一种维生素B12适配体亲和柱及其制备方法和用途与流程

本发明涉及一种维生素B12的适配体亲和柱及其制备方法和用途。属食品检测领域。

背景技术：

维生素B12是唯一一类含有主要矿物质钴的维生素，故又名钴胺素，包括氰钴胺、羟钴胺、甲钴胺、腺苷钴胺。通常狭义上所指维生素B12是氰钴胺，它是食品和营养补充剂中B12的主要形式。B12易溶于水，在吸收时需要与钙结合，大部分为小肠所吸收，人体只能利用甲钴胺和腺苷钴胺，因此氰钴胺要在体内细胞转化成这两种形式才能被人体吸收利用。

婴幼儿缺乏维生素B12表现为精神情绪异常、表情呆滞、反应迟钝等，最后导致贫血。婴幼儿过量摄入维生素B12则易导致叶酸缺乏，有些会出现哮喘、湿疹、荨麻疹、面部水肿等过敏性症状。因此我国标准对婴幼儿品配方乳粉中B12的添加量有严格的规定，其中GB 14880—2012 《食品安全国家标准食品营养强化剂使用标准》中儿童调制乳粉中B12的添加量为10 ～ 30μg /kg，相关产品国标标准添加限量也在此范围。目前市售婴幼儿乳粉是营养标签中B12的含量大部分在1. 5 ～ 2. 5μg /100g 之间。

目前食品中维生素的测定方法较多,包括微生物法、比色法、示波法、原子吸收法、高效液相色谱法等。其中微生物分析法灵敏度高,但培养时间长、操作繁琐等缺点，大部分的检验机构不能较好地开展。,原子吸收法受基质钻元素的影响可使结果不准确。

高效液相色谱法( HPLC)具有准确度高、灵敏性强、可微量测定等优点,目前也被常用于食品中维生素的检测。但因其对样品中维生素纯度的要求较高,导致检测成本高、周期长,无法满足大批量样品快速筛选的需要,所以使用受到限制。今年来发展起来的免疫亲和柱-高效液相色谱（IAC-HPLC)）将免疫亲和纯化技术与高效液相色谱相结合。使HPLC的使用更加广泛。免疫亲和柱作为一种新的净化技术,在维生素的分析检测中应用越来越广泛。它是将特异性抗体结合到活化的固相载体上填充而成。当样品提取液通过柱子时,其中的抗原与抗体结合,其他杂质则通过水溶液洗掉,再用有机溶剂将抗原即维生素洗脱下来,从而使样品中的维生素得以净化。O.Heudi等使用免疫吸附柱纯化，通过高效液相紫外成功地检测出维生素B12。

免疫亲和柱具有操作简单，特异性高的优点。但是由于抗体获得困难，免疫亲和柱通常比较昂贵。并且由于抗体本身是一种蛋白质，其活性受到周围环境的影响。保存不当或者操作不当很容易造成抗体失活从而影响免疫亲和柱的效率。

适配体是一段核酸序列，通常为DNA或者RNA序列。 单链的核酸序列可以形成二级结构，从而能与靶点特异性结合。通过多次的富集和筛选，能够筛选到与靶点有高亲和力的特异性适配体。Herman等描述了核酸适配体的结合特异性，[Science 287,820-825].核酸适配体相对于抗体来说更稳定，不易受到环境的影响，并且核酸适配体可以化学合成，保证序列的准确性。[Song. Trends Analy. Chem 2008.27(2)]。

核酸适配体被应用于小分子的检测，在专利CN105505940A中，描述了一种黄曲霉毒素B1的适配体DNA传感器。通过黄曲霉毒素B1的适配体，及多条互补探针序列制备DNA传感器，通过酶底物反应，实现黄曲霉毒素B1的检测。在专利CN105400790A中，描述了一种黄曲霉毒素的检测方法。利用黄曲霉毒素B1的适配体与蔗糖酶结合，通过酶与糖底物的相互作用，依靠血糖仪实现黄曲霉毒素B1的检测。上述都是利用黄曲霉毒素适配体实现毒素的检测。

在毒素分离中，专利CN 104651369A中描述了一种黄曲霉毒素磁性分离方法，将黄曲霉毒素B1核酸适配体序列与磁珠结合，实现分离。在专利CN104399283中，描述了一种黄曲霉毒素B1的适配体亲和柱。该专利利用环氧基活化的琼脂糖微球，将黄曲霉毒素B1的适配体偶联，制备成亲和柱。实现黄曲霉毒素的分离。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种维生素B12适配体亲和柱及其制备方法和用途

在本发明中，我们利用SELEX系统，从适配体文库中筛选出来一条高特异性、高亲和力的的新的维生素B12的RNA适配体。适配体修饰后与N-羟基琥珀酰亚胺活化的载体通过共价键进行偶联。经过洗涤和封闭得到维生素B12的特异性载体。载体装柱后就形成了高亲和力的维生素B12适配体亲和柱

该亲和柱操作简便，纯化维生素B12效率高。能耐受有机溶剂，并且可以重复使用。样本经过简单的处理后就可以进行纯化，得到纯度很高的维生素B12。用于高效液相色谱检测和荧光仪检测。

具体操作如下：

本发明最大的优势就是利用了核酸适配体的特性，通过多轮的富集、洗涤、扩增等步骤，筛选出针对维生素B12的特异性适配体。通过序列测定得到适配体的序列

核酸适配体相对于抗体来说，具有适应环境广泛，能够耐受高温、能耐受有机溶剂并且操作方便等优点。最主要的，适配体在制备过程中不需要经过动物体内的过程，而是通过化学合成来获得。因此，生产周期短，并且可以通过合成条件保证序列的准确性

以核酸适配体为基础制备的亲和柱具有特异性好，维生素B12结合量大，纯化效率高的特点。

维生素B12适配体亲和柱及其制备方法说明如下

1.选择N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）修饰的琼脂糖载体sepharose4B，进行活化

取1gN-羟基琥珀酰亚胺修饰的琼脂糖，加入用50ml 1mM的HCl，溶胀30min后，凝胶用100ml 1mM HCl洗涤6次，再用100ml超纯水洗涤

2.将活化好的琼脂糖凝胶sepharose4B用偶联缓冲液（0.1M的NaHCO₃，0.8M NaCl，PH8.2）洗涤3次。加入20mol/L的氨基修饰的维生素B12适配体，室温偶联8小时

3.将偶联好的维生素B12适配体-琼脂糖载体用20mM，PH7.4的磷酸缓冲液PBS洗涤3次

4.封闭

将偶联好的维生素B12适配体-琼脂糖载体中加入100mmol/L的Tris.Cl PH8.0 ，室温反应2小时

5.将封闭好的维生素B12适配体-琼脂糖载体用20mM，PH7.4的磷酸缓冲液PBS洗涤3次

6.装柱

将维生素B12—琼脂糖载体根据需要装入层析柱中，可根据需要制备不同容量的维生素B12亲和柱。层析柱的结构如附图1所示。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1.本发明充分的利用了核酸适配体的优点，通过多轮的筛选和富集。得到了高特异性高亲和力的维生素B12核酸适配体。该适配体能够特异性的结合样本中的维生素B12，降低了抗体亲和柱经常遇到的交叉反应性。亲和柱效率大幅度提高

核酸适配体不受操作环境和有机溶剂的影响，尤其适合脂溶性维生素类的脂溶性物质的纯化。相比较，由于免疫亲和柱中的抗体不耐有机溶剂，有机溶剂常常会造成抗体的失活而使亲和柱效率降低

此外，由于有机溶剂导致抗体失活，因此免疫亲和柱通常为一次性使用。而核酸适配体亲和柱可以耐受有机溶剂，可以重复使用多次，大幅度降低了使用成本

2.本发明使用的核酸适配体可以通过化学合成法获得，可以保证序列的正确性。大幅度降低了不同批次间的变异。而相对来说，不同批次的抗体来自于不同的小鼠或者兔子，导致抗体间质量变异较大，使亲和柱质量存在差别

3.使用本发明纯化维生素B12操作简便，一步纯化就可以得到纯度较高的维生素B12。更方便操作者使用

4.使用本发明的产品得到的维生素B12纯度很高，后续不用再做别的纯化处理就可以直接用于高效液相色谱检测或者荧光检测。节省了操作者的时间和费用。

附图说明

图1：维生素B12适配体亲和柱结构组份示意图

A：进样口塞；B：活塞适配器；C：稳定箍；D：上筛板；E：柱体；F：载体填料； G：下筛板；H：出样口堵头

图2：维生素B12适配体亲和柱外观结构图

A：进样口塞；B：活塞适配器；C：稳定箍；D：上筛板；E：柱体；F：载体填料； G：下筛板；H：出样口堵头

图3：原奶样品中加入维生素B12标准品的液相色谱检测图

图4：奶粉样品中加入维生素B12标准品的液相色谱检测图

图5：功能性饮料中加入维生素B12标准品的液相色谱检测图。

具体实施方式

实施例1：利用氨基修饰的维生素B12适配体制备亲和柱

本发明制备维生素B12适配体亲和柱的一个优选的实施方案如下：

1.载体活化

选择N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）修饰的琼脂糖载体sepharose4B，进行活化

取1gN-羟基琥珀酰亚胺修饰的琼脂糖，加入用50ml 1mM的HCl，溶胀30min后，凝胶用100ml 1mM HCl洗涤6次，再用100ml超纯水洗涤

2.将活化好的琼脂糖凝胶sepharose4B用偶联缓冲液（0.1M的NaHCO₃，0.8M NaCl，PH8.2）洗涤3次。加入20mol/L的氨基修饰的维生素B12适配体，室温偶联8小时

3.将偶联好的维生素B12适配体-琼脂糖载体用20mM，PH7.4的磷酸缓冲液PBS洗涤3次

4.封闭

将偶联好的维生素B12适配体-琼脂糖载体中加入100mmol/L的Tris.Cl PH8.0 ，室温反应2小时

5.将封闭好的维生素B12适配体-琼脂糖载体用20mM，PH7.4的磷酸缓冲液PBS洗涤3次

6.装柱

将交联后的维生素B12-琼脂糖凝胶用10毫升20mM PBS PH7.4重悬，然后装入空的亲和纯化柱柱体中

1)取空的柱体，加入下方筛板，加入1mlPBS，使其自然流干

2)加下方出样口堵头，在柱体中加入1ml上述处理后的维生素B12适配体-琼脂糖凝胶载体，静止5分钟，使载体自然沉降

3)加入上方筛板，按压筛板，使其到达载体上方

4)加入活塞适配器，适配器有一个压紧作用，使上方筛板紧贴载体

5)从下方将稳定箍套在柱体上，使其紧贴进样口

6)拔掉出样口堵头，用注射器取5mlPBS，将注射器接在进样口上，缓慢的将PBS注入亲和柱中，使出液速度保持在1-2滴/秒。直至全部液体注入亲和柱

7)套上出样口堵头，套上进样口塞，将制备好的维生素B12适配体亲和柱放入4℃保存。

实施例2：利用生物素修饰的维生素B12适配体制备亲和柱

本发明制备维生素B12适配体亲和柱的一个优选的实施方案如下：

1.取1ml链霉亲和素（SA）修饰的琼脂糖凝胶sepharose4B，用10ml超纯水洗涤3次

2.将（SA）修饰的琼脂糖凝胶sepharose4B用偶联缓冲液（0.02M的PBS，0.8M NaCl，PH7.4）洗涤3次。加入20mol/L的生物素修饰的维生素B12适配体，室温偶联4小时

3.将偶联好的维生素B12适配体-琼脂糖载体用20mM，PH7.4的磷酸缓冲液PBS洗涤3次

4.装柱

将维生素B12—琼脂糖载体根据需要装入层析柱中，可根据需要制备不同容量的维生素B12亲和纯化柱

1)取空的柱体，加入下方筛板，加入1mlPBS，使其自然流干

2)加下方出样口堵头，在柱体中加入1ml上述处理后的维生素B12适配体-琼脂糖凝胶载体，静止5分钟，使载体自然沉降

3)加入上方筛板，按压筛板，使其到达载体上方

4)加入活塞适配器，适配器一个压紧作用，使上方筛板紧贴载体

5)从下方将稳定箍套在柱体上，使其紧贴进样口

6)拔掉出样口堵头，用注射器取5mlPBS，将注射器接在进样口上，缓慢的将PBS注入亲和柱中，使出液速度保持在1-2滴/秒。直至全部液体注入亲和柱

7)套上出样口堵头，套上进样口塞，将制备好的维生素B12适配体亲和柱放入4℃保存。

实施例3：利用维生素B12适配体亲和柱纯化原奶中的维生素B12

本实施例利用正常的原奶样本定量加入维生素B12的标准品，然后用维生素B12适配体亲和柱进行纯化，纯化后用高效液相色谱检测。测定回收率

1.原奶样品处理

按照每10ml样品30ng的标准，在原奶样本中添加维生素B12标准品；

----将免疫亲和柱连接于10.0 ml一次性注射器下

----准确移取10ml原奶样本注入一次性注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接调节开关，使液体以1～2滴/秒的速度流出

----待液体排干后，首先用0.1%Tween-20水溶液洗涤10mL，再用蒸馏水或去离子水洗涤10mL，流速2～3滴/秒

----待液体排干后，更换新针筒，上样2ml乙腈，用刻度试管接洗脱液，流速1滴/秒

----洗脱后液体用氮气在 30℃条件下吹至近干

----用10%乙腈水溶液溶解并定容到1ml

---洗脱液用0.22μm微孔滤器过滤后转移至样品瓶用于HPLC分析

2.洗脱产物用高效液相色谱HPLC检测

高效液相色谱检测结果显示，在10ml原奶样品中加入30ng的维生素B12，用本发明的适配体亲和柱可以回受到29.34ng。回收率为97.8%。色谱图见附图3。

实施例4：利用维生素B12适配体亲和柱纯化和检测奶粉样品中的维生素B12

1.前处理

按照每1g奶粉样品30ng的标准，奶粉样品中添加维生素B12标准品；

1g奶粉加入10ml 10mmol/L磷酸缓冲液PBS PH7.4，剧烈振荡20min，用快速定性滤纸过滤，收集滤液；

取所有滤液过免疫亲和柱净化

2.净化

1)将亲和柱连接于10.0ml一次性注射器下。按照前处理要求，准确移取相应体积的样品提取液注入一次性注射器中，将空气压力泵与注射器连接调节开关，使液体以1～2滴/秒的速度流出；

2)待液体排干后，用蒸馏水或去离子水洗涤2次，每次10mL；

3)待液体排干后，上样1mL甲醇，流速1滴/秒，收集洗脱液并定容至1mL；

4)洗脱液用0.22μm微孔滤器过滤后转移至样品瓶用于高效液相色谱HPLC分析；

5)高效液相色谱检测结果显示，在1g奶粉样品中加入30ng的维生素B12，用本发明的适配体亲和柱可以回受到28.95ng。回收率为96.5%。色谱图见附图4。

实施例5：利用维生素B12适配体亲和柱纯化和检测功能饮料中的维生素B12

本实施例利用功能性样本定量加入维生素B12的标准品，然后用维生素B12适配体亲和柱进行纯化，纯化后用高效液相色谱检测。测定回收率

1.原奶样品处理

按照每10ml样品30ng的标准，在功能性饮料样本中添加维生素B12标准品；

----将免疫亲和柱连接于10.0 ml一次性注射器下；

----准确移取10ml原奶样本注入一次性注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接调节开关，使液体以1～2滴/秒的速度流出；

----待液体排干后，首先用0.1%Tween-20水溶液洗涤10mL，再用蒸馏水或去离子水洗涤10mL，流速2～3滴/秒；

----待液体排干后，更换新针筒，上样2ml乙腈，用刻度试管接洗脱液，流速1滴/秒；

----洗脱后液体用氮气在 30℃条件下吹至近干；

----用10%乙腈水溶液溶解并定容到1ml；

---洗脱液用0.22μm微孔滤器过滤后转移至样品瓶用于HPLC分析

2. 洗脱产物用高效液相色谱HPLC检测

高效液相色谱检测结果显示，在10ml功能性饮料样品中加入30ng的维生素B12，用本发明的适配体亲和柱可以回受到28.62ng。回收率为95.4%。色谱图见附图5。

实施例6维生素B12适配体亲和柱重复使用柱容量的变化

本实施例利用定量的维生素B12的标准品，然后用维生素B12适配体亲和柱进行纯化。亲和柱上的维生素B12用有机溶剂洗脱后，用高效液相色谱检测其浓度。亲和柱重新平衡后重复上样和洗脱，测定洗脱的维生素B12浓度。主要目的是测试维生素B12适配体亲和柱的重复使用性

1.配制5ug/ml的维生素B12标准品

2.取出维生素B12适配体亲和柱，打开进样口塞，进样口与注射器针筒连接，注射器接入到气控操作架上

3.打开出样口塞，用10mmol/L PBS PH7.4洗涤亲和柱3次，每次10毫升，调节气孔操作架气泵压力，使液体以3滴/秒的流速流出

4.取100ul上述配制的维生素B12标准品，总量500ng ，加入亲和柱柱中，调节流量至1-2滴/秒。直至样品全部流出亲和柱

5.用蒸馏水洗涤纯化柱3次，每次5毫升

6.加入1ml甲醇，收集洗脱产物

7.洗脱产物用高效液相色谱HPLC检测

8.亲和柱用超纯水洗涤3次，每次10ml，然后用10mmol/L PBS PH7.4洗涤亲和柱3次，每次10毫升

9.再次上样100ul维生素B12标准品，总量500ng

10. 按照上述操作洗涤及洗脱，洗脱产物用高效液相色谱检测其浓度

11. 再重复步骤8.9.10三次。检测洗脱产物的浓度

12. 计算总共5次的维生素B12适配体亲和柱纯化的回收率

高效液相色谱检测结果见表4：

从上述结果可以看出，维生素B12适配体亲和柱重复使用5次后，其结合能力没有明显的降低。

维生素B12适配体序列

5’-GGAACCGGUGCGCAUAACCACCUCAGUGCGAGCAA-3’