本发明涉及中药提取物的技术领域，尤其涉及到一种对原小檗碱型生物碱富集纯化的方法，主要为溶剂调控下多糖基介质对于特定分子结构生物碱类分子的吸附与解吸附过程，并涉及到对于新型多糖基介质结构的设计与应用。
背景技术：
原小檗碱型生物碱(proberberine)是一类重要的季铵型生物碱分子，这类生物碱分子在自然界分布广泛，且种类众多。同时，这类生物碱分子的药理作用范围广，在镇痛、抗菌、抗疟、降糖、抗肿瘤等领域，都有着优异的药理活性。同时，在化学结构上，这类生物碱的母核可以归纳为两个异喹啉环所组成的四个六元环结构，化学性质较为稳定，易于制备及衍生物结构的合成。分子中异喹啉的存在使得分子具有一定的疏水特性，同时联结两个异喹啉结构的n原子，在这类分子中以季铵盐的形式存在，使得这类生物碱分子具有一定的亲水性。这些结构和化学性质上的特征，导致了这类生物碱分子在分离、富集、纯化的方法上有着十分显著的特点。
从结构上划分，中药或天然植物中含有的原小檗碱型生物碱主要包括小檗碱、原小檗碱、小檗红碱、巴马丁、药根碱、表小檗碱、非洲防己碱等，这其中以小檗碱的药理活性研究的最为透彻。研究表明，其具有较好的抗菌效果，且抗菌谱广，体外对多种革兰阳性菌均具抑菌作用，对流感病毒、阿米巴原虫、钩端螺旋体、某些皮肤真菌也有一定抑制作用。同时小檗碱主要存在于小檗属与黄连属植物中，在黄连、黄芩、黄柏、三棵针等中药用植物中均有着较高的含量分布。
一般的，在生物碱类分子的分离富集纯化过程中，层析介质的多为硅胶或者大孔吸附树脂，但两者对于生物碱类分子都有着较强的非特异性吸附，导致在精制过程中目标生物碱分子在精制过程中的损失很大，往往会造成产率的降低以及在组分分析过程中低含量组分的缺失。这些都是生物碱类分子，特别是原小檗碱型生物碱类分子精制过程中所不得不面对的问题。同时，大量的非特异性吸附的存在，也会使得层析介质的层析效率降低。另一方面，虽然离子交换型或含有离子交换模式的混合型多糖基介质被广泛的开发出来，并应用与层析纯化领域，但由于原小檗碱型生物碱中季铵结构的存在，因此若直接利用离子交换模式对这类分子进行吸附，后洗脱过程将会不可避免的用到高离子强度的洗脱条件，对于生产工艺中废液的处理过程将是非常不利的，在层析介质结构的选择上同样要引起特别的注意。
多糖基介质常常被用于凝胶层析工艺之中，其具有较为稳定的结构，可以在较宽的ph范围内得到使用，同时具有较为优良的机械性能，可适用于多次使用过程而不改变其本身的层析性质。1959年，第一种多糖基介质，交联葡聚糖被制备了出来，由此以后，琼脂糖、纤维素等多种多糖基质，被逐渐合成、制备出来，并作为介质应用于层析工艺之中。以琼脂糖为例，其在凝胶状态下，多糖分子链结构之间会形成较为稳定的多糖基骨架，经进一步的化学交联之后会形成较为稳定的含孔介质材料。这类结构骨架的亲水性和对于生物大分子良好的相容性，使得这类介质对蛋白质等生物大分子有着很好的纯化效果。同时，对于中药或其它天然植物的提取物，其含有大量的蛋白质、多糖和其它一些性质差异很大的化合物分子，在纯化过程往往需要具有有效富集、纯化能力的介质材料。所以，在中药或其它天然植物的提取物分离富集纯化领域，多糖基介质的应用具有良好的应用意义和现实情境。
因此，利用具有一定疏水性的多糖基介质的设计与应用，对于有效的富集纯化原小檗碱型生物碱这类具有很好水溶性的化合物分子，将很可能有效的提高这类药用分子在富集纯化过程中的总提取效率。为提供高品质、高纯度、高提取率的，标准统一、稳定的原小檗碱型生物碱有着重要的应用意义和经济价值，促进中药产业的标准化、规范化，有着极其重要的作用。
技术实现要素：
本发明针对前述问题，提出了有效富集纯化原小檗碱型生物碱的方法，并通过在溶剂调控下多糖基介质对于特定分子结构生物碱类分子的吸附与解吸附过程的控制，利用特定结构的多糖基介质实现了这一富集纯化过程。
本发明提出一种利用多糖基介质对原小檗碱型生物碱富集纯化的方法，利用多糖基介质，对于在液体状态下分散的原小檗碱型生物碱进行有效的吸附并洗脱。
本发明提出的所述富集纯化方法中，以非柱层析方式对原小檗碱型生物碱富集纯化，包括：
将多糖基介质与分散有原小檗碱型生物碱的液体充分混合；
静止待多糖基介质沉淀后，移去上层清液；
利用清洗液清洗所述多糖基介质，清洗液的清洗用量与多糖基介质体积比为0.1:1～100:1；
将清洗后的多糖基介质在洗脱液中浸泡冲洗，收集洗脱液。
本发明提出的所述富集纯化方法中，以柱层析方式对原小檗碱型生物碱富集纯化，包括：
将多糖基介质填充在直径为0.5mm至500mm的柱管中，经装填压实；
向柱管中加入分散有原小檗碱型生物碱的待富集纯化溶液；
加入流动相，流动相流速为0.1ml/min至100.0ml/min，紫外检测器检测波长为350nm至450nm，收集洗脱溶液。
本发明提出的所述富集纯化方法中，清洗液、洗脱液或流动相为水、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、乙二醇、甘油、乙醚、丙酮、甲基乙基酮、乙腈、n,n-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜中的一种或两种以上任意组合。
本发明提出的所述富集纯化方法中，浸泡冲洗时或流动相中进一步加入离子物质，其离子强度为0.1mmol/l至1mol/l之间。
本发明提出的所述富集纯化方法中，所述离子物质为甲酸、乙酸、三氟乙酸、硼酸、盐酸、硫酸、磷酸、氯化钠、氯化钾、氯化铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸铵、硫酸氢钠、硫酸氢钾、硫酸氢铵、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、三乙胺、二异丙基乙基胺、三羟甲基氨基甲烷中的一种或两种以上任意组合。
本发明提出的所述富集纯化方法中，多糖基介质的主要成分为纤维素、葡聚糖、琼脂糖、淀粉中的一种或两种以上任意组合，主要成分在总介质干粉中的所占比例为20％-100％；主要成分为葡聚糖时，不包括羟丙基葡聚糖介质；多糖基介质的形貌为球状、棒状、线型、网状、不规则形状中的一种，介质的特征尺寸为20纳米至500微米。
本发明提出的所述富集纯化方法中，所述多糖基介质的多糖为经过衍生化修饰，经过衍生化修饰的多糖修饰部分的分子结构为-x-cn-r型，其中x为氧原子、氮原子中的一种，x原子的一端与多糖结构相连，r为羟基、氨基、甲基中的一种或两种以上任意组合，cn为连结x与r之间的碳结构，n为碳结构中的碳原子的数目，n为0至20，碳结构中碳原子的键接方式为直线或非直线的支化结构。
与现有技术相比，本发明的有益效果：本发明将很可能有效的提高这类药用分子在富集纯化过程中的总提取效率。为提供高品质、高纯度、高提取率的，标准统一、稳定的原小檗碱型生物碱有着重要的应用意义和经济价值，促进中药产业的标准化、规范化，有着极其重要的作用。
具体实施方式
下面将对本发明提出的富集纯化方法进行更详细的描述，其中表示了本发明的优选实施例，应该理解本领域技术人员可以修改在此描述的本发明，而仍然实现本发明的有利效果。因此，下列描述应当被理解为对于本领域技术人员的广泛知道，而并不作为对本发明的限制。
发明中涉及到的多糖基介质的制备来源多糖原料是纤维素、葡聚糖、琼脂糖、淀粉等大分子多糖分子，这类分子本身不含电荷，且来源广泛，制备过程较为成熟。多糖分子在经过一定的化学交联后会获得较好的机械性能，可以有稳定的形貌和一定的抗压能力，利于标准化制备以及柱层析方面的应用。
为了进一步提高多糖基介质的机械性能，除交联剂外，介质中还可以含有一定的其它组分成分，如两种或两种以上多糖混合(以琼脂糖/葡聚糖为例)，或加入其它成分材料(如聚酰胺、聚乙烯醇、聚丙烯酸等)，但总体上多糖组分在总介质中所占的比例为在20％-100％之间，优选在60％-100％之间。
多糖基介质的形貌受到制备方法的影响，并进一步会影响富集纯化过程的操作模式，由于多糖分子在水溶液中往往拥有较好的溶解性，因此加工及对形貌的控制是较为易于实现的。球状、棒状、线型、网状及不规则形状均可在制备过程中实现，考虑凝胶化和胶束化等过程为多糖基介质制备中较常涉及到的方法，而这些方法中球状结构较为稳定，这里以球状为优选。
在非柱层析的条件下，介质对原小檗碱型生物碱的富集和洗脱过程对介质的特征尺寸无特殊要求，但考虑多糖基介质的制备现状，介质的特征尺寸在20纳米至500微米之间。
在柱层析的条件下，工作压力与介质的特征尺寸有着十分密切的关系，由于多糖基介质对于高压的工作条件并不适用，考虑正常在中压或常压到中压之间的工作眼里范围下工作，因此介质的特征尺寸在20纳米至500微米之间，优选1微米至100微米的范围。
多糖基介质本身具有大量羟基，可进行进一步的化学修饰，实现多种特征化学基团的修饰。羟基、氨基及等其它基团在修饰介质的同时，会将一些疏水化基团进入到修饰结构之中，有利于在水中或水/醇混合物中将原小檗碱型生物碱有效的吸附富集，因此对多糖基介质的结构提出如下要求：
多糖基介质主要成分中多糖为经过衍生化修饰或未经修饰，经过衍生化修饰的多糖修饰部分的分子结构为-x-cn-r型，其中x为氧原子、氮原子中的一种，x原子的一端与多糖结构相连，r为羟基、氨基、甲基中的一种或几种，cn为连结x与r之间的碳结构，n为碳结构中的碳原子的数目，n为0至20，碳结构中碳原子的键接方式为直线或非直线的支化结构。
多糖基介质在使用之前应经过溶液的充分浸泡，活化介质，因此在使用时，介质的称取以体积为剂量标准，单位为ml或l。
本发明中所描述的原小檗碱型生物碱，涉及到从中药或其它天然植物中所提取的产物，如小檗碱、原小檗碱、小檗红碱、巴马丁、药根碱、表小檗碱、非洲防己碱，以及以二异喹啉季铵盐结构为母核，经过衍生化或化学改性得到的其它衍生物，但优选小檗碱、原小檗碱、小檗红碱、巴马丁、药根碱、表小檗碱、非洲防己碱等天然来源化合物进行富集纯化。
原小檗碱型生物碱应在液相条件下进行进一步的富集纯化，考虑原小檗碱型生物碱在纯水溶液中的溶解性较差，因此在原小檗碱型生物碱分散时，液相的选择可以是纯水或水与其它极性溶剂的混合液。其它极性溶液可以是甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、乙二醇、甘油、乙醚、丙酮、甲基乙基酮、乙腈、n,n-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜中的一种或几种，优选水、乙醇或两者以任意比例混合的混合溶液。
在非柱层析的工艺条件下，原小檗碱型生物碱在液相中的分散后，可以以溶液或悬浊液的形式存在，分散的浓度为0.01mg/ml至50mg/ml，优选0.01mg/ml至20mg/ml。
在非柱层析的工艺条件下，多糖基介质的用量为0.01ml/(ml液体体积)至10ml/(ml液体体积)，优选用量为0.1ml/(ml液体体积)至2ml/(ml液体体积)。
在柱层析的工艺条件下，原小檗碱型生物碱在液相中的分散后，应以澄清溶液的形式存在，分散的浓度为0.01mg/ml至50mg/ml，优选0.01mg/ml至5mg/ml。
在柱层析的工艺条件下，多糖基介质的用量为0.01ml/(ml液体体积)至10ml/(ml液体体积)，优选用量为0.5ml/(ml液体体积)至2ml/(ml液体体积)。
对于非柱层析的方法，本发明以混合浸泡的方法为主要描述主体。即在液相状态下，将多糖基介质与原小檗碱型生物碱按照前述比例，在一定的比例范围内充分混合。混合后原小檗碱型生物碱将在液相与多糖基介质之间发生重新分配。由于本发明中的所描述的多糖基介质经过了一定的疏水化处理，因此原小檗碱型生物碱在重新分配的过程中将会向多糖基介质部分富集。此时移去上层的液相，加入少量清洗液对多糖基介质进行清洗。清洗液可以为水、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、乙二醇、甘油、乙醚、丙酮、甲基乙基酮、乙腈、n,n-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜中的一种或几种，但优选水。清洗过程可以将以非吸附作用分散在多糖基介质部分的非原小檗碱型生物碱物质移除。之后，采用具有一定疏水脂溶性的溶剂对多糖基介质中的原小檗碱型生物碱进行洗脱。洗脱液可以为水、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、乙二醇、甘油、乙醚、丙酮、甲基乙基酮、乙腈、n,n-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜中的一种或几种，优选甲醇、乙醇、乙腈及以上三种溶剂的混合物。由于原小檗碱型生物碱中含有季铵正离子结构，因此在洗脱过程中可加入一定离子强度的物质，抵消离子交换作用对原小檗碱型生物碱在多糖基介质中吸附作用的影响，提高洗脱效率。一定量的离子，离子强度为0.1mmol/l至1mol/l之间，具有离子强度的物质为甲酸、乙酸、三氟乙酸、硼酸、盐酸、硫酸、磷酸、氯化钠、氯化钾、氯化铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸铵、硫酸氢钠、硫酸氢钾、硫酸氢铵、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、三乙胺、二异丙基乙基胺、三羟甲基氨基甲烷中的一种或几种，优选磷酸二氢钠、磷酸二氢钾，离子强度优选为0.01mol/l至0.1mol/l。
洗脱液中的原小檗碱型生物碱的浓度与纯度采用hplc进行分析，分析方法为采用反相色谱进行分析，色谱柱填料为c18，流动相：乙腈、ph为6.4的乙酸/三乙胺水溶液，洗脱梯度：0-15min20％乙腈，16-25min21％-29％乙腈，26-35min30％-55％乙腈，36-45min56％-70％乙腈，46-70min71％-80％乙腈，检测波长为282nm，进样量：10微升，流速：1.0ml/min，柱温30摄氏度。
对于柱层析方法，本发明所描述的方法集中于，将多糖基介质装填至柱层析柱管中，柱管直径为0.5mm至500mm，优选10mm至50mm。介质经装填压实后，为了保证有效的富集纯化效果，介质装填高度应保证在30mm以上。采用手动或色谱仪自动上样的方式将含有原小檗碱型生物碱的澄清溶液加入到层析柱中。洗脱液的选择与之前所描述的非柱层析法相同。
洗脱液中的原小檗碱型生物碱的浓度与纯度采用hplc进行分析，分析方法与之前所描述的过程相同。
对比经多糖基介质富集纯化前后的样品，利用hplc分析的结果对浓度进行对比，得到富集比例，并利用富集纯化后的hplc谱图计算富集纯化后的纯度。
经本发明中所描述的富集纯化方法得到的原小檗碱型生物碱要求其浓度为原有浓度的2.0倍至20.0倍，纯度为25.00％至99.99％。原小檗碱型生物碱的来源为天然植物经提取处理后的提取液或经过化学合成的产物，为小檗碱、原小檗碱、小檗红碱、巴马丁、药根碱、表小檗碱、非洲防己碱及其它满足：
其中r2、r3、r9、r10分别为氢原子、羟基、甲氧基、乙氧基中的一种或几种结构的分子中的一种或多种。
实施例1：
多糖基介质选用羟丙基修饰的琼脂糖微球。将保存在20％乙醇水溶液中的琼脂糖微球重新分散在水中，取1ml琼脂糖微球。配置含有小檗碱样品的水溶液，浓度为0.1mg/ml，取5ml作为待富集纯化溶液。将待富集纯化溶剂与琼脂糖微球混合，经过震荡、超声，使两者充分混合，后静置。待琼脂糖微球完全沉淀后，将上层清液移去。向琼脂糖微球中加入5ml水，震荡清洗后静置，移去清洗用的水。将琼脂糖微球转移到层析柱中，静置压实。加入2ml乙醇作为洗脱液，进行洗脱。洗脱液利用hplc进行含量和纯度的分析。
实施例2：
多糖基介质选用未经化学修饰的葡聚糖微球。将葡聚糖微球粉末在水中充分溶胀，取1ml葡聚糖微球。配置含有小檗碱样品的水溶液，浓度为0.1mg/ml，取5ml作为待富集纯化溶液。将待富集纯化溶剂与葡聚糖微球混合，经过震荡、超声，使两者充分混合，后静置。待葡聚糖微球完全沉淀后，将上层清液移去。向葡聚糖微球中加入5ml水，震荡清洗后静置，移去清洗用的水。将葡聚糖微球转移到层析柱中，静置压实。加入2ml乙醇作为洗脱液，进行洗脱。洗脱液利用hplc进行含量和纯度的分析。
实施例3：
多糖基介质选用羟基异丁基修饰的琼脂糖微球。将保存在20％乙醇水溶液中的琼脂糖微球重新分散在水中，取1ml琼脂糖微球。配置含有原小檗碱样品的水溶液，浓度为0.1mg/ml，取5ml作为待富集纯化溶液。将待富集纯化溶剂与琼脂糖微球混合，经过震荡、超声，使两者充分混合，后静置。待琼脂糖微球完全沉淀后，将上层清液移去。向琼脂糖微球中加入5ml水，震荡清洗后静置，移去清洗用的水。将琼脂糖微球转移到层析柱中，静置压实。加入2ml乙醇作为洗脱液，进行洗脱。洗脱液利用hplc进行含量和纯度的分析。
实施例4：
多糖基介质选用羟基异丁基修饰的琼脂糖微球。将保存在20％乙醇水溶液中的琼脂糖微球重新分散在水中，取1ml琼脂糖微球。待富集纯化的样品为，以药根碱为原料，经过成醚反应得到的原小檗碱类母核的新型衍生物。将含有待富集纯化的样品配置为0.1mg/ml的水溶液，取5ml作为待富集纯化溶液。将待富集纯化溶剂与琼脂糖微球混合，经过震荡、超声，使两者充分混合，后静置。待琼脂糖微球完全沉淀后，将上层清液移去。向琼脂糖微球中加入5ml水，震荡清洗后静置，移去清洗用的水。将琼脂糖微球转移到层析柱中，静置压实。加入2ml乙醇作为洗脱液，进行洗脱。洗脱液利用hplc进行含量和纯度的分析。
实施例5：
多糖基介质选用羟丙基修饰的琼脂糖微球。将保存在20％乙醇水溶液中的琼脂糖微球重新分散在水中，取20ml琼脂糖微球。将琼脂糖微球利用装柱器装填在axichrom16*100mm层析柱中，装填结束后将层析柱安装在aktapurifier蛋白纯化系统上。配置含有小檗碱样品的水溶液，浓度为0.1mg/ml，取50ml作为待富集纯化溶液。利用aktapurifier自动上样系统进行上样。以2ml/min的上样速度将待富集纯化溶液加入到层析柱中。上样结束后，以2ml/min的流速，加入20ml水溶液进行淋洗。淋洗结束后，以2ml/min的流速，加入10ml乙醇，进行洗脱。洗脱液利用hplc进行含量和纯度的分析。
实施例6：洗脱液中羟基红花黄色素a的分析方法。采用反相色谱进行分析，色谱仪为agilent1260，色谱柱为agilenthc-c18，流动相：乙腈、ph为6.4的乙酸/三乙胺水溶液，洗脱梯度：0-15min20％乙腈，16-25min21％-29％乙腈，26-35min30％-55％乙腈，36-45min56％-70％乙腈，46-70min71％-80％乙腈，检测波长为282nm，进样量：10微升，流速：1.0ml/min，柱温30摄氏度。
上述仅为本发明的优选实施例而已，并不对本发明起到任何限制作用。任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的技术方案的范围内，对本发明揭露的技术方案和技术内容做任何形式的等同替换或修改等变动，均属未脱离本发明的技术方案的内容，仍属于本发明的保护范围之内。