以及纯化足够量的用于冷冻tem的材料存在困难而受阻。如果在样品制备中必须使用洗涤剂，例如在溶解膜蛋白的单粒子冷冻tem中就存在这种情况，洗涤剂可导致蛋白膜由于减小的表面张力而从有孔的碳膜的孔上脱离，该事实使问题更为严重。

除无定形碳以外的一些新的最先进的支持膜材料在现有技术的领域中已被知晓。其中，原始石墨烯和石墨烯氧化层已被尝试作为无机和生物样品的tem的支持膜材料(j.c.meyeretal.,nature2008,454,319；r.s.pantelicetal.,j.struct.biol.2011,174,234；r.s.pantelicetal.,solidstatecommun.2012,152,1375；r.s.pantelicetal.,j.struct.biol.2010,170,152)。而石墨烯氧化层为亲水的，因此比原始石墨烯更有利于含水生物样品的制备，但是，石墨烯氧化层仅表现出非常低的导电性，尤其在低温下。另一方面，原始石墨烯非常疏水，阻碍了其作为冰包埋生物样品的冷冻tem的支持膜的用途以及其化学官能化。

另外一个严重的问题是蛋白质与支持膜的非特异性结合。抑制这种非特异性结合的非常确定的方法是形成例如由低聚乙二醇(oeg)单元组成的生物排斥性的水凝胶层。这些单元可以通过不同的接枝策略被附着在表面上。在目前的研究工作中，薄的碳纳米膜已被蛋白排斥性的聚乙二醇层官能化了(n.etal.,acsappl.mat.interf.2013,5,5129)。

为选择性地将样品结合在这种生物排斥性层上，可以引入选择性分子标记。为此，通常使用具有氨基或者羧酸基团的oeg分子来进一步官能化水凝胶表面。

通过选择性分子标记使样品与tem支持膜选择性结合的尝试仅有少数。目前，蛋白质已被结合在脂质层、用亲和基团官能化的2d蛋白晶体或者抗体，这些脂质层、用亲和基团官能化的2d蛋白晶体或者抗体又被物理吸附到常规的碳支持膜上(d.f.kellyetal.,j.mol.biol.2008,382,423；g.sharmaetal.,j.struct.biol.2013,181,190；b.g.hanetal.,j.struct.biol.2012,180,249；y.guimeietal.,j.struct.biol.2014,187,1)。这种方法的缺点在于：脂质层和2d蛋白晶体对洗涤剂的敏感性使它们与例如洗涤剂-溶解膜蛋白的结构分析不相容。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供官能化纳米膜，克服现有技术中，尤其是目前的生物tem的支持膜中的缺陷。特别地，本发明还将提供可被用作新型支持膜的官能化纳米膜，促进和加快通过tem对生物样品的高分辨率的结构分析，并能够从原始混合物中直接和选择性地分离标记的生物分子，从而使样品可以通过负染色tem进行研究或者直接通过冷冻tem进行玻璃化和研究。

进一步，本发明还将提供可释放冷冻tem的全部潜力的官能化纳米膜，这意味着将提供超薄和高度均匀的官能化纳米膜，其尽量减小了测量过程中电子的非弹性散射，具有导电性，并具有用于选择性结合生物分子样品以简化样品制备的特异性生物识别位点。

本发明的另一个目的在于提供一种制备官能化纳米膜的制备方法。

本发明的第一个目的通过官能化纳米膜实现。该官能化纳米膜包括：

a)包括纳米材料的第一层；

b)包括生物排斥性材料的第二层，该第二层被附着在该第一层的至少一个面上；以及

c)亲和基团，其附着在该第二层。

此处所使用的术语“生物排斥性材料”意味着排斥生物分子，如氨基酸、脂质、碳水化合物、蛋白质、多糖和/或核酸，的材料或化合物。

在本申请中，术语“官能化”应被理解为纳米材料、生物排斥性材料和/或亲和基团各自的功能基团之间的化学键，如共价键、配位键、氢键、离子或分散(范德华)键的形成，优选为共价键的形成。

术语“亲和基团”意思是与特定的样品选择性地结合的分子残基或化学基团。这种特定的(生物)识别动机可导致官能化纳米膜和各样品之间更高程度的亲和力。

优选地，该第一层由纳米材料组成。

优选地，该纳米材料用作机械支持。

更优选地，该纳米材料为纳米膜。

优选地，该第一层的纳米材料选自碳纳米膜、石墨烯、石墨烯氧化物、无定形碳膜和硅纳米膜、氮化硅或二氧化硅。

本发明中，“碳纳米膜”由厚度小于100nm，优选为小于10nm，并优选为从有机前体所形成的纳米膜组成。该有机前体优选为包括低分子芳香族化合物，如苯基、联苯、三联苯、萘、蒽、联吡啶、三联吡啶、噻吩、二噻吩、三联噻吩、吡咯及其组合。该有机前体优选为具有如羟基、氨基或酯基的端基，表现为可能发生碳纳米膜被生物排斥性材料官能化的官能团。优选地，“碳纳米膜”是通过交联作用从该有机前体的自组装单层(sams)形成的纳米膜。

本申请中，作为“硅，氮化硅或二氧化硅的纳米膜”，优选使用市售的，例如由simpore生产的膜作为tem的支持材料。这些膜具有反应性si-oh基团，在其上可能发生生物排斥性材料的共价结合。

优选地，该无定形碳膜的厚度范围为3-30nm，优选为5-15nm。

更优选为，硅、氮化硅和氧化硅的纳米膜的厚度范围为1-15nm，优选为4-6nm，更优选为5nm左右。

进一步，碳纳米膜的厚度范围优选为0.5-4nm，更优选为0.6-3nm.

在一优选实施例中，官能化碳纳米膜的厚度范围为3-25nm，更优选为3-10nm。

更优选地，该官能化纳米膜材料在厚度和组成上是高度均匀的。

在一优选实施例中，该官能化纳米膜为无支撑式的纳米膜。

优选地，该包含在第二层的生物排斥性材料至少部分设置在第二层的表面，优选地大致组成第二层的外表面，也就是说，朝向第一层和第二层的交界面的表面。更为优选地，第二层为大致由生物排斥性材料组成。

更优选地，该生物排斥性材料由聚甘油(pg)、聚乙二醇(peg)、低聚乙二醇(oeg)、肽、蛋白质、低聚碳水化合物或两性离子聚合物组成。

更优选地，该亲和基团为选自特异性识别对，优选为螯合物/寡聚组氨酸、生物素/(链霉)亲和素、或特异性dna/rna有义/反义对中的一种。

根据本发明，“特异识别对”由两个分子基序组成，它们可以在包含几种分子种类的竞争环境中区分并彼此结合。该亲和基团仅由一个分子种类，如每个特定识别对的一个分子基序，组成。

根据本发明，“螯合物”为非常稳定的复合物，由多齿配体组成，优选为乙二胺四乙酸(edta)、n-氨三乙酸(nta)、或者其衍生物和阳离子，如cu²⁺、ni²⁺、fe³⁺以及co²⁺，优选为ni²⁺。

本发明的第二个目的通过一种制备创造性的官能化纳米膜的方法实现，该方法包括以下步骤：

a)提供包括纳米材料的第一层；

b)用生物排斥性材料使该第一层官能化，获得包括该生物排斥性材料的第二层；以及

c)用亲和基团使该第二层官能化。

优选地，步骤b)中的官能化通过接枝工艺进行。

更优选为，步骤c)中的官能化通过烷化、酰化或者环氧化合物开环作用进行。

优选地，由该纳米材料组成的该第一层是被支持在tem网格上的纳米材料。

本发明的第三个目的通过以下手段实现：将创造性的官能化纳米膜作为支持膜，优选作为在tem中的支持膜，更优选作为在冷冻tem中的支持膜，用于生物分子的结构分析。

更优选地，该官能化纳米膜被支持在tem网格上。

优选地，本发明可使用现有技术中已知的tem网格，但更优选的，使用纯tem网格或者具有多孔碳的分层的tem网格或者具有多孔金的tem网格。

意外地，已发现该新型的超薄官能化纳米膜可被作为用于生物分子的结构分析的tem支持膜，并进一步解决有关现有技术中已知的tem样品制备的问题。其中，该超薄以及高度均匀的官能化纳米膜减小了测量过程中的电子的非弹性散射，从而改进了数据收集。该官能化纳米膜的用途允许标记的生物分子直接从原始混合物中分离。因此，该样品可直接通过冷冻tem被玻璃化和研究。该创造性的官能化纳米膜通过可与标记的生物分子特异性结合的亲和基团实现自我区分。另外，该生物排斥性中间层防止了原混合物中不需要的成份与膜的非特异性结合。进一步地，该创造性的纳米膜可在无支撑状态也可被支撑在tem网格上使用。该新型的工程支持膜作为无支撑的纳米膜具有机械稳定性，从而使玻璃化样品稳定。

附图说明

现通过附图和详细描述对本发明做进一步说明，可从中获取进一步的特征和优点。应当注意，以下阐述仅出于说明和描述的目的，而并非旨在穷举或者将本发明限定在所公开的精确形式中。

图1示意性地说明了设置在支持膜上的碳纳米层的化学纳米光刻；

图2显示了(a)具有pg作为生物排斥性材料以及edta衍生物作为亲和基团的官能化碳纳米膜、(b)x-射线光电子能谱(xps)、以及(c)无支撑的官能化碳纳米膜的低分辨率氦离子显微镜(him)图像。

图3显示了使用官能化碳纳米膜用于从细胞裂解物中原位分离/隔离合适标记的生物分子的示意图。

图4为负染色的组氨酸标记(his-tag)的生物分子特异性结合在pg和edta官能化的碳纳米膜上的tem图像。

图5显示为(a)转移至石墨烯片的碳纳米膜(cnm)以及(b)官能化cnm通过石墨烯条纹图案化。

图6显示在安装于网格上的官能化无定形碳膜上的负染色的组氨酸标记的p.furiosus(嗜热古细菌)的热聚体的tem图像。

具体实施方式

图1显示为设置在支持材料上的cnm通过电子辐射或者极端uv(euv)光的化学纳米光刻。芳族的自组装单层(sam)的电子辐射导致其横向交联((a.turchaninetal.,proc.surf.sci.2012,87,108；w.geyeretal.,appl.phys.lett.1999,75,2401；a.turchaninetal.,langmuir2009,25,7342)。该交联将自组装单层转化为具有一个分子的厚度的机械稳定的分子纳米层，该一个分子的厚度可在0.5-3nm之间调整(a.turchaninetal.,acsnano2013,7,6489；us8,377,243b2)。在以硝基为端基的联苯sams的化学纳米光刻的情况下，可以在金上的4'-硝基-1,1'-联苯-4-硫醇(nbpt)sam中产生交联的以氨基为端基的区域。尤其是，硝基基团被还分别还原成可被修饰成用于制备官能化纳米膜的氨基基团(us6,764,758b1)。

类似的芳族sams的交联可以通过euv光获得。另外，euv通过使用euv干涉光刻(euv-il)为纳米图案化的纳米膜的制造开创了新的机会。euv-il结合了平行制作工艺和10nm以下的非常高的分辨率。从分辨率或者吞吐量方面讲，euv-il的纳米图案化能力远超过光刻、电子束光刻和扫描探针光刻。euv-il可用于制作多种形状的无支撑图案化的纳米膜。

无支撑的碳纳米膜也可被化学官能化。在有的情况下，甚至可在碳纳米膜的第二面上实现修饰。这些无支撑的双面碳纳米膜常被称为“janus纳米膜”。

图2显示为具有pg作为生物排斥性材料以及edta衍生物作为亲和基团的官能化碳纳米膜。已经显示以氨基为端基的交联表面不仅能通过接枝工艺表现出生物排斥性，而且可以通过酰化作用被修饰。优选地，如edta的多齿配体，如edta，被用作能够可逆地结合ni²⁺离子的亲和基团。图2b显示原始的官能化碳纳米膜(顶部)、用ni²⁺离子孵育的该官能化纳米膜(中间)、已经用edta溶液去除ni²⁺离子的该官能化纳米膜(底部)的xps。xps分析显示该官能化碳纳米膜可逆地结合ni²⁺离子，这意味着样品可逆地吸附/脱附成为可能。进一步，无支撑的pg和edta官能化纳米膜从原始的金基底转移至tem网格上。图2c显示为在tem网格上的无支撑的pg和edta官能化纳米膜的him图像。

该创造性的官能化纳米膜可作为tem支持膜，通过生物识别反应对生物分子在其表面进行特异性固定。图3显示为该创造性的碳纳米膜的使用构思。仅通过将官能化纳米膜浸没于原料混合物，例如，细胞裂解物，就可实现生物分子的选择性固定。该水凝胶中间层防止了细胞裂解物组分与纳米膜的非特异性结合。最终组装适用于通过冷冻tem进行玻璃化及随后的结构分析。

图4显示为特异性结合在被pg和edta官能化的碳纳米膜上的负染色的组氨酸标记的生物分子的tem图像。tem分析显示，组氨酸标记热聚体分子结合在官能化碳纳米膜上。图4a显示为附着在官能化碳纳米膜上的负染色的组氨酸标记的pyrococcusfuriosus(嗜热古细菌)的热聚体的tem图像。图4c显示为对照实验的tem图谱。其显示为在与未经组氨酸标记和负染色的热聚体一起孵育后的官能化碳纳米膜。除了暗色沉积物以外，未见热聚体颗粒。

图5显示为可与石墨烯结合的官能化碳纳米膜，以增强其导电性从而减少在tem测量时的样品充电。图5a显示为官能化纳米膜沉积在分别制备的石墨烯片上。由于毗邻(如通过隧穿作用)，在碳纳米膜上收集或者形成的电荷可轻易地转移至高度导电的石墨烯片。图5b中，在cnm的其余部分被功能化之前，例如通过延长的电子局部处理，将部分碳纳米膜转换成石墨烯条纹。在生物分子的tem分析中，通过电接地的石墨烯条纹收集电荷。两种策略都保持样品电中性，并通过电荷/电荷相互作用减少散射效果。

图6显示在安装于网格上的官能化无定形碳膜上的负染色的组氨酸标记的p.furiosus(嗜热古细菌)的热聚体的tem图像。

实施例

1)碳纳米膜(cnm)的形成

在金上，通过由电子辐射引起的4'-硝基-1,1'-联苯-4-硫醇(nbpt)sams的交联制备cnms。为形成sams，使用在云母上的300nm厚的热蒸发金膜。该基底在uv/臭氧清洁剂中清洁，用乙醇漂洗然后在氮气流中吹干。可使用两种方法生成sam。任一个基底在氮气氛围下置于密封的烧瓶中，浸没在～10mmol的由nbpt在脱气、干燥的二甲基甲酰胺(dmf)中形成的溶液中72小时。之后，样品被用dmf和乙醇漂洗，并用氮气吹干。或者，在低于10^-5毫巴的真空中，使nbpt从努森池蒸发至金膜上。在高真空(<5×10^-7毫巴)下通过电子能量为100ev，剂量为50mc/cm²的电子流枪实现了与cnm的交联和硝基基团到氨基基团的转化。

2)第二层的形成(此处：为聚甘油)

处于在金-云母基底上的cnm被沉淀到盛有10％(w/w)的由缩水甘油在干燥的n-甲基吡咯烷酮(nmp)中形成的溶液的干燥且洁净的聚四氟乙烯(ptfe)容器中。在ptfe容器紧密关闭后，在烘箱中将其加热至150℃保持10小时。冷却后，去除膜，用nmp、水、和丙酮清洗，然后在无尘环境中干燥。

3)用亲和基团(此处：为edta)将第二层官能化

将乙二胺四乙酸二钠盐(na2edta×2h2o，510mg)在干燥的二甲基甲酰胺(dmf，15ml)中分散，加入亚硫酰二氯(0.3ml)。在室温下搅拌2小时后，加热该混合物至80℃并维持45分钟。冷却后，该膜系统被立即浸入该反应混合物中以50转/分钟的速率摇晃2小时。然后取出该膜，并用dmf、乙醇、水和丙酮清洗。在无尘环境中干燥该膜。

4)剥离膜系统并转移至tem网格

使用溶解在氯苯或乙酸乙酯中的聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)保护层将官能化的cnm转移至tem网格上。该层用于在转移过程中cnm的机械稳定化。将总共厚度约为400nm的的两层聚合物按顺序旋涂在cnm上。首先，将一层低分子量pmma(50k)，然后是一层高分子量pmma(950k)以4000转/分钟的速率旋转30秒，并在90℃的热板上固化5分钟。通过将多层样品中的一个边/角稍微浸入水中，底层云母载体与金/官能化的cnm/pmma结构相分离，从而使该多层样品最终(在分离后)漂浮在空气/水界面上。进一步，通过使用云母片将样品从水面转移至i2/ki/h2o蚀刻浴(1:4:10)中，使金膜在15分钟内溶解。然后将cnm转移至纯水中，以膜进行彻底清洁去除碘污染。最后，cnm/pmma结构由目标基底tem网格捕获，并且使用临界点干燥器将pmma层溶解在丙酮中从而使无支撑部件的损伤最小化。

5)在官能化cnm上的生物样品的电子显微术(此处：基于edta/ni²⁺/his-标记相互作用)

将tem格网上的官能化cnm与3μlnicl2(pbs缓冲液中含有1mg/ml的ni²⁺)孵育30秒，并用蒸馏水漂洗。随后，将3μl蛋白质溶液(源自嗜热古细菌的his标记的热聚体，约0.2mg/ml)施加在官能化cnm上处理30秒，用蒸馏水漂洗并用1％铀酰乙酸盐溶液负染色。在feitecnaispirit透射电子显微镜中以120kv的加速电压分析样品。使用4k×4kccd摄像头(gatan)拍摄图像。

6)无定形碳膜的官能化

用氧等离子体处理金-云母基底上的连续的无定形碳膜。使用在2至10nm范围内的厚度确定的膜。已发现厚度在4至5nm的膜在机械稳定性和透明度之间表现出有利的平衡。类似于cnms的官能化，将在金-云母基材上的等离子体处理的无定形碳膜沉积在装有10％(w/w)的由缩水甘油在干燥的nmp中形成的溶液的干燥且清洁的ptfe容器中。在密封ptfe容器后，将其在烘箱中加热至140℃，保持6-24小时。冷却后，取出薄膜，在水中浸渍10分钟，然后在氮气流中干燥。举例来说，通过将基底在含0.1％(w/w)edta单酸酐的无水dmf溶液中加热至90℃，并保持1小时，使第二层用edta基团官能化。通过改变edta单酸酐的浓度，可以改变表面的官能团负载。将官能化的无定形碳膜按照方案(见实施例4)转移到tem网格。举例来说，将膜转移到多孔碳涂层tem网格。类似地，可以实现向多孔金或多孔/花边碳涂层或纯tem网格的转移。官能化的无定形碳膜可以连接到石墨烯(如图5中的cnm所示)以增强导电性从而减少在tem测量中的样品充电。

7)官能化无定形碳膜上生物样品的电子显微术(此处：基于edta/ni²⁺/his-标记相互作用)

为了活化官能化无定形碳膜，3μl的1mm的naoh被加入，吸干，并被蒸馏水洗涤一次。随后，加入3μl0.1％niso4溶液并放置30秒。样品被用3μl蒸馏水洗涤两次。将3μl样品加入网格中并放置30秒。网格用滤纸吸干。将网格用3μl蒸馏水洗涤两次，吸干水分，并用醋酸铀酰染色。在feitecnaispirit透射电子显微镜中以120kv的加速电压分析样品。

上述说明书，权利要求书和附图中公开的特征可以单独地或以任何组合形式的用于以各种形式实现本发明的材料。