一种沸石基负载型仿酶催化剂及其制备方法和应用与流程

本发明属于化工催化剂技术领域，具体涉及一种沸石负载型仿酶催化剂及其制备方法和应用。

背景技术：

沸石分子筛是一类具有规则孔道结构结晶态的硅铝酸盐，可以作高效干燥剂、选择性吸附剂、催化剂、离子交换剂等，一般可以分为天然沸石和合成沸石两种。其中，一般常见的沸石分子筛有zsm-5型沸石、beta沸石、丝光沸石、镁碱沸石、y型沸石等等，不同的沸石具有不同的结构特点，因此具有不同的应用。

y型分子筛是一种工业应用非常广泛的沸石分子筛。由于其具有规则的三维孔道排列，较高的比表面积和强的酸性，已广泛用于催化裂化、加氢裂解、烷基化、气体的吸附分离等石油石化工业，其中催化裂化过程中使用率达70%以上。本发明以y型沸石为例，以其作为载体来合成负载型的仿酶催化剂。一般仿酶催化剂的活性组分有一些过渡金属氧化物，如v2o5、fe3o4、cuo、tio2（huizhao,yumingdong,pingpingjiang,guangliwang,jingjingzhang.acsappl.mater.interfaces.,2015,7,6451−6461）等；还包括贵金属，如au、pt等都可作为活性组分。一般而言，仿酶催化具有多种结构，如介孔结构、石墨烯层状结构（youhuilin,liwu,yanyanhuang,jinsongren,xiaogangqu.chem.sci.,2015,6,1272−1276）、核壳（core-shell）结构、空心管状结构、janus球形结构（changlu,xiangjiangliu,yunfengli,fangyu,longhuatang,yanjiehu,yibinying.acsappl.mater.interfaces.,2015,7,15395−15402）等，具有不同的优势和催化性能。

近年来作为镧系稀土元素的铈受到广泛关注。一般而言，氧化铈通常为萤石立方形结构。它可以看作是由大量氧离子形成四方晶格。而每隔一个立方体，都由一个阳离子占据下一个立方体的中心。一些阴离子可能会从四面体的位置自行转移到八面体上的位置上来，在四面体上留下空缺，这就形成了弗兰克尔型缺陷。弗兰克尔型缺陷使氧化铈晶体中存在大量游离的氧，成为重要的贮氧供氧材料。而由于纳米级材料的特殊结构，使得晶体缺陷增加，提高了氧的空位数，氧的流动性更大。所以纳米级氧化铈的贮氧能力要大大高于普通氧化铈。与此同时，由于氧化铈晶格氧的移动性、铈离子的可变价性、还有ce⁴⁺的相对稳定性，所以氧化铈在光催化、细胞色素促进剂、燃料电池等诸多方面有着广泛的应用。故本发明的活性组分以ceo2为例，将纳米氧化铈高度负载于y型沸石上，并用于仿酶催化应用研究。

一般来说，对于制备ceo2/y催化剂的方法主要包括以下两种，其一，可以使用火焰原子喷雾法或者胶体溶液燃烧法来合成纳米氧化铈颗粒，然后再负载于y型沸石上；其二，可以选择使用浸渍焙烧的方法来合成ceo2/y。本发明使用硝酸铈作为铈源，y型沸石作为载体，采用浸渍焙烧的方法来合成ceo2/y。将该材料作为仿酶催化剂，用来检测葡萄糖、尿酸、胆固醇等物质。这些成分与人体健康息息相关，而血清中的葡萄糖浓度测定和糖尿病的检测相关，因此本发明以测试葡萄糖检出限为例，用制备的负载型仿酶催化剂进行实验。

对于一般葡萄糖的检测，可以使用电化学法，液相色谱法，分光光度法等。相比于其它方法，分光光度法（比色法）检测迅速，成本低，而且还可以裸眼观察，经常被用于类似成分的检测。葡萄糖在酶的作用下会分解为葡萄糖酸和双氧水（h2o2），可以通过检测双氧水作为测定葡萄糖浓度的指标。针对双氧水的检测，可以采用以下几种显色剂，如tmb（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）、opd（邻苯二胺）、abts（2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐），其中opd毒性较强，abts虽然毒性小，但成本略高，显色效果差于tmb，因此我们选择无毒害作用的tmb作为显色剂，在h2o2和tmb反应后，生成氧化tmb（ox-tmb），颜色可由白色变成蓝色。但由于h2o2和tmb反应很慢，需要辣根过氧化物酶hrp来催化才会有明显的反应，但由于天然酶的使用条件受限，而且成本高，稳定性差，所以本发明通过使用制备的沸石基负载型仿酶催化剂来催化该反应，从而达到快速检测双氧水和葡萄糖浓度的目的。

技术实现要素：

本发明目的在于沸石基负载型仿酶催化剂及其制备方法，并将其用于葡萄糖类物质的检测。

本发明提出的沸石基负载型仿酶催化剂的制备方法，采用浸渍焙烧法，具体步骤为：

（1）先加入活性组分的盐类（1-5g）和5-20ml的水，搅拌10-30min；

（2）将沸石（根据活性组分负载量的不同，沸石的量一般为活性组分量的3-20倍）加入上述溶液中，室温搅拌4-6h，得到均匀的悬浮液；

（3）将上述悬浮液用红外灯完全烘干或者用烘箱干燥；

（4）最后将干燥的样品于500℃-900℃空气中煅烧2-4小时，即得到沸石基负载型仿酶催化剂。

本发明中，所述的活性组分可选自金属氧化物v2o5、fe3o4、cuo、tio2或ceo2等，优选ceo2。

本发明中，所述的沸石可以为zsm-5沸石、丝光沸石、beta沸石、镁碱沸石或y型沸石等。

本发明中，体系中活性组分和沸石基底的质量配比为1%~30%。

本发明中，步骤（4）中煅烧温度优选500℃-600℃，煅烧时间2-4h，尤其活性组分优选ceo2时。

本发明制备的沸石基负载型仿酶催化剂具有高催化活性，可用于裸眼、快速检测葡萄糖，并且具有良好的水溶液分散性，是一种便捷、环境友好型的催化剂。

本发明制备的沸石基负载型仿酶催化剂的特征用如下方法进行表征：

粉末x射线衍射(xrd)。此x射线衍射图谱与标准图谱比较，证明ceo2均匀负载于y型沸石上。

透射电子显微镜（tem）。可以非常直观的判断出其规则的晶型形貌和ceo2在y型沸石上的分散性。

低温氮吸附。测定其比表面积和等温吸附曲线，孔径分布，判断其孔结构。

沸石基仿酶催化剂性能测试：

紫外分光光度计（uv-vis)。对ceo2/y在催化过程中扫描吸光度-波长曲线，可以得到对应吸收峰的吸光度。用来对比催化剂的催化性能以及用来计算葡萄糖的检出限。

本发明提出的沸石基负载型仿酶催化剂可用于检测葡萄糖，具体是用分光光度法进行催化剂的仿酶测试，主要考察显色剂和双氧水的比色反应，然后针对h2o2和葡萄糖的检出限lod进行测试。具体步骤如下：

（1）将仿酶催化剂用乙酸盐缓冲液（ph=3-4）配制成0-2mg‧ml^-1的悬浮液，超声分散，取100-300μl的悬浮液于离心管中进行测试；

（2）加入2-3ml乙酸盐缓冲液以达到比色皿2/3以上的量；

（3）加入0-30%的双氧水和0-100mm（优选1-100mm）的显色剂（如显色剂tmb用dmso配成81.6mm的溶液），然后反应5-10min之后用紫外分光光度计测试a-λ曲线，记录652nm处ox-显色剂吸收峰的吸光度；

（4）对于h2o2检出限的测试，在步骤（1）、（2）培制的含有仿酶催化剂和乙酸盐缓冲液的溶液中，加入0-100mm（优选1-100mm）的显色剂，固定h2o2的浓度在0-100mm范围内，从零点开始，逐渐增加双氧水浓度，进行a-λ测试，记录每组数据652nm处的吸光度a，然后拟合对应双氧水浓度下的a-c（h2o2）工作曲线，接着根据工作曲线的斜率得到计算检出限所需要的灵敏度k，然后测试20组空白实验所对应的相对偏差σ，由检出限公式lod=3σ/k计算出对应双氧水的检出限。

对于葡萄糖检出限的测试，首先将1-2g葡萄糖用10-100mlpbs缓冲液不断稀释，配制成浓度为0-100mm的溶液。然后加入1-2mg的gox（葡萄糖氧化酶），在37℃水浴培养一段时间，待葡萄糖完全分解之后，加入100-300μl仿酶催化剂、2-3ml乙酸盐缓冲液，再加入浓度为0-100mm（优选1-100mm）的显色剂，在37℃水浴培养1-2h。然后测试浓度范围0-100mm的葡萄糖溶液的a-λ曲线，记录每组数据652nm处的吸光度a，拟合对应葡萄糖浓度下的a-c（葡萄糖）工作曲线；根据工作曲线的斜率得到计算检出限所需要的灵敏度k，然后测试10-20组空白实验所对应的相对偏差σ，由检出限公式lod=3σ/k，计算出对应葡萄糖的检出限。

本发明中，所述的显色剂可以为tmb（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）、opd（邻苯二胺）或abts（2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐）等。

本发明制备的“活性组分/沸石”仿酶催化剂，活性组分可以很好地分散于沸石表面，而且该材料比表面积大、表面的活性组分颗粒（如氧化铈）大小均一，同时还具有很高的催化活性，能够达到快速检测葡萄糖和裸眼识别的效果。仿酶催化剂的合成和检测过程中都未涉及毒性材料，是一种方便快捷、环境友好的分析检测方法。

附图说明

图1为ceo2在y型沸石上负载量为20%的xrd图谱。

图2为y型沸石与ceo2/y的等温吸附曲线图。其中，a为y型沸石的吸附等温曲线，b为ceo2/y的吸附等温曲线。如图所示，其中，y型沸石比表面积约为747m²/g，负载20%的氧化铈之后的y型沸石，比表面积为512m²/g，比表面积明显减小。

图3为不同倍数下的ceo2/y的tem图。从图中可以看出ceo2颗粒在y型沸石上有着良好的分散性。

图4为uv-vis测试下ceo2/y的催化性能图。其中，a为测试条件为tmb+ceo2/y+h2o2的吸光度-波长曲线，b为测试条件为tmb+ceo2/y的吸光度-波长曲线，c为测试条件为tmb+h2o2的吸光度-波长曲线，d为测试条件为tmb的吸光度-波长曲线。从不同的测试条件下的吸光度-波长曲线对比可以看出只有在tmb+ceo2/y+h2o2条件下才具有652nm处ox-tmb的强的吸收峰，说明ceo2/y还是具有很好的仿酶催化活性的。

图5为uv-vis测试时，h2o2浓度从0-62μm的吸光度-波长曲线，通过不同浓度下的h2o2测试，得到不同的652nm处的吸光度，绘制吸光度-双氧水浓度工作曲线，可得到h2o2的检出限为95.04nm。

图6为uv-vis测试时，葡萄糖浓度从0-338μm的吸光度-波长曲线，通过不同浓度下的葡萄糖测试，得到不同的652nm处的吸光度，绘制吸光度-葡萄糖浓度工作曲线，可得到葡萄糖的检出限为0.132μm。

具体实施方式

以在y型沸石上负载20%的氧化铈为例，合成过程如下：

（1）称取0.504g六水合硝酸铈，室温下搅拌溶于10g水溶液中；

（2）向上述溶液中加入2gy（cbv-600）型沸石,然后在室温下搅拌5h；

（3）将搅拌后的悬浮液用红外灯完全干燥，研磨成粉末；

（4）置于马弗炉600℃焙烧3h。

仿酶催化剂用于葡萄糖检出限测试，具体操作如下：

（1）将催化剂用乙酸盐缓冲液（ph=3.7）配制成1mg/ml的溶液；

（2）将葡萄糖用pbs缓冲液（ph=7）配成溶液，测试的浓度范围为0-340μm；

（3）将测试葡萄糖浓度的工作范围按梯度分成9组，从零点开始进行测试；

（4）首先将9组葡萄糖溶液加入7ml离心管，每组加入2mggox，在37℃水浴培养1h；

（5）然后每组分别加入200μl仿酶催化剂，和对应量的乙酸盐缓冲液（保持每组容积一致），最后加入81.6mm的tmb，在水浴37℃培养30min，测试uv-vis曲线；

（6）最后根据对应不同的葡萄糖浓度和652nm处的吸光度绘制工作曲线，计算葡萄糖检出限lod。

配比及实施结果：

在y型沸石上负载20%的氧化铈的仿酶催化剂，测试出h2o2的检出限为95.04nm，葡萄糖的检出限为0.132μm。

以y型沸石上不同负载量的氧化铈为例，进行催化活性测试，具体步骤如下：

（1）将负载量为5%、10%、15%、20%、25%、30%的催化剂用乙酸盐缓冲液（ph=3.7）分别配制成1mg/ml的溶液。在7ml离心管内每组加入200μl催化剂悬浮液；

（2）每组加入3ml的乙酸盐缓冲液（ph=3.7）；

（3）每组加入30%的h2o220μl，然后再加入30μltmb溶液（81.6mm）；

（4）在室温25℃下反应5min之后，uv-vis测试每组的吸光度-波长曲线。

y型沸石上不同负载量的氧化铈测试结果如下表：

活性组分为氧化铈，负载量为20%时，不同沸石基载体的催化活性测试结果如下：

活性组分为四氧化三铁，负载量为20%时，不同沸石基载体的催化活性测试结果如下：

活性组分为氧化铈，负载量为20%时，不同介孔金属氧化物载体的催化活性测试结果如下：

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