本发明属于白细胞过滤技术领域，具体涉及一种用于滤除白细胞的滤膜及其制备方法。
背景技术：
在输血医疗过程中，常常会发生多种输血副作用，其根源是输入含白细胞的全血或血液成分可引起非溶血性发热反应、人类白细胞抗原同种免疫、输血相关病毒感染和输血后移植物抗宿主病等输血不良反应。因此，在输血前滤除血液制剂中的白细胞具有重要的意义。白细胞过滤器是滤除白细胞的重要方法，其原理是利用机械阻滞和吸附的原理截留白细胞，而让表面光滑、变形能力较强的红细胞通过。目前，第3代白细胞过滤器的要求是滤除率达到99.99％。
此外，现代研究表明血小板亦会诱导机体产生抗血小板抗体，抗血小板抗体是一种自身抗体，对自身的组织器官不识别，会攻击自身的组织器官，从而造成损害。因此，为了减少因输血小板而致的副作用，人们致力于研究一种在除去白细胞的同时也可高效率地除去血小板的滤膜。以往有相关研究尝试通过减少过滤介质的纤维直径或孔径或增大过滤介质的填充密度作为提高过滤介质同时除去白细胞和血小板能力的手段。但是应用上述方法会存在血液过滤处理时间延长和可能会导致红细胞膜破裂而出现溶血现象。
目前，白细胞滤膜多采用表面接枝或涂覆亲水性聚合物对过滤材料表面进行改性，增加过滤材料的润湿性，降低过滤材料表面与血液的表面能，增加过滤材料接触血液的有效表面积，从而增加捕捉白细胞的机会。然而过滤材料表面的亲水性越高，血小板越难以活化，另外通过水和材料的氢键等可以很容易在材料表面形成水层，具有抑制血浆蛋白吸附，尤其是纤维蛋白的吸附，从而减少血小板的粘附性，对血小板的截留减少。此外，亲水性聚合物的水溶性较强，在血液中会存在溶出问题。
专利文献cn103415309b公开了一种用于从血液中或者从血液衍生物中除去物质的改进的过滤器以及用于获得所述过滤器的方法。所述的过滤器包含容纳层状的过滤器元件的壳体，所述层状的过滤器元件包含多个层，所述层状的过滤器元件的至少一层涂覆有聚氨酯，所述聚氨酯的分子量为12,000道尔顿至18,000道尔顿，并将涂覆有聚氨酯的非织造物夹杂在亲水性较小的织造物中形成的层状过滤元件，所述的层状过滤元件对白细胞和血小板均具有较好的滤除作用。
专利文献cn106117580a公开了一种用于滤除白细胞的滤膜改性剂及其改性方法，所述滤膜改性剂由酰胺化修饰丝素蛋白、聚乙烯吡咯烷酮和丙烯酸酯共聚物以(0.052):(0.2～1):1的质量比组成。其中，丙烯酸酯共聚物由甲基丙烯酸甲酯单体和甲基丙烯酸二甲氨基乙酯单体构成。制备得到的滤膜改性剂可溶于极性溶剂如水中配置成溶液，以浸润改性的方式对过滤膜进行涂覆处理，所述经滤膜改性剂处理后的过滤膜具有较好的润湿性、稳定性和相容性，对白细胞和血小板均具有较高的滤除率，且具有较低的改性剂洗出率，避免溶出物污染。
然而，目前的白细胞滤膜只注重细胞率过滤的设计，在使用的过程中往往容易出现滤膜堵塞导致使用寿命较低或者影响细胞滤过质量的缺陷，同时，在过滤的过程中容易出现血液的污染，导致将细菌带入受血者的体内，对受血者的身体健康存在较大的威胁。
技术实现要素：
为了克服现有技术中白细胞滤膜存在的缺陷。本发明的目的在于提供一种用于滤除白细胞的滤膜及其制备方法，以解决上述缺陷。
本发明提供了一种用于滤除白细胞的滤膜，包括以下步骤：
海藻酸钠100～200份、纳米氧化锌35～45份、壳寡糖15～25份和胺基木质素磺酸钠10～20份。
进一步地，所述用于滤除白细胞的滤膜包括以下制备原料及其重量份数：
海藻酸钠160份、纳米氧化锌38份、壳寡糖22份和胺基木质素磺酸钠15份。
进一步地，所述纳米氧化锌的制备方法为：
a.称取硝酸锌加入去离子水中，搅拌至完全溶解，接着加入碳酸钠，搅拌至反应完全，离心，得白色沉淀物；
b.往步骤a得到的白色沉淀物加入十二烷基葡萄糖苷，搅拌5～8min，接着加入三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯，搅拌10～20min，得混合液；
c.将步骤b得到的混合液加热至130～140℃，保温静置30～40min，接着通入氮气，继续加热至250～300℃，保温静置40～60min；
d.将步骤c得到的混合液冷却至35～45℃，加入无水乙醇，离心得沉淀物，再用无水乙醇洗涤，离心，干燥，得粒径为8～10nm的纳米氧化锌。
进一步地，所述步骤a中硝酸锌与碳酸钠的重量比为(1.2～1.6):1。
进一步地，所述步骤b中白色沉淀物与十二烷基葡萄糖苷的固液比为1g：(10～12)ml。
进一步地，所述步骤b中白色沉淀物与三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯的固液比为1g：(6～8)ml。
进一步地，所述胺基木质素磺酸钠的制备方法为：
a.将木质素磺酸钠溶于水中配制成质量百分比浓度为65～75％木质素磺酸钠水溶液，加热至60～80℃，加入三乙烯四胺，接着滴加质量百分比浓度为50％的戊二醛水溶液，所述戊二醛水溶液的滴加速率为0.3～0.5ml/min，滴加时间控制在20～30min，在温度为80～90℃反应2～3h，得胺基木质素磺酸钠溶液；
b.将步骤a得到的胺基木质素磺酸钠溶液用无水乙醇进行抽提，得抽提物，用石油醚洗涤抽提物，洗涤后进行冷冻干燥，即得。
进一步地，所述步骤a中的三乙烯四胺的添加量是木质素磺酸钠水溶液总体积的20～30％。
进一步地，所述步骤b中冷冻干燥的条件为：-8℃预冻2～4h，接着在真空度为0.04～0.06mpa，温度为-18℃冷冻20～24h。
另外，本发明还提供了一种用于滤除白细胞的滤膜的制备方法，包括以下步骤：
s1将海藻酸钠加入水中，搅拌至完全溶解，得海藻酸钠水溶液；
s2将壳寡糖和胺基木质素磺酸钠加入水中，搅拌至完全溶解，得混合液；
s3将纳米氧化锌加入水中，搅拌至完全溶解，得纳米氧化锌溶液；
s4将步骤s2得到的混合液与步骤s1得到的海藻酸钠水溶液混合，搅拌均匀，得纺丝溶液，接着用计量泵通过孔径为0.08mm的喷丝孔挤入步骤s3得到的纳米氧化锌溶液中，牵伸，用95％乙醇处理纤维，离心脱去乙醇后烘干纤维，切割，梳理，成网，制成孔径为4～3μm的网状结构，即得。
本发明提供的用于滤除白细胞的滤膜是由壳寡糖和胺基木质素磺酸钠的水溶液与海藻酸钠水溶液共混后形成均匀的纺丝溶液，通过喷丝孔挤入氧化锌溶液中制备而成，解决了现有技术中通过将聚合物材料接枝或粘合的作用涂覆在疏水性载体上，在过滤白细胞时出现的聚合物脱落影响过滤效果，或污染物溶出污染血液缺陷，而且本发明提供的原材料均是无毒，无污染的成分，是一种环保，健康，无污染的白细胞滤膜。
本发明提供的用于滤除白细胞的滤膜采用双重过滤原理，可以有效的提高白细胞和血小板的滤除率。本发明提供的孔径为3～4μm的网状结构的白细胞滤膜，可以阻止白细胞的通过，同时滤膜上的带正电荷壳寡糖和胺基木质素磺酸钠的正电荷胺基对白细胞具有很强的吸附作用，二者同时作用，可以有效的提高白细胞的滤除率。另外，嵌有自制纳米氧化锌的海藻酸钠纤维可以活化血小板，对血小板具有吸附作用，还有，胺基木质素磺酸钠中含有的酚羟基、醇羟基、羰基、羧基等带负电荷基团也可以活化血小板，对血小板也具有吸附作用，二者同时作用，可以有效的提高血小板的滤除。
进一步地，经试验发现，本发明提供的用于滤除白细胞的滤膜对全血中的白细胞的滤除率高达99.999％，对全血中血小板的滤除率达94％以上，其滤除效果超过了第3代白细胞过滤器的要求，是一种高效的白细胞和血小板的细胞过滤膜。
本发明提供的用于滤除白细胞的滤膜中的自制纳米氧化锌、壳寡糖与胺化胺基木质素磺酸钠相互作用具有防止滤膜长时间过滤产生滤孔堵塞，缓解和防止血液冷凝集的发生的作用，解决了现代由合成微纤维形成网状结构组成的白细胞滤器的小孔会阻留变形性较差的细胞，变形差的红细胞和被破坏的红细胞易在白细胞滤盘内堆积使得转移袋内的红细胞无法通过滤盘，同时还由于血液样本库存时间较长，导致血液的黏度和红细胞的变形性提高，血液发生冷凝集的现象，导致血液经白细胞滤盘时出现严重阻塞，造成过滤不畅甚至不滴，滤血时间延长或血液过滤不完的缺陷，可以有效的保证了血液白细胞的过滤质量。
进一步地，经试验发现，本发明提供的用于滤除白细胞的滤膜对400ml全血进行过滤时只需要14～16min，说明本发明的提供的白细胞滤膜具有较好的亲水湿润性，有利于血液的过滤。同时，对于异常的血液样本的过滤时间为15～17min，与过滤正常血液的时间基本保持不变，说明本发明提供的用于滤除白细胞的滤膜中的自制纳米氧化锌、壳寡糖与胺化胺基木质素磺酸钠相互作用可以防止滤膜的孔径堵塞，缓解血液凝结现象，可以有效的扩大白细胞滤膜的使用范围和延长使用寿命。
另外，本发明提供的含有自制纳米氧化锌的海藻酸钠纤维素和壳寡糖相互作用具有较强的抑菌、杀菌的作用，可以防止血液过滤时受细菌污染，同时还可以保持血液的新鲜度，可以提高过滤血液的安全性。
与现有技术相比，本发明提供的用于滤除白细胞的滤膜具有以下优势：
(1)本发明提供的用于滤除白细胞的滤膜具有结合力强和稳定性高的优点，在使用过程中可以避免滤膜上的物质洗出或脱落，可以有效的防止血液污染；
(2)本发明提供的用于滤除白细胞的滤膜具有白细胞和血小板滤过率高，在血液过滤的过程中具有缓解或防止血液发生冷凝集现象，疏通滤膜孔径堵塞的作用，可以保证血液白细胞的过滤质量，还可以延长白细胞滤膜的使用寿命长，是一种较为理想的白细胞过滤膜。
具体实施方式：
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
实施例1、一种纳米氧化锌的制备
a.称取硝酸锌加入去离子水中，搅拌至完全溶解，接着加入碳酸钠，所述硝酸锌与碳酸钠的重量比为1.4:1，搅拌至反应完全，离心，得白色沉淀物；
b.往步骤a得到的白色沉淀物加入十二烷基葡萄糖苷，搅拌6min，所述白色沉淀物与十二烷基葡萄糖苷的固液比为1g:12ml，接着加入三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯，搅拌15min，所述白色沉淀物与三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯的固液比为1g:8ml，得混合液；
c.将步骤b得到的混合液加热至135℃，保温静置35min，接着通入氮气，继续加热至280℃，保温静置50min；
d.将步骤c得到的混合液冷却至40℃，加入无水乙醇，离心得沉淀物，再用无水乙醇洗涤，离心，干燥，得粒径为8～10nm的纳米氧化锌。
实施例2、一种胺基木质素磺酸钠的制备
a.将木质素磺酸钠溶于水中配制成质量百分比浓度为70％木质素磺酸钠水溶液，加热至70℃，加入三乙烯四胺，所述三乙烯四胺的添加量是木质素磺酸钠水溶液总体积的25％，接着滴加质量百分比浓度为50％的戊二醛水溶液，所述戊二醛水溶液的滴加速率为0.4ml/min，滴加时间控制在25min，在温度为85℃反应2h，得胺基木质素磺酸钠溶液；
b.将步骤a得到的胺基木质素磺酸钠溶液用无水乙醇进行抽提，得抽提物，用石油醚洗涤抽提物，洗涤后在-8℃预冻3h，接着在真空度为0.05mpa，温度为-18℃冷冻22h，即得。
实施例3、一种用于滤除白细胞的滤膜
所述用于滤除白细胞的滤膜由以下制备原料及其重量份数组成：
海藻酸钠100份、纳米氧化锌35份、壳寡糖15份和胺基木质素磺酸钠10份；所述纳米氧化锌为实施例1制备的纳米氧化锌，所述胺基木质素磺酸钠为实施例2制备的胺基木质素磺酸钠。
制备方法：
s1将海藻酸钠加入水中，搅拌至完全溶解，得海藻酸钠水溶液；
s2将壳寡糖和胺基木质素磺酸钠加入水中，搅拌至完全溶解，得混合液；
s3将纳米氧化锌加入水中，搅拌至完全溶解，得纳米氧化锌溶液；
s4将步骤s2得到的混合液与步骤s1得到的海藻酸钠水溶液混合，搅拌均匀，得纺丝溶液，接着用计量泵通过孔径为0.08mm的喷丝孔挤入步骤s3得到的纳米氧化锌溶液中，牵伸，用95％乙醇处理纤维，离心脱去乙醇后烘干纤维，切割，梳理，成网，制成孔径为3μm的网状结构，即得。
实施例4、一种用于滤除白细胞的滤膜
所述用于滤除白细胞的滤膜由以下制备原料及其重量份数组成：
海藻酸钠160份、纳米氧化锌38份、壳寡糖22份和胺基木质素磺酸钠15份；所述纳米氧化锌为实施例1制备的纳米氧化锌，所述胺基木质素磺酸钠为实施例2制备的胺基木质素磺酸钠。
制备方法与实施例3类似。
实施例5、一种用于滤除白细胞的滤膜
所述用于滤除白细胞的滤膜由以下制备原料及其重量份数组成：
海藻酸钠200份、纳米氧化锌45份、壳寡糖25份和胺基木质素磺酸钠20份；所述纳米氧化锌为实施例1制备的纳米氧化锌，所述胺基木质素磺酸钠为实施例2制备的胺基木质素磺酸钠。
制备方法与实施例3类似。
对比例1、一种用于滤除白细胞的滤膜
所述用于滤除白细胞的滤膜由以下制备原料及其重量份数组成：
海藻酸钠160份、纳米氧化锌38份、壳寡糖22份和胺基木质素磺酸钠15份；所述纳米氧化锌为市售纳米氧化锌(购于北京德科岛金科技有限公司，zno30nm99.9％)，所述胺基木质素磺酸钠为实施例2制备的胺基木质素磺酸钠。
制备方法与实施例3类似。
对比例2、一种用于滤除白细胞的滤膜
所述用于滤除白细胞的滤膜由以下制备原料及其重量份数组成：
海藻酸钠160份、纳米氧化锌38份、壳聚糖22份和胺基木质素磺酸钠15份；所述纳米氧化锌为实施例1制备的纳米氧化锌，所述胺基木质素磺酸钠为实施例2制备的胺基木质素磺酸钠。
制备方法与实施例3类似。
与实施例4的区别在于：将壳寡糖替换为壳聚糖。
对比例3、一种用于滤除白细胞的滤膜
所述用于滤除白细胞的滤膜由以下制备原料及其重量份数组成：
海藻酸钠160份、纳米氧化锌38份、壳寡糖22份和丙烯酸-丙烯酸羟丙酯共聚物15份；所述纳米氧化锌为实施例1制备的纳米氧化锌。
制备方法与实施例3类似。
与实施例4的区别在于：将胺基木质素磺酸钠替换为丙烯酸-丙烯酸羟丙酯共聚物。
对比例4、一种用于滤除白细胞的滤膜
所述用于滤除白细胞的滤膜由以下制备原料及其重量份数组成：
海藻酸钠160份、纳米氧化锌38份、壳寡糖22份和木质素磺酸钠15份；所述纳米氧化锌为实施例1制备的纳米氧化锌。
制备方法与实施例3类似。
与实施例4的区别在于：将胺基木质素磺酸钠替换为木质素磺酸钠。
试验例一、用于滤除白细胞的滤膜的细胞滤过效果试验
1、试验材料：实施例3、实施例4、实施例5、对比例1、对比例2、对比例3和对比例4制备的用于滤除白细胞的滤膜。
2、试验方法：
将实施例3、实施例4、实施例5、对比例1、对比例2、对比例3和对比例4制备的用于滤除白细胞的滤膜对400ml全血进行在线过滤，评价白细胞滤膜除去白细胞和血小板的效果，采用血细胞计数仪测定过滤前、后全血中的白细胞和血小板数量，测得400ml全血中过滤前白细胞的数量为2.5×109，过滤前血小板的数量为8×1010。
其中剩余白细胞数的测定方法为：将过滤后的全血采样至聚乙烯制的试管中，以吖啶橙液将漏出的白细胞染色后，用荧光显微镜进行测定。将测定的白细胞浓度乘以回收的全血的液量，测得回收袋中所含的剩余白细胞数。
白细胞(血小板)滤除率(％)＝l0-l1/l0×100，其中l0为过滤前单位体积全血中含有的白细胞(血小板)数量，l1为过滤后单位体积全血中含有的白细胞(血小板)数量。
3、试验结果：
试验结果如表1所示。
表1用于滤除白细胞的滤膜对白细胞和血小板的滤除效果
由表1可知，本发明实施例3～5制备的用于滤除白细胞的滤膜对全血中的白细胞和血小板均具有较好的滤除效率，其中对白细胞的滤除率高达99.999％，对血小板的滤除率达94％以上，均显著优于经对比例1-4制备的用于滤除白细胞的滤膜对全血中的白细胞和血小板的滤除率，其滤除效果超过了第3代白细胞过滤器的要求。
试验例二、用于滤除白细胞的滤膜的滤孔堵塞性能检测试验
1、试验材料：实施例3、实施例4、实施例5、对比例1、对比例2、对比例3和对比例4制备的用于滤除白细胞的滤膜。
2、试验方法：
采用实施例3、实施例4、实施例5、对比例1、对比例2、对比例3和对比例4制备的用于滤除白细胞的滤膜对在库血存库中时间较长，经检测血液的高切黏度为4.8mpa.s，中切黏度为5.3mpa.s，低切黏度为10.5mpa.s，hct为0.43％，ai为2.34，ir为0.53的异常血液为检测样本，血液样本取样400ml，以400ml正常健康血液样本作为对照组，记录每次的血液过滤时间。
3、试验结果：
试验结果如表2所示。
表2过滤膜对全血的过滤时间
由表2可知，采用本发明实施例3～4制备得到的用于滤除白细胞的滤膜对400ml全血进行过滤只需要14～16min，说明本发明的提供的用于滤除白细胞的滤膜具有较好的亲水湿润性，有利于血液的过滤。同时，对于异常的血液样本的过滤时间为15～17min，与过滤正常血液的时间基本保持不变，而对比例1～4制备得到的用于滤除白细胞的滤膜过滤异常血液样本至少延长了一半以上的时间，甚至出现无法过滤的现象，说明本发明提供的用于滤除白细胞的滤膜中的自制纳米氧化锌、壳寡糖与胺化胺基木质素磺酸钠相互作用可以防止滤膜的孔径堵塞，缓解血液凝结现象，可以有效的扩大白细胞滤膜的使用范围。