使用致动的表面附接柱来处理细胞的系统、流体盒及方法与流程
本公开的标的物总体上涉及多种生物材料的处理，并且特别涉及用于使用致动的多个表面附接柱处理多个细胞的系统、流体盒和方法。
背景技术：
现今，用于生物分析，通过离心洗涤多个细胞。例如，可以在离心机中离心10毫升样品以形成细胞沉淀。然后除去上清液，并用其他液体代替。所述过程可以重复多次，取决于所需的背景流体的纯度。然而，现有通过离心洗涤细胞存在多个缺点。例如，通过离心的重复多个洗涤周期是劳动密集的过程，因此成本很高。主要是因为离心过程必须由技术人员进行连续监控。此外，离心过程容易出现其他问题，例如在移液时损失细胞。另外，通过反复洗涤，细胞沉淀会越来越难于保持紧密，因此细胞会损失。
技术实现要素：
在一个实施例中，提供一种细胞处理系统，所述细胞处理系统包含：
一流体盒，包含：
一细胞处理腔室，包含一底部基板及一顶部基板，所述底部基板及所述顶部基板由一间隙分隔开，其中所述细胞处理腔室还包含一微柱阵列，所述微柱阵列包含多个表面附接的微柱布置在一微柱基板上，及所述微柱基板位于所述底部基板上；以及
一控制仪器；
其中所述多个表面附接柱被配置用以在存在一致动力的情况下致动；其中没有多个粘合剂被设置在所述多个表面附接柱、所述底部基板、所述顶部基板或所述微柱基板上，或与所述多个表面附接柱、所述底部基板、所述顶部基板或所述微柱基板一体成形；及其中所述底部基板和所述顶部基板被布置在一对准部件上，所述对准部件被配置用以安装在所述控制仪器上。
在一些实施例中，所述流体盒还包含一个或多个样品存储器、一个或多个洗涤存储器、一个或多个供应细胞处理腔室、一个或多个废料存储器以及一个或多个洗脱液存储器，所述一个或多个样品存储器、所述一个或多个洗涤存储器、所述一个或多个供应细胞处理腔室、所述一个或多个废料存储器以及所述一个或多个洗脱液存储器通过多个流体通道的一布置而流体连接到所述细胞处理腔室。
在一些实施例中，在所述多个流体通道中的每一个提供一流体控制端口。
在一些实施例中，所述一个或多个样品存储器、所述一个或多个洗涤存储器、所述一个或多个供应细胞处理腔室、所述一个或多个废料存储器以及所述一个或多个洗脱液存储器中的每一个包含一入口及一出口。
在一些实施例中，一流体控制端口设置在所述样品存储器的所述出口处，一流体控制端口设置在所述洗涤存储器的所述出口处，一流体控制端口设置在所述废料存储器的所述入口处，及一流体控制端口设置在所述洗脱液存储器的所述入口处。
在一些实施例中，所述多个流体控制端口包含多个夹阀。
在一些实施例中，一第一泵浦流体连接至所述样品存储器，及一第二泵浦流体连接至所述洗涤存储器。
在一些实施例中，所述第一泵浦及所述第二泵浦能够向所述细胞处理腔室供应一正压及一负压。
在一些实施例中，所述样品存储器、所述洗涤存储器、所述废料存储器及所述洗脱液存储器中的一个或多个包含多个密封件，所述多个密封件可透气但不可透液体。
在一些实施例中，所述控制仪器包含一基座，所述基座容纳：用于向所述多个微柱提供一个或多个致动力的一个或多个机构；用于在所述细胞处理腔室中计数多个细胞的一个或多个机构；用于泵送及控制所述流体盒中的多个流体的一个或多个气动装置；以及一控制器。
在一些实施例中，所述致动力选自由以下组成的群组：一磁场、一热场、一声场、一光场、一电场及一振动场。
在一些实施例中，所述控制仪器包含一平台，所述平台配置用以与所述流体盒相连接。
在一些实施例中，所述平台包含多个流体控制端口，所述多个流体控制端口定位成相对应于所述流体盒的所述多个流体通道。
在一些实施例中，所述多个流体控制端口中的每个包含一阀门机构。
在一些实施例中，所述阀门机构是一夹阀。
在一些实施例中，所述平台还包含一光学窗口，所述光学窗口与所述流体盒的所述细胞处理腔室基本上相对准。
在一些实施例中，用于对所述细胞处理腔室中计数多个细胞的所述一个或多个机构是一光学成像系统。在一些实施例中，用于对所述细胞处理腔室中计数多个细胞的所述一个或多个机构包含电阻的测量、流式细胞仪、图像分析、分光光度法、多个荧光标记的细胞的荧光检测或其组合。在一些实施例中，所述细胞处理系统是一独立式设备。
在一些实施例中，所述细胞处理系统还包含用于处理多个生物材料的一自动化机器人系统。在一些实施例中，用于处理所述多个生物材料的所述自动化机器人系统包含一多孔板。在一些实施例中，所述多孔板选自由以下组成的群组：一12孔板、一24孔板及一96孔板。在一些实施例中，所述流体盒的所述对准部件的多个尺寸基本上对应于所述多孔板的多个尺寸。在一些实施例中，用于处理所述多个生物材料的所述自动化机器人系统还包含：一个或多个吸移器，用于处理来自所述多孔板的多个流体。在一些实施例中，用于处理所述多个生物材料的所述自动化机器人系统还包含：一吸移器，用于处理来自所述流体盒的所述洗脱液存储器的多个流体。
在一些实施例中，所述多个微柱由聚二甲基硅氧烷(pdms)形成。在一些实施例中，所述多个微柱的一长度范围为约1微米至约100微米。在一些实施例中，所述多个微柱的一直径范围为约0.1微米至约10微米。在一些实施例中，所述多个微柱具有一横截面形状选自由以下组成的群组：圆形、卵形、正方形、矩形及三角形。在一些实施例中，所述多个微柱被定向为基本上与所述基板的一平面正交。在一些实施例中，所述多个微柱相对于所述基板的一平面的一法线以一角度α定向。在一些实施例中，所述多个微柱以约0微米至约50微米的一间距进行取向。
在一些实施例中，所述细胞处理系统还包含：一控制器，能够执行多个程序指令。在一些实施例中，所述细胞处理系统还包含一用户界面。在一些实施例中，所述细胞处理系统还包含一通信接口。在一些实施例中，所述细胞处理系统还包含一电源。
在一些实施例中，提供一种用于处理多个细胞的方法，包含使用如本文所述的任何细胞处理系统，所述方法包含以下步骤：
(a)将一样本流体引入所述样品存储器，其中所述样本流体包含多个细胞，及所述多个细胞悬浮在所述样本流体中；
(b)使所述样本流体流入所述细胞处理腔室；
(c)使悬浮在所述样本流体中的所述多个细胞沉淀到所述多个表面附接的微柱间的所述微柱基板上，其中没有致动力施加到所述多个表面附接的微柱；
(d)执行一细胞洗涤周期，所述细胞洗涤周期包含使一洗涤缓冲液从所述洗涤存储器流出，通过所述细胞处理腔室并进入所述废料存储器，其中所述多个细胞保持沉淀在所述多个表面附接的微柱间的所述微柱基板上，且没有致动力施加到所述多个表面附接的微柱上；
(e)根据需要重复步骤(d)，以洗涤沉淀在所述多个表面附接的微柱间的所述微柱基板上的所述多个细胞；
(f)执行一细胞回收周期，所述细胞回收周期包含使一洗涤缓冲液流过所述细胞处理腔室，其中多个致动力被施加到所述多个表面附接的微柱，以使所述多个细胞重新悬浮到流动中的所述洗涤缓冲液中，从而产生一含细胞的洗脱液；以及
(g)使所述含细胞的洗脱液流入所述洗脱液存储器中。
在一些实施例中，提供一种用于处理多个细胞的方法，包含使用如本文所述的任何细胞处理系统，所述方法包含以下步骤：
(a)将一样本流体引入所述样品存储器，其中所述样本流体包含多个细胞，及所述多个细胞悬浮在所述样本流体中；
(b)在所述多个表面附接的微柱被致动的同时使所述样本流体流入到所述细胞处理腔室中，其中所述样本流体以一足够慢的速率流动，以致所述多个细胞不会被推出所述细胞处理腔室；
(c)执行一细胞洗涤周期，所述细胞洗涤周期包含步骤：将一洗涤缓冲液从所述洗涤存储器中流出而进入到所述细胞处理腔室中，其中多个致动力被施加到所述多个表面附接的微柱，及所述洗涤缓冲液是以一足够慢的速度流动，以致所述多个细胞不会被推出所述细胞处理腔室；
(d)执行一细胞培养周期，所述细胞培养周期包含步骤：使一细胞培养基从一细胞培养基存储器流出而进入到所述细胞处理腔室中，其中所述多个致动力被施加到所述多个表面附接的微柱，及所述细胞培养基以足够慢的速度流动，以致所述多个细胞不会被推出所述细胞处理腔室；
(e)执行一细胞回收周期，所述细胞回收周期包含步骤：使所述洗涤缓冲液流过所述细胞处理腔室，其中所述多个致动力被施加到所述多个表面附接的微柱，及所述洗涤缓冲液以一足够快的速率流动，以致所所述多个细胞没有被从所述细胞处理腔室中推出；以及
(f)将一含细胞的洗脱液流入到所述洗脱液存储器中。在一些实施例中，所述的方法还包含以下步骤：以一细胞计数机构执行一细胞计数操作，以确定在所述细胞处理腔室中的所述多个细胞的一数量，其中所述细胞计数操作在所述细胞回收周期步骤之前进行。
在一些实施例中，提供一种用于处理多个细胞的方法，包含使用如本文所述的任何细胞处理系统，所述方法包含以下步骤，包含以下步骤：
(a)将一样本流体引入所述样品存储器，其中所述样本流体包含多个细胞，及所述多个细胞悬浮在所述样本流体中；
(b)使所述样本流体流入所述细胞处理腔室；
(c)使悬浮在所述样本流体中的所述多个细胞沉淀到所述多个表面附接的微柱间的所述微柱基板上，其中没有致动力施加到所述多个表面附接的微柱；
(d)执行一细胞洗涤周期，所述细胞洗涤周期包含使一洗涤缓冲液从所述洗涤存储器流出，通过所述细胞处理腔室并进入所述废料存储器，其中所述多个细胞保持沉淀在所述多个表面附接的微柱间的所述微柱基板上，且没有致动力施加到所述多个表面附接的微柱上；
(e)根据需要重复步骤(d)，以洗涤沉淀在所述多个表面附接的微柱间的所述微柱基板上的所述多个细胞；
(f)在所述多个微柱未被致动的情况下，通过使一细胞培养基流入所述细胞处理腔室中来执行一细胞培养周期，并提供细胞生长、扩增和维持所需的时间和多个条件；
(g)执行一细胞回收周期，所述细胞回收周期包含使一洗涤缓冲液流过所述细胞处理腔室，其中多个致动力被施加到所述多个表面附接的微柱，以使所述多个细胞重新悬浮到流动中的所述洗涤缓冲液中，从而产生一含细胞的洗脱液；以及
(h)使所述含细胞的洗脱液流入所述洗脱液存储器中。在一些实施例中，所述的方法还包含以下步骤：以一细胞计数机构执行一细胞计数操作，以确定在所述细胞处理腔室中的所述多个细胞的一数量，其中所述细胞计数操作在所述细胞回收周期步骤之前进行。
在一些实施例中，提供一种用于处理多个细胞的方法，包含使用如本文所述的任何细胞处理系统，所述方法包含以下步骤：
(a)将一样本流体引入所述样品存储器，其中所述样本流体包含多个细胞，及所述多个细胞悬浮在所述样本流体中；
(b)使所述样本流体流入所述细胞处理腔室；
(c)使悬浮在所述样本流体中的所述多个细胞沉淀到所述多个表面附接的微柱间的所述微柱基板上，其中没有致动力施加到所述多个表面附接的微柱；
(d)执行一细胞洗涤周期，所述细胞洗涤周期包含使一洗涤缓冲液从所述洗涤存储器流出，通过所述细胞处理腔室并进入所述废料存储器，其中所述多个细胞保持沉淀在所述多个表面附接的微柱间的所述微柱基板上，且没有致动力施加到所述多个表面附接的微柱上；
(e)根据需要重复步骤(d)，以洗涤沉淀在所述多个表面附接的微柱间的所述微柱基板上的所述多个细胞；
(f)以一细胞计数机构执行一细胞计数操作，以确定在所述细胞处理腔室中的所述多个细胞的一数量；
(g)执行一细胞回收周期，所述细胞回收周期包含使一洗涤缓冲液流过所述细胞处理腔室，其中多个致动力被施加到所述多个表面附接的微柱，以使所述多个细胞重新悬浮到流动中的所述洗涤缓冲液中，从而产生一含细胞的洗脱液；以及
(h)使所述含细胞的洗脱液流入到所述洗脱液存储器中。
在一些实施例中，提供一种用于处理多个细胞的方法，包含使用如本文所述的任何细胞处理系统，所述方法包含以下步骤：
(a)将一样本流体引入所述样品存储器，其中所述样本流体包含多个细胞，及所述多个细胞悬浮在所述样本流体中；
(b)使所述样本流体流入所述细胞处理腔室；
(c)使悬浮在所述样本流体中的所述多个细胞沉淀到所述多个表面附接的微柱间的所述微柱基板上，其中没有致动力施加到所述多个表面附接的微柱；
(d)进行一细胞溶解周期，其中多个致动力被施加到所述多个表面附接的微柱，以通过所述多个表面附接的微柱产生一拍击运动，从而产生一溶解的含细胞洗脱液；以及
(e)使含有所述被溶解的含细胞洗脱液流入所述洗脱液存储器中。
在一些实施例中，提供一种用于处理多个细胞的方法，包含使用如本文所述的任何细胞处理系统，所述方法包含以下步骤：
(a)将一样本流体引入所述样品存储器，其中所述样本流体包含多个细胞，及所述多个细胞悬浮在所述样本流体中；
(b)在所述多个表面附接的微柱被致动的同时使所述样本流体流入到所述细胞处理腔室中，其中所述样本流体以一足够慢的速率流动，以致所述多个细胞不会被推出所述细胞处理腔室；
(c)执行一细胞洗涤周期，所述细胞洗涤周期包含步骤：将一洗涤缓冲液从所述洗涤存储器中流出而进入到所述细胞处理腔室中，其中多个致动力被施加到所述多个表面附接的微柱，及所述洗涤缓冲液是以一足够慢的速度流动，以致所述多个细胞不会被推出所述细胞处理腔室；
(d)执行一细胞回收周期，所述细胞回收周期包含步骤：使所述洗涤缓冲液流过所述细胞处理腔室，其中所述多个致动力被施加到所述多个表面附接的微柱，及所述洗涤缓冲液以一足够快的速率流动，以致所所述多个细胞没有被从所述细胞处理腔室中推出；以及
(f)将一含细胞的洗脱液流入到所述洗脱液存储器中。
在一些实施例中，在本公开的方法内，所述样品流体包含多个细胞，所述多个细胞包含多个细胞团块，其中包含所述多个细胞团块的所述多个细胞悬浮在所述样品流体中，及所述步骤(b)还包含：向所述多个表面附接的微柱施加多个致动力，以破碎所述多个细胞团块。
在一些实施例中，在本公开的方法内，在所述步骤(a)之前，通过一细胞浓缩程序产生所述样品流体，所述细胞浓缩程序包含将包含多个细胞的一样品离心以产生一沉淀细胞，然后在一溶液中通过将所述沉淀细胞中的多个细胞重新悬浮以产生所述样本流体。
在一些实施例中，在本文所述任何的细胞处理系统还包含：一微阵列，所述微阵列在所述顶部基板上与所述多个微柱相对立，其中所述微阵列以多个分析物捕获元件功能化。
在一些实施例中，提供了用于处理多个细胞的多个方法，所述方法包含：使用如此细胞处理系统，及包含以下步骤：
(a)将一样本流体引入所述样品存储器，其中所述样本流体包含多个细胞，及所述多个细胞悬浮在所述样本流体中；
(b)使所述样本流体流入所述细胞处理腔室；
(c)使悬浮在所述样本流体中的所述多个细胞沉淀到所述多个表面附接的微柱间的所述微柱基板上，其中没有致动力施加到所述多个表面附接的微柱；
(d)使一溶解缓冲液流入到所述细胞处理腔室中，从而产生多个溶解的细胞和多个分析物；以及
(e)施加多个致动力到所述多个表面附接的微柱，以将所述多个溶解的细胞与所述多个分析物在所述细胞处理腔室中混合，其中所述多个分析物与所述微阵列的所述多个分析物捕获元件结合。
在一些实施例中，本文所述的处理系统，其特征在于，所述细胞处理系统还包含一细胞浓缩模块。
在其他的实施例中，提供了用于处理细胞的多个方法，包含使用此细胞处理系统，所述方法包含以下步骤：
(a)将一样本流体引入所述样品存储器，其中所述样本流体包含多个细胞，及所述多个细胞悬浮在所述样本流体中；
(b)使所述样本流体流入到所述细胞浓缩模块中并执行一细胞浓缩程序，以产生一浓缩的样本流体；以及
(c)使所述浓缩的样品流体流入到所述细胞处理腔室中用于进一步处理。
在一些实施例中，本文所述的处理系统更包含一微柱阵列，所述微柱阵列包含一流动路径，所述流动路径是通过不存在所述多个微柱而形成的。
在一些实施例中，所述流动路径的至少一些部分是弯曲的，及被配置用以在多个弯曲处的外部聚集多个细胞，使得所述多个细胞沉淀及/或被推入到所述多个微柱中。
在一些实施例中，所述流动路径是蛇形的。
在一些实施例中，所述流动路径是螺旋形的。
在其他实施例中，提供了用于制造这些细胞处理系统的多个方法，所述方法包含以下步骤：以一高排列密度制造所述微柱阵列，及使用一工具压碎不需要的多个微柱以形成所述流动路径。
在一些实施例中，本文所述的处理系统更包含一微柱阵列，所述微柱阵列包含：多个微柱屏障的多个布置，被配置用以捕获多个细胞，使得所述多个细胞沉淀及/或被推入到所述多个微柱中。在其他实施例中，所述多个微柱屏障是弧形、u形、v形或条形。
在一些实施例中，本文所述的处理系统还包含：多个部件，位在所述顶部基板上与所述多个微柱相对立，其中所述多个部件被配置用以帮助多个细胞从溶液中沉淀出来及/或促进微流体细胞分离。在其他实施例中，所述多个部件以一人字形配置方式布置。
在一些实施例中，本文所述的处理系统还包含还包含一个或多个电极，所述一个或多个电极设置在所述底部基板中、设置在所述顶部基板中，或设置在所述底部基板及所述顶部基板两者中。
通过以下详细描述，本发明的其他目的、特征和优点将变得明白易懂。然而，应该理解的是，详细说明和特定示例在指示本发明的优选实施例的同时，根据本详细描述，本发明的范围和精神内的各种改变和修改对于本领域技术人员而言将是显而易见的，因此仅通过举例说明的方式示出本发明。
附图说明
通过以下结合附图的描述，将更清楚地理解本发明的特征和优点，附图并不一定按比例绘制，其中：
图1示出了本公开的细胞处理系统的一个示例的透视图，其使用致动的多个表面附接柱来处理多个细胞；
图2示出了本公开的细胞处理系统的分解透视图；
图3示出了本公开的细胞处理系统的一流体盒与一标准96孔板的尺寸相关性的透视图；
图4示出了本公开的细胞处理系统的一细胞处理腔室的一部分的侧视图，其中，所述细胞处理腔室包含一微柱阵列；
图5a和图5b示出了本公开的细胞处理系统的所述细胞处理腔室的多个微柱的一个示例的侧视图；
图6a至图6e示出了微柱阵列的一个示例的平面图；
图7a和图7b示出了一微柱的侧视图，并示出了所述微柱致动运动的一个示例；
图8a、图8b和图8c示出了本公开的细胞处理系统的所述细胞处理腔室，以及使用所述微柱阵列收集、洗涤和回收多个细胞的程序的侧视图；
图9示出了本公开的细胞处理系统的一个示例的方框图；
图10示出了使用本公开的细胞处理系统来收集、洗涤和回收多个细胞的方法的一个示例的流程图；
图11示出了使用本公开的细胞处理系统以一预定密度收集、洗涤、计数和回收多个细胞的方法的一个示例的流程图；
图12示出了本公开的细胞处理系统的所述流体盒进一步包含一细胞浓缩模块的一个示例的透视图；
图13和图14示出了在所述微柱阵列中形成的流动路径的一个示例的平面图，其中所述流动路径被设计为收集多个细胞；
图15a和图15b示出了用于捕获多个细胞的示例性微柱构造的平面图；
图16a和图16b示出了所述细胞处理腔室的构造，所述细胞处理腔室包含用于辅助多个细胞从溶液中沉淀出来的多个部件(feature)；
图17示出了所述细胞处理腔室的另一种配置，所述细胞处理腔室包含用于辅助多个细胞从溶液中沉淀出来的多个部件；
图18示出了使用本公开的细胞处理系统来收集、洗涤和回收多个细胞的另一种方法的一个示例的流程图；
图19示出了使用本公开的细胞处理系统来收集、洗涤、培养和回收多个细胞的方法的一个示例的流程图；
图20示出了使用本公开的细胞处理系统来收集、洗涤、培养、计数和回收多个细胞的方法的一个示例的流程图；及
图21示出了使用本公开的细胞处理系统来收集、洗涤、培养、计数和回收多个细胞的方法的一个示例的流程图。
具体实施方式
现在将在下文中参考附图更全面地描述本公开的主题，在附图中示出了本公开的主题的一些但不是全部实施例。贯穿全文，相同的数字表示相同的元件。本公开的主题可以以许多不同的形式来示例，并且不应该被解释为限于在此阐述的实施例。相反地，提供这些实施例是为了使本公开满足适用的法律要求。事实上，本领域技术人员将想到本文中所述的本公开主题的许多修改和其他实施例，本公开的主题所属的主题受益于前述描述和相关附图中呈现的教导。因此，应当理解，本公开的主题不限于所公开的特定实施例，并且修改和其他实施例旨在被包括在所附权利要求的范围内。
在一些实施例中，本发明提供了一种使用致动的多个表面附接柱以处理细胞的细胞处理系统、流体盒及方法。所述细胞处理系统、流体盒和方法提供了处理多个细胞的多个方式，这些方式(1)不涉及结合(binding)，(2)依赖射流技术。可以使用本公开的细胞处理系统、流体盒和方法执行的过程的示例包括但不限于细胞浓度、细胞收集、细胞过滤、细胞洗涤、细胞计数、细胞回收、细胞溶解、细胞解聚等。特别地，本公开的细胞处理系统、流体盒和方法非常适合于样品制备过程。
在一些实施例中，本公开的细胞处理系统包括一流体盒，位于一控制仪器的顶部。所述流体盒包括：一细胞处理腔室，具有一微柱阵列；一样品存储器和一洗涤存储器，向所述细胞处理腔室进行供应；以及，一废料存储器及一洗脱液存储器，位在所述细胞处理腔室的一输出处。在其他实施例中，所述流体盒可以包括多个样品存储器，多个洗涤存储器，多个废料存储器和多个洗脱液存储器。在其他实施例中，在流体盒中，一细胞浓缩模块可以设置在所述细胞处理腔室之前(即，上游)。
所述细胞处理装置使用多个表面附接的微柱的一阵列(例如，一微柱阵列)。如本文所用，术语“表面附接的柱”或“表面附接的微柱”或“表面附接的结构”可互换使用。通常，一表面附接的结构具有两个相对的端部：一固定端和一自由端。所述固定端可以通过任何合适的方式附接到一基板，取决于制造技术和所使用的材料。所述固定端可以通过与基板一体形成或邻接(adjoined)于基板而被“附接”，例如通过微细加工工艺。替代地，所述固定端可以通过结合、粘合、熔合或焊接工艺被“附接”。所述表面附接的结构具有从所述固定端到所述自由端定义的长度，以及位于以一平面与所述长度正交的一横截面。例如，使用笛卡尔坐标系作为参考框架，并将所述表面附接的结构的长度与z轴(可以是一曲线轴)相关联，则所述表面附接的结构的所述横截面位于x-y平面。
通常，所述表面附接的结构的所述横截面可以具有任何形状，例如圆形(rounded)(例如，圆形(circular)、椭圆形等)、多边形(或棱柱形、直线形等)、具有圆形特征的多边形(例如具有圆角的直线形)或不规则形。所述表面附接的结构在x-y平面上的横截面尺寸可由横截面的“特征尺寸”定义，所述尺寸取决于形状。作为示例，所述特征尺寸在圆形横截面的情况下可以是直径，在椭圆形横截面的情况下可以是主轴，或者在多边形横截面的情况下可以是最大长度或宽度。不规则形状的横截面的特征尺寸可以认为是与不规则形状的横截面最接近的规则形状的横截面的尺寸特征(例如，圆的直径、椭圆的长轴、多边形的宽度或长度等)。
如本文所述的表面附接的结构相对于其固定端或附接到基板的点是可移动的(柔性的、可偏转的、可弯曲的)。为了便于其可动性，所述表面附接的结构可以包括由弹性(柔性)材料构成的柔性主体，并且从所述表面附接的结构的主要尺寸是其长度的意义上讲，可以具有细长的几何形状，即，长度实质上大于特征尺寸。所述柔性主体的组成的示例包括但不限于弹性体材料，例如聚二甲基硅氧烷(pdms)。
所述表面附接的结构的配置使得所述表面附接的结构相对于其固定端的运动可以以非接触方式致动或诱导，特别是通过所需强度、场线方向，及频率(在静磁场或静电场中可能为零)的施加的磁场或电场。为了使所述表面附着的结构能够通过施加的磁场或电场移动，所述表面附接的结构可以包括一适当的金属部件设置在所述表面附接的结构的所述柔性主体上或在所述柔性主体中。为了使所述表面附接的结构对磁场作出反应，所述金属部件可以是铁磁性材料，例如铁、镍、钴或其磁性合金，一个非限制性的示例是“铝镍钴合金(alnico)”(含铝、镍和钴的铁合金)。为了使所述表面附接的结构对电场作出反应，所述金属部件可以是表现出良好导电性的金属，例如铜、铝、金和银以及各种其他金属和金属合金。根据所使用的制造技术，所述金属部件可以沿着所述柔性主体的长度在一选定的区域在所述柔性主体的外表面形成一层(或涂层、薄膜等)。所述层可为一连续层或密集的多个颗粒群排列而成。替代地，所述金属部件可作为嵌入在所述柔性主体中在其选定区域中的多个颗粒的排列形式。
因此，一磁场或一电场的施加促使所述多个表面附接的微柱致动。例如，通过使细胞处理腔室与控制仪器相接触而发生致动包括提供诸如一磁场或一电场的“致动力”的多个元件。因此，所述控制仪器包括，例如，用于致动多个微柱的任何机构(例如，磁力系统)、用于计数多个细胞的任何机构(例如，成像系统)、用于泵送多种流体(例如，多种泵浦、多种流体端口、多种阀门)的气动装置，及一控制器(例如微处理器)。
另外，在一个示例中，本公开的细胞处理系统可以是在样品制备过程中使用的一独立式设备。然而，在另一个示例中，可以将本公开的细胞处理系统集成到一自动化的样品制备过程中，例如集成到用于处理多种生物材料的一机器人系统中。所述机器人系统可以是例如12孔板、24孔板或96孔板聚合酶链反应(pcr)系统。在另一个示例中，所述机器人系统可以是可从瑞士的tecangroupltd.公司获得的用于样品制备的tecan机器人系统。
使用本公开的一种细胞处理系统的方法的一个示例可以包括以下步骤：(1)将一含细胞的样本流体流入细胞处理腔室，(2)在多个微柱未被致动的情况下，通过重力使多个细胞沉淀到腔室底板(即微柱基板)及所述多个微柱之间；(3)在所述多个微柱未被致动的情况下，通过使一洗涤缓冲液流过所述细胞处理腔室来执行一细胞洗涤周期(cycle)(4)通过使所述洗涤缓冲液流过所述细胞处理腔室来执行一细胞回收周期，同时致动所述多个微柱，以将所述多个细胞重新悬浮到流动中。
使用本公开的一种细胞处理系统的方法的另一示例可以包括以下步骤：(1)将一含细胞的样本流体流入细胞处理腔室，(2)在多个微柱未被致动的情况下，通过重力使多个细胞沉淀到腔室底板(即微柱基板)和所述多个微柱之间；(3)在所述多个微柱未被致动的情况下，通过使一洗涤缓冲液流过所述细胞处理腔室来执行一细胞洗涤周期，(4)执行一细胞计数操作以确定所述细胞处理腔室中的多个细胞的数量，(5)通过使所述洗涤缓冲液以一定流速流过所述细胞处理腔室来执行一细胞回收周期，同时致动所述多个微柱以便以一定的细胞密度(例如15个细胞/微升)将所述多个细胞重新悬浮到流动中。
图1示出了本公开的细胞处理系统100的示例的透视图，所述系统使用致动的多个表面附接柱来处理多个细胞，而图2示出了细胞处理系统100的分解透视图。细胞处理系统100包括一流体盒110安装在一控制仪器150的顶部。在细胞处理系统100中，流体盒110和控制仪器150提供了处理多个细胞的多个方式，其中(1)不涉及结合，(2)依靠射流技术。可以使用细胞处理系统100执行的过程的示例包括但不限于细胞浓度、细胞收集、细胞过滤、细胞洗涤、细胞计数、细胞回收、细胞溶解、细胞解聚等。
流体盒110包括一底部基板112及一顶部基板114，底部基板112及顶部基板114由一间隙116分隔开(见图4)。底部基板112和顶部基板114被布置一对准部件(registrationfeature)118上，对准部件118用以安装在控制仪器150上。流体盒110包括一细胞处理腔室120。一微柱阵列122被设置在细胞处理腔室120中。微柱阵列122包括多个表面附接的微柱124布置在一微柱基板125上。在细胞处理系统100中，细胞处理装置使用微柱阵列122，所述微柱阵列122是多个表面附接的微柱124的阵列。一磁场或一电场的施加使所述多个表面附接的微柱124致动。下文参考图4、图5a、图5b、图6a至图6d、图7a及图7b示出并描述了微柱阵列122和微柱124的更多细节。
在流体盒110中，一样品存储器130、一洗涤存储器132及一细胞培养基存储器133向细胞处理腔室120进行供应，以及一废料存储器134和一洗脱液存储器136，位于细胞处理腔室120的一输出处。细胞处理腔室120、样品存储器130、洗涤存储器132、细胞培养基存储器133、废料存储器134和洗脱液存储器136通过多个流体通道140的一布置流体连接。在其他实施例中，流体盒110可以包括多个样品存储器130、多个洗涤存储器132、多个细胞培养基存储器133、多个废料存储器134以及多个洗脱液存储器136。
样品存储器130容纳要处理的含细胞的样品流体。样品存储器130可以是任何大小的，例如从几十毫升(ml)到几百微升(μl)。在一示例中，样品存储器130容纳约200微升的样品流体。
洗涤存储器132容纳例如一定量的洗涤缓冲溶液。洗涤存储器132可以是任意大小，这取决于细胞处理系统100的处理所需的洗涤溶液的量。
细胞培养基存储器133容纳例如一定体积的细胞培养基。细胞培养基存储器133可以根据细胞处理系统100的过程中所需的细胞培养基的数量而定。细胞培养基可以是任何含有使培养中的多个细胞的细胞生长、扩展和/或维持必需成分的培养基，例如一种或多种碳源(例如葡萄糖/谷氨酰胺)、一种或多种氨基酸、一种或多种维生素、一平衡盐溶液以维持多个细胞内的最佳渗透压、一ph指示剂、一ph缓冲液用于维持培养基中ph的平衡、氧气、一种或多种细胞存活所必需的其他营养物质和/或一种或多种物质以促进刺激将细胞分化成所需的细胞。含有多个细胞的一培养基也称为一细胞悬浮液。在下文中使用术语“培养基”不对培养基和细胞悬浮液进行区分。
废料存储器134容纳在细胞处理系统100的过程中产生的任何废液。
洗脱液存储器136容纳在细胞处理系统100的过程中产生的输出的洗脱液，其中所述洗脱液可用于任何下游过程中。
样品存储器130、洗涤存储器132、细胞培养基存储器133、废料存储器134和/或洗脱液存储器136的排气(未示出)可以使用例如气体可渗透但液体不可渗透的密封来实现。
控制仪器150包括一基座152，所述基座152容纳用于致动微柱阵列122的多个微柱124的任何机构(参见图4和图9)，用于计数细胞处理腔室120中的多个细胞的任何机构(参见图4和图9)，用于泵送和控制多种流体的气动装置(见图9)以及一控制器(见图9)。
控制仪器150包括一平台154与流体盒110相接合。在平台154中设置了多个流体控制端口156(参见图2)。多个流体控制端口156的多个位置对应于流体盒110的多个流体通道140的多个位置。多个流体控制端口156可以是任何类型的阀机构，用于控制从样品存储器130、洗涤存储器132和细胞培养基存储器133中的流出，及控制废料存储器134和洗脱液存储器136的流入。在一个示例中，多个流体控制端口156是多个夹阀。
可选地，平台154中设置有一光学窗口158，其中光学窗口158的位置与流体盒110的细胞处理腔室120的位置基本上相对齐。光学窗口158可以是例如透明玻璃或塑料的窗户。当细胞处理腔室120中用于计数多个细胞的机构例如是光学成像系统时，光学窗口158是被需要。
在一个示例中，本公开的细胞处理系统100可以是一独立式设备。但是，在另一个示例中，本公开的细胞处理系统100可以集成到例如用于处理生物材料的自动化机器人系统中，所述系统使用标准的微孔板形式，例如12孔板、24孔板或96孔板。例如并且现在参考图3，流体盒110的对准部件118的大小(即尺寸)可以基本上对应于一机器人系统的一标准多孔板的大小(即尺寸)。例如，图3示出了一96孔板200包括96个孔(well)210。所述96孔板200具有一长度l和一宽度w。类似地，流体盒110的对准部件118具有一长度l和一宽度w。在一个示例中，所述96孔板200和所述流体盒110两者的长度l均为约125毫米。此外，所述96孔板200和所述流体盒110两者的宽度w均为约100毫米。图3还示出了用于处理所述96孔板200的多个流体的多个吸移器220。类似地，一吸移器220可用于处理来自流体盒110的洗脱液存储器136的多个流体。
图4示出了本公开的细胞处理系统100的细胞处理腔室120的一部分的侧视图，其中细胞处理腔室120包括微柱阵列122，其是多个微柱124的阵列。处理腔室120提供一“流动池(flowcell)”类型的腔室。例如，一流动池可以是任何腔室包括一固体表面，一种或多种液体可以流过所述固体表面，其中所述腔室具有至少一入口和至少一出口。图4示出了微柱阵列122的一部分，其包括多个表面附接的微柱124布置在微柱基板125上。
细胞处理腔室120的大小可容纳任何体积的流体。细胞处理腔室120的高度可以是例如约50微米至约100微米。在一个实施例中，细胞处理腔室120的大小可容纳约200微升的流体。在此示例中，细胞处理腔室120可以长约4.5厘米、宽约4.5厘米、高约100微米。
再次参考图4，在细胞处理系统100中，控制仪器150的一致动机构160紧邻流体盒110的细胞处理腔室120布置。致动机构160可以是用于致动流体盒110中的微柱阵列122的多个微柱124的任何机构。如本文所用，术语“致动力”是指施加到多个微柱124的力。致动机构160用于产生在微柱阵列122附近的一致动力，所述致动力迫使多个微柱124的至少一些以表现运动。所述致动力可以是例如磁力、热力、声音和/或电力。此外，致动力可以以频率或振幅的一函数被施加，或以一脉冲力(即，一阶梯函数)被施加。类似地，在不脱离本主题的范围的情况下，可以使用其他多种致动力，例如，流体流过微柱阵列122。
通过致动多个微柱124并使其运动，间隙116中的样品流体(未示出)实际上在细胞处理腔室120的间隙116内被搅动或引起在细胞处理腔室120的间隙116内流动或周期。微柱阵列122包括多个微柱124的布置基于例如2016年1月19日发布的发明名称为“使用致动的多个表面附接柱评估生物流体流变学的多个方法和系统”的美国专利第9,238,869号中描述的多个微柱；通过引用将其全部公开内容并入本文。所述’869专利描述了使用致动的多个表面附接柱评估生物流体流变学的多个方法、系统和计算机可读介质。根据一个方面，所述’869专利的一种用于测试生物流体样本的特性的方法包括：将样本放置在一微柱阵列上，所述微柱阵列具有多个微柱从一基板向外延伸，其中，每个微柱包括一近端附接到所述基板及一远端相对于所述近端，及在所述微柱阵列附近产生一致动力以致动所述多个微柱，从而迫使所述多个微柱的至少一些表现出运动。所述’869专利的所述方法还包括测量响应于所述致动力的所述多个微柱的至少一个的运动，并基于所测得的所述至少一个微柱的运动来确定所述样品的特性。
在一个示例中，根据所述’869专利，微柱阵列122的多个微柱124和微柱基板125可以由聚二甲基硅氧烷(pdms)形成。此外，多个微柱124可包括一柔性主体和设置在所述主体上或其中的一金属部件，其中，一磁场或一电场的施加致动多个微柱124相对于其附接的表面运动。在此示例中，由致动机构160产生的致动力是一磁性和/或一电性致动力。下文参考图5a至图7b示出并描述了微柱阵列122及多个微柱124的更多细节。
再次参考图4，在细胞处理系统100中，控制仪器150的一计数机构162紧邻流体盒110的细胞处理腔室120布置。计数机构162可以是用于计数流体盒110的细胞处理腔室120中的多个细胞的任何机构。然而，计数机构162的要求是能够区分细胞处理腔室120中的多个细胞和多个微柱124。计数机构162可以是基于，例如，电阻(例如一coulter计数器)、流式细胞仪(例如一流式细胞仪，其中多个细胞在一激光束前面以一窄流流动)、图像分析(例如一光学成像系统，使用一数码相机及图像分析工艺对所述多个细胞进行计数)、分光光度法(例如，使用光密度测量来获得一平均细胞计数)及其任意组合。在另一个示例中，所述多个细胞可以被标记，然后通过检测所述标记进行计数。例如，可以对所述多个细胞进行荧光标记，然后通过检测荧光进行计数。
图5a和图5b示出了本公开的细胞处理系统100的细胞处理腔室120的微柱阵列122的多个微柱124的示例的侧视图。微柱基板125可以由例如聚二甲基硅氧烷(pdms)形成。阵列中的多个微柱124的长度、直径、几何形状、取向和间距可以变化。例如，多个微柱124的长度可以从大约1微米到大约100微米变化。多个微柱124的直径可以在约0.1微米至约10微米之间变化。多个微柱124的横截面形状可以变化。例如，多个微柱124的横截面形状可以是圆形、卵形、正方形、矩形、三角形等。多个微柱124的取向可以变化。例如，图5a示出了多个微柱124，其基本上与微柱基板125的平面正交，而图5b示出了多个微柱124，其相对于微柱基板125的平面的法线成角度α取向。在没有施加偏向力的中性位置(neutralposition)，所述角度α可以例如是从大约0度到大约45度。
此外，阵列内的多个微柱124的间距可以变化，例如，从大约0微米到大约50微米。例如，图6a至图6d示出了多个微柱124的阵列的多个配置的示例的平面图。特别地，图6a示出了直径为0.6微米且间隔为1.4微米的多个微柱124的示例。图6b示出了直径为0.6微米且间隔为2.6微米的多个微柱124的示例。图6c示出了直径为1微米且间隔为1.5微米的多个微柱124的示例。图6d示出了直径为1微米且间隔为3微米的多个微柱124的示例。应当理解，图6a至图6d所示的大小和尺寸仅是示例性的，而不是限制性的。图6e示出了多个微柱124的一阵列的示例的扫描电子显微镜图像。此外，图6a至图6e示出了交错或偏移的多行的多个微柱124，这仅是示例性的。
图7a和图7b示出了一微柱124的侧视图，并示出了其致动运动的示例。特别地，图7a示出了基本上与微柱基板125的平面正交取向的一微柱124的示例。图7a示出了所述微柱124的远端可以：(1)仅以从一侧到另一侧2d运动来移动；或(2)相对于固定的近端作圆周运动，所述运动是相对于所述固定的近端作圆锥形运动来移动。相反地，图7b示出了一微柱124相对于微柱基板125的平面以一定角度取向的示例。图7b示出了所述微柱124的远端可以：(1)仅相对于固定的近端以倾斜的从一侧到另一侧2d运动来移动；或(2)相对于所述固定的近端以倾斜的圆周运动，所述运动是相对于所述固定的近端作一倾斜的圆锥形运动。
图8a、图8b和图8c示出了流体盒110的细胞处理腔室120的侧视图以及使用微柱阵列122来收集、洗涤和回收多个细胞的过程。首先，现在转到图8a，在多个微柱124没有被致动的情况下，将包含多个细胞312的一定体积的样品流体310流入到细胞处理腔室120。接下来，仍然参照图8a，在多个微柱124没有被致动的情况下，让多个细胞312通过重力沉淀到腔室地板(即，微柱基板)上以及在多个微柱124之间。接下来，现在参考图8b，在多个微柱124未被致动的情况下，通过使一洗涤缓冲液314流过细胞处理腔室120来执行一细胞洗涤周期。接下来，现在参考图8c，通过使洗涤缓冲液314流过细胞处理腔室120并同时致动多个微柱124以将多个细胞312重新悬浮到流动中来执行一细胞回收周期。特别地，被致动的多个微柱124的运动将多个细胞312扬起并清理多个微柱124，并使多个细胞312进入到洗涤缓冲溶液314的流动中。
图9示出了本公开的细胞处理系统100的示例的方框图。同样，细胞处理系统100包括具有微柱阵列122的细胞处理腔室120。同样，细胞处理系统100包括样品存储器130、洗涤存储器132和细胞培养基存储器133向细胞处理腔室120进行供应，及废料存储器134和洗脱液存储器136在细胞处理腔室120的输出端处。此外，在致动机构160和计数机构162被设置在紧邻细胞处理腔室120。
此外，一流体控制端口156设置在多个流体通道140中的每个。特别地，一流体控制端口156设置在样品存储器130的出口处，另一个流体控制端口156设置在洗涤存储器132的出口处，另一个流体控制端口156设置在细胞培养基存储器133的出口处，另一个流体控制端口156设置在废料存储器134的入口处，以及另一个流体控制端口156设置在洗脱液存储器136的入口处。在一示例中，所述多个流体控制端口156是多个夹阀。
另外，一泵浦164被流体连接到样品存储器130，一泵浦166被流体连接到洗涤存储器132，及一泵浦167被流体连接到细胞培养基存储器133。多个泵浦164、166和167可以是例如，可以是多个小型手动或电动泵浦(例如注射泵)，其向细胞处理腔室120提供正压和/或负压。
细胞处理系统100还包括一控制器168，用于控制细胞处理系统100的整体操作。例如，控制器168可用于控制多个流体控制端口156、致动机构160、计数机构162、泵浦168及泵浦166的操作。控制器168可以是能够执行多个程序指令的任何计算装置、控制器及/或微控制器。此外，数据存储(未示出)可以与控制器168相关联。
此外，细胞处理系统100可以具有一用户界面(ui)170。用户界面170可以包括例如任何数量和类型的多种开关、多种按钮、多种视觉指示器(例如，多种发光二极管(led))、多种声音指示器(例如多种蜂鸣声、多种嗡嗡声)、多种触觉指示器(即振动)等。例如，图1和图2示出了控制仪器150上的一电源按钮172。
可选地，细胞处理系统100可以包括一通信接口174。通信接口174可以是用于连接至一网络(未示出)的任何有线和/或无线通信接口，并且可以通过所述接口与连接到网路的其他设备交换信息。多个有线通信接口的示例可以包括但不限于usb端口、rs232连接器、rj45连接器、以太网及其任意组合。无线通信接口的多个示例可以包括但不限于内联网连接、因特网、蜂窝网络、ism、
此外，一电源180被设置以用于为细胞处理系统100的所有有源组件供电。在一个示例中，电源180可以是任何可再充电或不可再充电的电池。在另一个示例中，电源180可以是将标准交流电源转换成直流电压的交流电源适配器。
在控制器168的控制下，可以如下使用细胞处理系统100执行各种处理周期。
样品加载周期(或细胞收集周期)：向细胞处理腔室120加载样品流体，洗涤存储器132、细胞培养基存储器133、废料存储器134和洗脱液存储器136的流体控制端口156被关闭；样品存储器130的流体控制端口156被打开；泵浦164被激活，泵浦166和泵浦167未被激活，致动机构160未被激活，及计数机构162未被激活。
细胞洗涤周期：向处理腔室120中的多个细胞进行洗涤，样品存储器130、细胞培养基存储器133和洗脱液存储器136的流体控制端口156被关闭；洗涤存储器132和废料存储器134的流体控制端口156被打开；泵浦164和泵浦167未被激活，泵浦166被激活，致动机构160未被激活，及计数机构162未被激活。
细胞培养周期：在处理腔室120中培养所述多个细胞，样品存储器130、洗涤存储器132和洗脱液体存储器136的流体控制端口156被关闭；细胞培养基存储器133和废料存储器134的流体控制端口156被打开；泵浦164和泵浦166未被激活，泵浦167被激活，致动机构160未被激活，及计数机构162未被激活。
细胞计数周期：计数处理腔室120中的多个细胞，样品存储器130、洗涤存储器132、细胞培养基存储器133、废料存储器134和洗脱液存储器136的流体控制端口156被关闭；泵浦164未被激活，泵浦166未被激活，泵浦167未被激活，致动机构160未被激活，计数机构162被激活。
细胞回收周期：从处理腔室120中回收所述多个细胞，样品存储器130、细胞培养基存储器133和废料存储器134的流体控制端口156被关闭；洗涤存储器132和洗脱液存储器136的流体控制端口156被打开；泵浦164和泵浦167未被激活，泵浦166被激活，致动机构160被激活，及计数机构162未被激活。
细胞处理系统100不限于一样品加载周期、一细胞洗涤周期、一细胞计数周期、一细胞培养周期和/或一细胞回收周期。这些周期仅是示例性的。细胞处理系统100可用于执行其他细胞处理周期，例如但不限于一样品加载或细胞收集周期、一细胞洗涤周期、一细胞计数周期、一细胞回收周期、一细胞浓缩周期、一细胞过滤周期、一细胞溶解周期、一细胞解聚周期等。
图10示出了使用本公开的细胞处理系统100收集、洗涤和回收多个细胞的方法400的一个示例的流程图。方法400可以包括但不限于以下步骤。
在一步骤410，一样品流体被提供，所述样品流体包含一定浓度的多个细胞。在一个示例中，样品存储器130是200微升的容器，其容纳由使用离心过程产生的200微升的样品。例如，在到细胞处理系统100之前，将10毫升样品通过离心以进行一细胞浓缩过程以产生一沉淀细胞(cellpellet)。然后，将沉淀细胞重新悬浮到200微升溶液中，然后将其提供给细胞处理系统100的样品存储器130。此200微升样品的浓度可以为例如约1个细胞/微升至约10,000个细胞/微升。
在一步骤415中，将含有细胞的样本流体流入细胞处理腔室120。例如，再次参考图8a，在多个微柱124未被致动的情况下，含有多个细胞312的一定体积的样本流体310从样品存储器130流出并填入细胞处理腔室120。
在一步骤420，通过重力、微流体细胞分离器(例如，见图16a和图16b)和/或介电电泳(例如，见图17)，使多个细胞有时间沉淀出来到腔室底板(即，微柱基板)上和多个微柱124之间，而多个微柱124未被致动。例如，再次参考图8a，在多个微柱124未被致动的情况下，允许多个细胞312有时间通过重力沉淀到细胞处理腔室120的底板上并收集在多个微柱124之间。在一个示例中，所述所允许的时间是从约1分钟到约2分钟。
在一步骤425中，通过使洗涤缓冲液流过细胞处理腔室120而多个微柱124没有被致动来执行一细胞洗涤周期。例如，再次参考图8b，在多个微柱124没有被致动的情况下，一细胞洗涤周期通过使一定量的洗涤缓冲液314从洗涤存储器132中流出，冲洗通过细胞处理腔室120，然后被收集在废料存储器134中来进行。从头到尾，多个细胞312被截流在微柱阵列122的多个微柱124之间，并因此被保持在细胞处理腔室120内。此步骤可以重复任何次数，直到所述多个细胞被适当清洗。
在一步骤430，通过使洗涤缓冲液流过细胞处理腔室120同时将多个微柱124致动以将所述多个细胞重新悬浮到流动中来执行一细胞回收周期。例如，再次参考图8c，一细胞回收周期通过使洗涤缓冲液314流过细胞处理腔室120，同时(通过致动机构160)致动多个微柱124以使多个细胞312重新悬浮进入流动中来执行。特别地，所述致动的多个微柱124的运动将多个细胞312上扬并清理多个微柱124，并使多个细胞312进入洗涤缓冲溶液314的流动中。所得的含细胞洗脱液从细胞处理腔室120中流出，并收集在洗脱液存储器136中。
图11示出了使用本公开的细胞处理系统100以一预定细胞密度收集、洗涤、计数和回收多个细胞的方法500的一个示例的流程图。方法500可以包括但不限于以下步骤。
在一步骤510，提供含一定浓度的多个细胞的一样品流体，所述样品流体。在一个示例中，样品存储器130是200微升的存储器，其容纳由使用离心过程产生的200微升的样品。例如，在到细胞处理系统100之前，将10毫升样品通过离心进行一细胞浓缩过程以产生一沉淀细胞。然后，将所述沉淀细胞重新悬浮到200微升的溶液中，然后将其提供给细胞处理系统100的样品存储器130。此200微升的样品的浓度可以为例如约1个细胞/微升至约10,000个细胞/微升。
在一步骤515，将含有细胞的样本流体流入细胞处理腔室120。例如，再次参考图8a，在多个微柱124未被致动的情况下，含有多个细胞312的一定体积的样本流体310从样品存储器130流出并填入细胞处理腔室120。
在一步骤520，使所述多个细胞有时间通过重力沉淀到腔室底板(即，微柱基板)上以及多个微柱124之间，而多个微柱124没有被致动。例如，再次参考图8a，在多个微柱124没有被致动的情况下，允许多个细胞312有时间通过重力沉淀到细胞处理腔室120的底板上并收集在多个微柱124之间。在一个示例中，所允许的时间是从大约1分钟到大约2分钟。
在一步骤525中，一细胞洗涤周期通过使洗涤缓冲液流过细胞处理腔室120而多个微柱124未被致动来执行。例如，再次参考图8b，在多个微柱124没有被致动的情况下，一细胞洗涤周期通过使一定量的洗涤缓冲溶液314从洗涤存储器132中流出，冲洗通过细胞处理腔室120，然后被收集在废料存储器134中来执行。由始至终，多个细胞312被截流在微柱阵列122的多个微柱124之间，并因此被保持在细胞处理腔室120内。此步骤可以重复任何次数，直到多个细胞被适当清洗。
在一步骤530，一细胞计数操作被执行以确定在细胞处理腔室120中的多个细胞的数量。例如，当多个微柱124未被致动而多个细胞312安置在细胞处理腔室120的底板上时，计数机构162被激活以确定在细胞处理腔室120中的多个细胞312的数量。在一个示例中，计数机构162是使用一数码照相机和图像分析工艺以计数所述多个细胞312的一光学成像系统。
在一步骤535，一细胞回收周期通过使洗涤缓冲液以一定的流速流过细胞处理腔室120并将多个微柱124致动，以一定的细胞密度将所述多个细胞重新悬浮到流动中来执行。例如，再次参考图8c，一细胞回收周期通过使洗涤缓冲液314以一定的流速流过细胞处理腔室120并同时将多个微柱124(经由致动机构160)致动来执行，以便以一定的细胞密度(例如15个细胞/微升)将多个细胞312重新悬浮到流动中。特别地，致动的多个微柱124的运动将多个细胞312上扬并清理多个微柱124，并使多个细胞312进入洗涤缓冲溶液314的流动中。得到的含细胞的洗脱液以所需的细胞密度(例如，15个细胞/微升)从细胞处理腔室120流出，并被收集在洗脱液存储器136中。现在，洗脱液存储器136的内容可用于下游过程，例如一自动化机器人系统(例如，用于样品制备的tecan机器人系统)。在此步骤中，分配的细胞密度可以具体有一些公差，例如15个细胞/微升±2或±5，依此类推。
现在再次参考图1至图11，细胞处理系统100包括流体盒110和控制仪器150和方法400、500非常适合于样品制备过程。特别地，细胞处理系统100和方法400、500提供了处理多个细胞的多个方法，这些方法(1)不涉及结合；及(2)依赖射流技术。可以使用本公开的细胞处理系统100和方法400、500执行的过程的示例包括但不限于细胞浓度、细胞收集、细胞过滤、细胞洗涤、细胞计数、细胞回收、细胞溶解、，细胞解块等。在一个示例中，在细胞处理腔室120中致动多个微柱124可被使用来产生用于细胞溶解的拍击运动。在另一个示例中，如果存在多个细胞团块(例如，粘性的多个细胞)，则多个微柱124可以被致动以产生一搅动或拍击运动以打散所述多个团块。一个目的是在多个细胞要从多个微柱124沉淀出来之前打散所述多个团块以被计数。
此外，在其他多个构造中，一微阵列设置在与多个微柱相对的表面上。所述多个细胞在腔室中在所述多个微柱124之间被捕获，然后将一溶解缓冲液冲入所述腔室中，使盒中的多个细胞破裂，然后所述多个微柱被致动以混合所有物质并驱动所述多个细胞移至所述微阵列，然后进行检测。在此示例中，省略了细胞回收步骤。
图12示出了本公开的细胞处理系统100的流体盒110的一个示例的透视图，所述流体盒110进一步包括一细胞浓缩模块185(未按比例绘制)。例如，细胞浓缩模块185是机上(onboard)的浓缩模块，可用于例如执行原始样品的细胞浓缩过程，所述过程通常通过离心来完成，以产生高浓度的200微升的样品，如上所述，例如，在图10的方法400的步骤410和图11的方法500的步骤510中。因此，在此示例中，样品存储器130可以是容纳原始10毫升的样品的一10毫升容器，然后将其提供给细胞浓缩模块185。然后，使用微流体，流体盒110中的细胞浓缩模块185被使用以执行一细胞浓缩过程，以产生的一细胞浓缩与传统上通过离心产生的200微升的样品基本相同。以这种方式，细胞浓缩模块185可以用来代替常规的离心过程。
图13和图14示出了在微柱阵列122中形成的多个流动路径610的示例的平面图，所述多个流动路径610被设计为收集多个细胞。一流动路径610可以通过在微柱阵列122中不存在的多个微柱124来形成，并且其中流动路径610的至少某些部分是弯曲的。例如，图13示出了一蛇形流动路径610，其中，流动中的多个细胞312倾向于聚集在蛇形流动路径610的曲线的外侧，并因此被推入定义路径的软壁的多个微柱124中。一旦在多个微柱124之间的领域，流体流速将下降，并且多个细胞将沉淀到通道的底部。类似地，图14示出了一螺旋形流动路径610，其中，流动中的多个细胞312倾向于聚集在螺旋形流动路径610的连续曲线的外侧，并且因此被推入所述多个微柱124中。
图15a和图15b示出了用于捕获多个细胞的示例性微柱构造的平面图。特别地，图15a示出了由三个微柱124的布置形成的微柱弧126。类似地，图15b示出了由五个微柱124的布置形成的微柱弧128。微柱弧126和微柱弧128是物理屏障的示例，多个细胞可以碰撞并被捕获。在随后的步骤中，可以通过致动多个微柱124来释放所述多个细胞，如例如在图10的方法400的步骤430和图11的方法500的步骤535中所述。所述微柱屏障不限于弧形。所述微柱屏障可以是任何形状，例如但不限于弧形、u形、v形、条形等。
图13所示的蛇形流路610，图14所示的螺旋形流路610以及图15a和
图15b是以收集、捕获和/或捕捉多个细胞的方式对多个微柱124进行图案化的示例，所述多个微柱可以代替或与通过重力沉淀出多个细胞结合使用。在一个示例中，图案化多个微柱124的方法可以是以非常高的密度阵列制造多个微柱124，然后使用诸如压花工具之类的工具压碎不需要的多个微柱124并产生负空间，留下所需的微柱形状。
图16a和图16b示出了细胞处理腔室120的配置，所述配置包括用于辅助多个细胞从溶液中沉淀出来的多个部件(features)。图16a是细胞处理腔室120的侧视图。图16b是细胞处理腔室120的顶部面板114的平面图。在此示例中，一组部件710以例如在顶部面板114上图案化一人字构造设置在与微柱阵列122相对的表面。由于多个部件710的存在，细胞处理腔室120可以提供微流体细胞分离的附加功能。特别地，一旦多个细胞被捕获在多个部件710上，则流体流速将下降，并且多个细胞将沉淀到细胞处理腔室120的底部。
图17示出了细胞处理腔室120的另一种配置，其包括用于辅助多个细胞从溶液中沉淀出来的多个部件。在此示例中，可以在底部基板112、顶部基板114或底部基板112和顶部基板114两者提供一个或多个电极750(例如，电润湿电极)。由于存在多个电极750，细胞处理腔室120可以提供介电泳的附加功能。
图18示出了使用本公开的细胞处理系统100收集、洗涤和回收多个细胞的方法800的示例的流程图。方法800可以包括但不限于以下步骤。
在一步骤810，含有一定浓度的多个细胞的样品流体被提供。在一个例子中，样品存储器130是200微升的容器，其容纳使用离心过程产生的200微升的样品。例如，在到细胞处理系统100之前，将10毫升样品通过离心进行细胞浓缩过程以产生沉淀细胞。然后，将沉淀细胞重新悬浮到200微升溶液中，然后将其提供给细胞处理系统100的样品存储器130。此200微升样品的浓度可以为例如约1个细胞/微升至约10,000个细胞/微升。
在一步骤815中，将含细胞的样本流体流入到细胞处理腔室120中，同时多个微柱124被致动，其中所述样本流体以足够慢的速率流动，以至于不会将所述多个细胞推出细胞处理腔室120。例如，在多个微柱124被致动的情况下，将含有多个细胞312的一定体积的样品流体310流出样品容器130并填入细胞处理腔室120，其中所述样本流体以足够慢的速度流动，以至于所述多个细胞不会从细胞处理腔室120中被推出。特别地，致动的多个微柱124的运动作为一推动器，使所述多个细胞保持悬浮在细胞处理腔室120中。
在一步骤820，通过使洗涤缓冲液流过细胞处理腔室120来执行一细胞洗涤周期，同时多个微柱124被致动，其中所述洗涤缓冲液以足够慢的速率流动，使得多个细胞被没有从细胞处理腔室120中推出。例如，在多个微柱124被致动的情况下，一细胞洗涤周期通过将一定量的洗涤缓冲溶液314从洗涤存储器132中流出，冲洗通过细胞处理腔室120来执行，然后将其收集在废料储存器134中，其中所述洗涤缓冲液以足够慢的速率流动，以至于不会将所述多个细胞从细胞处理腔室120中推出。特别是，致动的多个微柱124的运动作为一推动器，使所述多个细胞保持悬浮在细胞处理腔室120中。
在一步骤825，通过使细胞培养基流过细胞处理腔室120来执行一细胞培养周期，同时多个微柱124被致动，其中所述细胞培养基以足够慢的速率流动以使得所述多个细胞没有被从细胞处理腔室120中推出。例如，在多个微柱124被致动的情况下，一细胞培养周期通过使一定量的细胞培养基从细胞培养基存储器133中流出，填入细胞处理腔室120来执行，其中所述洗涤缓冲液以足够慢的速度流动，以至于所述多个细胞不被推出细胞处理腔室120。特别地，致动的多个微柱124的运动作为一推动器，以保持所述多个细胞悬浮在细胞处理腔室120中。
在一步骤830，通过使洗涤缓冲液流过细胞处理腔室120来执行一细胞回收周期，同时多个微柱124被致动，其中所述洗涤缓冲液以足够快的速率流动，使得所述多个细胞被推出细胞处理腔120。例如，一细胞回收周期通过使洗涤缓冲液314流过细胞处理腔室120，同时多个微柱124(通过致动机构160)被致动来执行，其中所述洗涤缓冲液以足够快的速度流动，以至于所述多个细胞被从细胞处理腔室120推出。所得的含细胞洗脱液从细胞处理腔室120流出，并被收集在洗脱液存储器136中。
图19示出了使用本公开的细胞处理系统100来收集、洗涤、培养和回收多个细胞的方法900的一个示例的流程图。方法900可以包括但不限于以下步骤。
在一步骤910，含有一定浓度的多个细胞的一样品流体被提供。在一个示例中，样品存储器130是200微升的容器，其容纳使用一离心过程产生的200微升的样品。例如，在到细胞处理系统100之前，将10毫升样品通过离心进行细胞浓缩过程以产生一沉淀细胞。然后，将所述沉淀细胞重新悬浮到200微升溶液中，然后将其提供给细胞处理系统100的样品存储器130。此200微升样品的浓度可以为例如约1个细胞/微升至约10,000个细胞/微升。
在一步骤915，将含细胞的样本流体流入细胞处理腔室120。例如，再次参考图8a，在多个微柱124未被致动的情况下，含多个细胞312的一定体积的样本流体310从样品存储器130流出并填入细胞处理腔室120。
在一步骤920，所述多个细胞允许有时间通过重力、微流体细胞分离器(例如，参见图16a和图16b)和/或介电电泳(例如，参见图17)沉淀出到腔室底板(即，微柱基板)和多个微柱124之间，同时多个微柱124未被致动。例如，再次参考图8a，在多个微柱124未被致动的情况下，多个细胞312允许有时间通过重力沉淀到细胞处理腔室120的底板上并收集在多个微柱124之间。在一个示例中，所允许的时间是从大约1分钟到大约2分钟。
在一步骤925，一细胞洗涤周期通过使洗涤缓冲液流过细胞处理腔室120，同时多个微柱124未被致动来执行。例如，再次参考图8b，在多个微柱124未被致动的情况下，通过使一定量的洗涤缓冲溶液314从洗涤存储器132中流出，冲洗通过细胞处理腔室120，然后收集在废料存储器134中来执行一细胞洗涤周期。由始至终，多个细胞312被截流在微柱阵列122的多个微柱124之间，并因此被保持在细胞处理腔室120内。此步骤可以重复任何次数，直到所述多个细胞被适当地清洁。
在一步骤930，一细胞培养周期通过使细胞培养基流入细胞处理腔室120并提供所需的时间和条件用于细胞生长、扩增和维持，同时多个微柱124未被致动来执行。
在一步骤940，通过使洗涤缓冲液流过细胞处理腔室120并同时致动多个微柱124以将所述多个细胞重新悬浮到流动中来执行一细胞回收周期。例如，再次参考图8c，通过使洗涤缓冲液314流过细胞处理腔室120来执行一细胞回收周期，同时多个微柱124(通过致动机构160)被致动以使多个细胞312重新悬浮进入流动中。特别地，致动的多个微柱124的运动将多个细胞312上扬并清理多个微柱124，及所述多个细胞312进入洗涤缓冲溶液314的流动中。所得的含细胞洗脱液从细胞处理腔室120中流出，并收集在洗脱液存储器136中。
图20示出了使用本公开的细胞处理系统100来收集、洗涤、计数和回收多个细胞的方法1000的一个示例的流程图。方法1000可以包括但不限于以下步骤。
在步骤1010，提供含有一定浓度的多个细胞的样品流体。在一个示例中，样品存储器130是200微升的容器，其容纳使用离心过程产生的200微升的样品。例如，在到细胞处理系统100之前，将10毫升样品通过离心进行细胞浓缩过程以产生沉淀细胞。然后，将沉淀细胞重新悬浮到200微升溶液中，然后将其提供给细胞处理系统100的样品存储器130。此200微升样品的浓度可以为例如约1个细胞/微升至约10,000个细胞/微升。
在步骤1015中，将含细胞的样本流体流入细胞处理腔室120，同时多个微柱124被致动，其中样本流体以足够慢的速率流动，使得所述多个细胞不被推出细胞处理腔室120。例如，在多个微柱124被致动的情况下，将含有多个细胞312的一定体积的样品流体310流出样品存储器130并填入细胞处理腔室120，其中所述样品流体以足够慢的速率流动，以至于所述多个细胞不会从细胞处理腔室120中被推出。特别地，致动的多个微柱124的运动作为一推动器，以保持所述多个细胞悬浮在细胞处理腔室120中。
在一步骤1020中，通过使洗涤缓冲液流过细胞处理腔室120，同时多个微柱124被致动来执行一细胞洗涤周期，其中所述洗涤缓冲液以足够慢的速率流动以使得所述多个细胞没有从细胞处理腔室120中被推出。例如，在多个微柱124被致动的情况下，通过将一定量的洗涤缓冲溶液314从洗涤存储器132中流出，冲洗通过细胞处理腔室120，然后收集在废料存储器134中来执行一细胞洗涤周期，其中所述洗涤缓冲液以足够慢的速度流动，以至于不会将所述多个细胞从细胞处理腔室120中推出。特别地，致动的多个微柱124的运动作为一推动器，以保持所述多个细胞悬浮在细胞处理腔室120中。
在一步骤1025中，通过使细胞培养基流过细胞处理腔室120，同时多个微柱124被致动来执行一细胞培养周期，其中所述细胞培养基以足够慢的速率流动以使所述多个细胞没有从细胞处理腔室120中被推出。例如，在多个微柱124被致动的情况下，通过使一定量的细胞培养基从细胞培养基133中流出，填入细胞处理腔室120来进行一细胞培养周期，其中所述洗涤缓冲液以足够慢的一速率流动，以至于所述多个细胞不被推出细胞处理腔室120。特别地，致动的多个微柱124的运动作为一推动器，以保持所述多个细胞悬浮在细胞处理腔室120中。
在一步骤1030中，一细胞计数操作被执行以确定细胞处理腔室120中的多个细胞的数量。例如，当多个微柱124被致动而多个细胞312被悬浮在细胞处理腔室120中时，计数机构162被激活，以确定细胞处理腔室120中的多个细胞312的数量。在一个示例中，计数机构162是一种光学成像系统，其使用一数码相机和图像分析工艺来对所述多个细胞312进行计数。对悬浮的多个细胞进行计数可以通过光密度(也称为浊度)测量、粒径分析仪(zetasizer)式测量(其中多个细胞以电动力方式移动，激光在多个细胞经过时对多个细胞计数)来实现，或任何其他用于测量悬浮的多个细胞的细胞计数的任何方法。
在一步骤1035，通过使洗涤缓冲液流过细胞处理腔室120，同时多个微柱124被致动来执行一细胞回收周期，其中所述洗涤缓冲液以足够快的速率流动，使得多个细胞被推出细胞处理腔室120。例如，通过使洗涤缓冲液314流过细胞处理腔室120，同时多个微柱124(通过致动机构160)被致动来执行一细胞回收周期，其中所述洗涤缓冲液以足够快的速度流动，以至于多个细胞被从细胞处理腔室120推出。所得的含细胞洗脱液从细胞处理腔室120流出，并收集在洗脱液储存器136中。
图21示出了使用本公开的细胞处理系统100收集、洗涤、培养和回收多个细胞的方法1100的一个示例的流程图。方法1100可以包括但不限于以下步骤。
在步骤1110，提供含有一定浓度的多个细胞的样品流体。在一个示例中，样品存储器130是200微升的容器，其容纳使用离心过程产生的200微升的样品。例如，在到细胞处理系统100之前，将10毫升样品通过离心进行细胞浓缩过程以产生一沉淀细胞。然后，将所述沉淀细胞重新悬浮到200微升溶液中，然后将其提供给细胞处理系统100的样品存储器130。此200微升样品的浓度可以为例如约1个细胞/微升至约10,000个细胞/微升。
在一步骤1115，使含细胞的样本流体流入细胞处理腔室120。例如，再次参考图8a，在多个微柱124未被致动的情况下，含多个细胞312的一定体积的样本流体310从样品存储器130流出并填入细胞处理腔室120。
在一步骤1120中，通过重力、微流体细胞分离器(例如，参见图16a和图16b)和/或介电电泳(例如，参见图17)，使所述多个细胞有时间沉淀出来在腔室底板(即，微柱基板)上和多个微柱124之间，同时多个微柱124未被致动。例如，再次参考图8a，在多个微柱124未被致动的情况下，多个细胞312允许有时间通过重力沉淀到细胞处理腔室120的底板上并收集在多个微柱124之间。在一个示例中，所允许的时间是从大约1分钟到大约2分钟。
在一步骤1125中，通过使洗涤缓冲液流过细胞处理腔室120而多个微柱124未被致动来执行一细胞洗涤周期。例如，再次参考图8b，在多个微柱124未被致动的情况下，通过使一定量的洗涤缓冲溶液314从洗涤存储器132中流出，冲洗通过细胞处理腔室120，然后被收集在废料存储器134中来执行一细胞洗涤周期。由始至终，多个细胞312被截流在微柱阵列122的多个微柱124之间，并因此被保持在细胞处理腔室120内。此步骤可以重复任何次数，直到所述多个细胞被适当清洗。
在步骤1130中，通过在多个微柱124不被致动的同时使细胞培养基流入细胞处理腔室120并提供所需的时间和条件使细胞生长、扩增和维持来执行一细胞培养周期。
在一步骤1140，执行细胞计数操作以确定细胞处理腔室120中的多个细胞的数目。例如，当多个微柱124未被致动并且多个细胞312被安置在细胞处理腔室120的底板上时，计数机构162被激活以确定细胞处理腔室120中的多个细胞312的数量。在一个示例中，计数机构162是使用数码照相机和图像分析工艺以计数多个细胞312的光学成像系统。
在一步骤1150中，通过使洗涤缓冲液流过细胞处理腔室120并同时致动多个微柱124以将多个细胞重新悬浮到流动中来执行一细胞回收周期。例如，再次参考图8c，通过使洗涤缓冲液314流过细胞处理腔室120来执行一细胞回收周期，同时(通过致动机构160)致动多个微柱124以重新悬浮多个细胞312进入流动中。特别地，致动的多个微柱124的运动将多个细胞312向上扬并清理多个微柱124，并使多个细胞312进入洗涤缓冲溶液314的流动中。所得的含细胞洗脱液从细胞处理腔室120中流出，并收集在洗脱液存储器136中。
如上所述，本公开主题所属领域的技术人员将受益于前述描述中给出的教导，想到本文所述的本公开主题的许多修改和其他实施例以及相关的图示。例如，在允许多个细胞沉淀在微柱基板上的多个表面附接的微柱之间的实施方式中，某些细胞自然比其他细胞具有更高的粘附性，并且细胞收集步骤可能需要在洗涤介质中包含使所述多个细胞分离的试剂(例如胰蛋白酶)。在其他实施方案中，可能希望收集洗脱液而不收集所述多个细胞，例如从已经在细胞处理腔室120中培养的多个细胞收集洗脱液，其中培养的多个细胞产生蛋白质、肽，等等被释放到洗脱液中。
遵循长期的专利法惯例，术语“一(a、an)”和“所述(the)”当用于本申请包括权利要求书时是指“一个或多个”。因此，例如，“一对象”的提及包括多个对象，除非上下文明显相反(例如，多个对象)等。
在本说明书和权利要求书中，除非上下文另外要求，否则以非排他性的意义使用术语“包含(comprise、comprises及comprising)”。同样地，术语“包含(include)”及其语法变体意图是非限制性的，使得列表中的项目的列举不排除可以替换或添加到所列项目的其他类似项目。
为了本说明书和所附权利要求书的目的，除非另有说明，否则表示说明书和权利要求书中使用的表示量、大小、尺寸、比例、形状、配方、参数、百分比、数量、特性和其他数值的所有数字均为：在所有情况下均应理解为被术语“约”修饰，即使术语“约”可能没有明确表示其值、量或范围。因此，除非有相反的说明，否则以下说明书和所附权利要求书中列出的数字参数不是并且也不必是精确的，而是可以根据需要为近似值和/或更大或更小，反映出公差，转换因子，四舍五入，测量误差等，以及本领域技术人员已知的其他因素，取决于希望通过本公开主题获得的所需特性。例如，术语“大约”在涉及一个值时，意味着在某些实施例中±100％，在某些实施例中±50％，在某些实施例中±20％，在某些实施例中±10％，在某些实施例中±5％，在某些实施例中±1％，在某些实施例中±0.5％，在某些实施例中±0.1％，相对于指定量，因为这种变化适合于执行所公开的方法或采用所公开的组合物。
此外，术语“约”当与一个或多个数字或数值范围结合使用时，应理解为是指所有这样的数字，包括一个范围内的所有数字，并通过扩展上下边界来修改该范围。列出的数值。端点对数值范围的叙述包括该范围内的所有数字，例如整数，包括其分数(例如，1到5的叙述包括1、2、3、4和5以及分数(例如1.5、2.25、3.75、4.1等)以及该范围内的任何范围。
说明书中提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献表明了本公开主题所属领域的技术人员的水平。所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都以相同的程度通过引用并入本文，就好像每个单独的出版物、专利申请、专利和其他参考文献都被具体地和单独地指出通过引用并入一样。应该理解，尽管这里引用了许多专利申请、专利和其他参考文献，但是这些参考文献并不意味着承认这些文件中的任何文件构成了本领域公知常识的一部分。
尽管出于清楚理解的目的已经通过图示和示例的方式详细地描述了前述主题，但是本领域技术人员将理解，可以在所附权利要求的范围内进行某些改变和修改。
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