用于细胞的微滴检测的装置和方法与流程

背景技术：

根据本发明，提供了用于快速标识、操纵和选择细胞的装置和相关方法。它对于操纵来自无限增殖化细胞培养物样本或直接来自组织样本的哺乳动物细胞特别有用。它对被认为含有感染证据的患者样本进行快速、并行筛选也特别有用。

用于操纵液滴或磁珠的装置在本领域中先前已经被描述；参见例如us6565727、us20130233425和us20150027889。在液滴的情况下，这种结果通常可以通过使液滴(例如在不混溶的载体流体存在下的情况下)穿过由盒或微流体管的两个相对壁限定的微流体空间来实现。嵌入在这些壁中的一个或两个壁中的是覆盖有介电层的微电极，这些微电极中的每一个都连接到a/c偏置电路，该a/c偏置电路能够以一定间隔快速接通和断开，以修改该层的电场特性。这在微电极附近产生了局部的定向毛细作用力，该定向毛细作用力可以用于沿着一个或多个预定路径操控液滴。这种装置(其采用下文中并且结合本发明将被称为“真正的”电润湿电极)在本领域中以首字母缩略词ewod(电介质上的电润湿)装置而被熟知。

这种方法的变型(其中电润湿力是光学介导的、在本领域中作为光电润湿并且在下文中作为相对应的首字母缩写为oewod熟知)已经在例如us20030224528、us20150298125、us20160158748、us20160160259和appliedphysicsletters93221110(2008)中公开。特别地，这三个专利申请中的第一个公开了各种微流体装置，所述微流体装置包括由第一壁和第二壁限定的微流体腔，并且其中第一壁具有复合设计并且包括基底、光电导层和绝缘(电介质)层。在这个单面实施例中，在光电导层和绝缘层之间设置导电单元阵列，这些导电单元彼此电隔离并耦接到光活性层，并且其功能是在绝缘层上生成相对应的电润湿电极位置。在这些位置处，液滴的表面张力特性可以通过如上所述的电润湿场来修改。然后，可以通过入射在光电导层上的光来暂时接通导电单元。这种方法具有这样的优点，即，尽管其实用性在某种程度上仍然受到电极的布置的限制，但切换变得容易且快速得多。另外，存在关于液滴可以被移动的速度和实际液滴路径可以变化的程度的限制。

这个后一种方法的双面实施例已经由pei在伯克利加州大学ucb/eecs-2015-119中公开。在一个示例中，描述了一种单元，该单元允许使用电偏置非晶硅上的光图案在沉积在介电层上的特氟隆表面上使用光电润湿来操纵尺寸范围为100μm至500μm内的相对较大的液滴。然而，在例示的装置中，介电层很薄(100nm)，并且仅设置在承载光活性层的壁上。

在我们公开的申请wo2018/234445(其的全部内容通过引用结合于此)中，我们已经描述了一种用于操纵微滴的装置，该装置使用光电润湿来提供动力。在这种光学介导的电润湿(oewod)装置中，微滴被移动通过由容纳壁限定的微流体空间；例如其间夹有微流体空间的一对平行板。容纳壁中的至少一个包括下文中称为“虚拟”电润湿电极位置，这些位置通过选择性地照射掩埋在其中的半导体层的区域而生成。通过利用来自单独光源的光选择性地照射该层，可以瞬时生成虚拟电润湿电极位置的虚拟路径，其中可以使微滴沿着该虚拟路径移动。

在我们相对应的公开专利wo2018/234448(其全部内容通过引用结合于此)中，描述了将该装置作为核酸测序仪的操作部分的用途。

技术实现要素：

我们现在已经开发了一种用于将类似于支撑我们先前描述的测序仪的那些方法的微滴方法应用于含有细胞的生物样本的快速筛选和操作的装置。

因此，根据本发明，提供了一种用于操纵和/或确定分析包含在生物样本中的细胞的一个或多个特性的装置，该装置包括：

分选部件，该分选部件被构造成将含有细胞的微滴与空的微滴分离成含有细胞的第一微滴的群体；

微滴操纵部件，该微滴操纵部件被构造成使用真实电润湿电极或虚拟电润湿电极操纵第一微滴，该微滴操纵部件包括：第一区域，该第一区域被构造成将第一微滴布置成阵列以便进行光学检查，并且所述第一区域任选地被构造成通过微滴合并将报告系统引入到每一个第一微滴中；

第二区域，该第二区域位于第一区域内或被定位成与第一区域相邻，并被构造成在一个或多个检测窗中检测合并的微滴；和

任选地，第三区域，在该第三区域中，微滴可以被细分和隔离，以便随后从仪器中进行回收；和

光学检测系统，该光学检测系统被构造成通过所述一个或多个检测窗检测来自合并的微滴的光学信号，其中对于合并的微滴，信号由报告系统与细胞或所述细胞的表达产物之间的相互作用产生。

根据本发明的另一方面，提供了一种用于使用根据本发明的装置来操纵和/或确定生物样本中的细胞类型的一种或多种特性的方法，该方法包括以下步骤：从生物样本在不混溶的载体流体中创建含水的第一微滴，所述第一微滴中的至少一些被认为含有特定细胞类型的细胞；使用真实电润湿电极或虚拟电润湿电极沿着一路径将第一微滴移动到至少一个微滴检查位置；以及利用光学检测系统分析每个微滴的内容物，以确定包含在该微滴中的细胞的一个或多个特性，该一个或多个特性包括细胞形态、细胞运动性或细胞膜完整性中的至少一个。

根据本发明的另一方面，提供了一种用于使用本发明的装置来操纵和/或确定生物样本中细胞类型的一种或多种特性的方法，该方法包括以下步骤：从生物样本在不混溶的载体流体中创建含水的第一微滴，所述第一微滴中的至少一些被认为含有该细胞类型的细胞；使用虚拟电润湿电极沿着一路径将第一微滴移动到至少一个微滴合并位置；使用真实电润湿电极或虚拟电润湿电极将含水的第二微滴沿着一路经移动到所述微滴合并位置，所述第二微滴含有报告系统，所述报告系统表示特性正在被调查的细胞类型的特性；在合并位置处，合并第一微滴和第二微滴以产生合并的微滴；以及利用光学检测系统分析每个合并的微滴的内容物，并检测细胞和报告系统之间的相互作用的光学信号特性。

该方法最初还可以包括一个或多个分选、培养和液滴制备的初始步骤。这些初始步骤可以包括以下中的一个或多个：(a)从包括含有细胞的微滴和空微滴两者的微滴群体中分离含有细胞的第一微滴；(b)在实行初始步骤(a)之前或之后在引起细胞生长和分裂的条件下培养微滴群体；(c)通过应用电润湿张力从生物样本分离微滴来生成微滴群体。

在初始步骤(c)的一些实施例中，微滴包含被分离到包含油的不混溶载体流体中的生长培养基组分，从而创建可以随后在初始步骤(b)中培养的乳液。在另一实施例中，微滴被分离到空气或另一气体混合物(例如二氧化碳和氮气的混合物)中，并且随后彼此单独地培养。在一些实施例中，定期地清除载体流体中对细胞的培养有害的气体可能是有利的。

在初始步骤(b)的一个实施例中，微滴群体的培养在乳液中并在不混溶的载体流体(诸如烃或氟化油)特别是氟化油的流动流存在的情况下实行。这个油可以可选地进一步包含表面活性剂和其他添加剂，以保持微滴稳定性。油还含有在培养阶段维持细胞生长所需的低水平营养物和气体，并且这个实施例的应用使得微滴的营养物内容物通过界面扩散被周期性地或连续地补充。替代性地，营养物和气体补充可以通过合并含有这些组分的次级含水微滴直接实现；例如在载流体是空气或惰性气体的情况下。在另一实施例中，油被清除某些溶解的气体，以便为细胞提供低氧环境。

在初始步骤(b)的一个实施例中，我们发现为了维持细胞生长，有必要在微滴中维持最佳水平的某些大气气体。例如，不这样做可能导致对微滴介质的ph的不利变化。因此，在初始步骤(b)的一个实施例中，不混溶的载体流体的流动流含有饱和水平的氮、氧或特别地二氧化碳中的一种或多种。

在初始步骤(b)的另一实施例中，通过在保持微滴的位置处施加电润湿力来搅拌或搅动微滴的内容物。合适地，这是使用例如由下述类型的oewod结构递送的光学介导的电润湿力来实现的。我们认为这种方法也具有更广泛的用途，并且因此在本发明的另一普遍适用的第二方面，提供了一种搅拌或以其他方式搅动微滴的内容物的方法，包括以下步骤：将微滴定位在虚拟电润湿电极位置；以及将电磁辐射源施加到该位置，从而激活相对应的虚拟电润湿电极并生成相关联的电润湿力，其特征在于，电磁辐射源在该位置周围移动，以引起微滴的相对应的移动及其内容物的相对应的搅拌或搅动。

在一些实施例中，生物样本可以包括一个或多个雄配子和/或雌配子，并且该方法还可以包括作为体外受精工作流程的一部分对雄配子和/或雌配子的操纵和检查。

例如，使用该仪器可以对雄配子细胞(诸如人类或动物精子细胞)进行检查、选择和测定步骤。在一个示例程序中，从稀释的精液制备精细胞的样本，并将其封装成液滴。液滴被装载到芯片上，并且然后用明场显微镜检查。不含有配子的那些液滴随后被丢弃，并且任何含有的精细胞被保留以便进行检查。一旦选择了配子的样本进行分析，就会拍摄配子的视频以及静止图像。应用于来自光学检测系统的输出的模式识别算法能够针对运动性、主体形态和细胞核形态表征配子。这种表征的结果可以被映射到特定的液滴上，然后取回该液滴以便进行进一步处理。这个处理包括芯片上的测定步骤，诸如添加报告试剂。

在另一示例中，通过封装雌配子(诸如人类或动物卵子)，可以进行卵子受精。与雄配子类似，可以将雌配子封装成液滴，并且装载到芯片中。一旦在装置上，可以检查细胞以获得形态方面的缺陷，并用报告试物剂进行测定。在检查或测定之后，雌配子细胞可以进行可选的处理步骤，诸如通过微滴运动施加的机械剪切或通过添加另外的试剂来去除生发上皮细胞。

在另一示例中，通过将雄配子和雌配子装载到单个微流体装置上，可以将含有两个配子的液滴合并在一起，并使它们结合。在一个示例应用中，大量雄配子小滴与单个卵子合并；配子之间的常规相互作用导致受精和片上胚泡的生成。在另一示例中，单个所选择的雄配子和单个所选择和处理的雌配子在片上结合并且使其相互作用。

在另一示例性应用中，从微流体芯片中回收两性配子，并使用本领域已知的常规处理技术(诸如icsi或ivf)进行结合。

在一些实施例中，可以通过上述方法或通过本领域已知的常规方法形成的胚泡也可以被封装在液滴中并在芯片上进行培养。芯片上培养允许在形期间使用下文描述的成像和检测系统对胚泡进行检查。使用液滴合并操作，胚泡环境可以通过添加额外的物质(诸如缓冲溶液、盐、营养物、蛋白质和细胞外基质物质)来控制。在胚泡形成期间，通常期望的是使用诸如激光显微切割的技术从胚泡中移除细胞的样本，并回收它们以便进行进一步分析。在一些实施例中，胚泡被输送到液滴操纵区。这个操纵区可以包括微流体芯片上的物理特征，诸如柱状物、柱、电润湿板之间的物理限制或电润湿板之间的间隙方面的楔形变化，诸如在pct/ep2019/062791中所述，其公开内容通过引用结合于此。一旦胚泡被装载到操作区中，它有效地被保持固定。然后可以进行激光显微切割(其过程在文献中被很好地描述)，以移除胚泡的一部分。一旦液滴的一部分被切除，本文所述的液滴分裂操作可以用于从胚泡中分离样本部分。通过重复的分裂和重新合并操作以及分裂后对两个液滴之间的物质分布的机器视觉检查，可以验证胚泡和样本部分已经被正确分离。分离后，胚泡的样本部分可以被回收用于进一步分析，例如通过包括聚合酶链反应或dna测序的遗传测试。

合适地，在这个方法中使用的电磁辐射源对应于下面描述的第二电磁辐射，并且包括描述了该位置的周边内或周围的圆形路径的快速闪烁的旋转光源。在另一实施例中，光源的运动可以包括一个或多个侧向运动的路径。在一种表现形式中，位置由直径方面为至少为0.5微米的区域限定，并且运动是圆形的、径向的或两者的混合。该运动是径向的，以生成微滴的内容物的相对应的离心混合。

原则上，可以在步骤(4)中被引入第一微滴中的报告系统可以是具有生物样本中的给定细胞类型或细胞行为的特性或可以用于测定该给定细胞类型或细胞行为的存在的任何系统。这种报告系统包括例如对正在被寻找的细胞类型的细胞表达的酶、蛋白质或抗体有选择性的报告基因、细胞表面生物标记或报告分子。相关一类的报告系统可以是对正在被寻找的细胞所表达的相关物质的存在进行反应的第二报告细胞。许多这样的测定是已知的，并且在许多情况下，适合使用的候选物对于本领域普通技术人员来说是显而易见的。另外，应当理解的是，通过将一种或多种第二微滴类型合并将多个不同的报告系统引入第一微滴，该方法可以被复用，以便对与一系列不同特性和行为相关联的一系列不同细胞类型实行并行和同时的搜索。

本发明的方法及其各种步骤和初始子步骤可以使用下述类型的分析装置方便地实行。下面还描述了适用于该方法的光学检测系统的示例。在一些实施例中，这个装置包括：

分选部件，该分选部件用于将含有细胞的微滴与空的微滴分离成含细胞的第一微滴的群体；

微滴操纵部件，该微滴操纵部件用于随后使用真实电润湿电极或虚拟电润湿电极操纵第一微滴，并且包括：

第一区域，该第一区域包括通过微滴合并将报告系统引入到每个第一微滴的装置；

第二区域，该第二区域位于第一区域内或被定位成与第一区域相邻，其中合并的微滴随后在一个或多个检测窗中被检测；以及

光学检测系统，该光学检测系统用于检测来自合并的微滴的光学信号，该光学信号由报告系统与细胞或所述细胞的表达产物之间的相互作用产生，该光学检测系统选自明场显微镜、暗场显微镜、用于检测化学发光的装置、用于检测福斯特共振能量转移的装置或用于检测荧光的装置。

在这些实施例中采用的分选部件是用于将含有一个或多个细胞的微滴(以下称为“填充微滴”)从较大的群体中分离的装置，该较大的群体中的一些是空的。根据所选择的分选部件的类型，微滴被向下或朝向两个不同的微流体路径或接收位置中的一个引导，这取决于它们是填充的还是空的。在一些实施例中，对这些中的一个或另一个的访问由分隔器或响应于分析窗中每个微滴的分析而作用的机电门的致动来控制。在另一实施例中，通过在分析窗中向微滴流施加响应的光学介导的电润湿力来完成分选，使得所选择的微滴被拉入保持区域或阵列。然后，被拒绝的微滴保留在流中，并且此后可以被丢弃。在另一实施例中，分选决定基于光学现象；例如明场显微镜检查或通过检测与细胞相关的光学性质，例如荧光标签或标记的存在。在另一实施例中，分选可以通过介电泳方法实现，在该介电泳方法中在分析窗中施加临时电场，以将每个微滴依次偏转朝向分隔器的任一侧的两个不同路径中的一个。在一个实施例中，分选部件包括终止于分析腔室的第一微流体通道；在下游侧上连接到分析腔室的至少两个第二微流体通道，该至少两个第二微流体通道中的至少一个运送走第一微滴；光源，该光源用于照射分析腔室；明场显微镜或荧光检测器，该明场显微镜或荧光检测器用于从分析腔室中的每个被照射的微滴获得数据；至少一个oewod结构，该至少一个oewod结构可操作以将微滴沿着两个第二通道中的一个向下引导；以及微处理器，该微处理器适于响应于来自应用于从显微镜或荧光分析仪接收的数据的标识算法的结果来操作该(多个)结构。

在一个实施例中，该装置还包括培养部件，该培养部件或者是该装置本身的一体部件，或者单独地位于分选部件的前面或后面，优选地在分类部件之后。在此，微滴被保持，同时其中含有的任何细胞被培养以便刺激细胞分裂和生长。合适地，培养部件包括容器以及用于将微滴引入其中的入口，在该容器中微滴保持在最佳培养条件下，典型地在25℃以上的范围内(例如，25至40℃)的温度下从一小时至一周。在一个实施例中，培养部件还包括恒温控制的加热器和可选的定时器，该定时器控制装置的填充和排放循环。在一个实施例中，该装置的内容物包括在不混溶的载体流体中的微滴乳液，并且该装置还包括入口和出口，载体流体可以通过该入口和出口，从而允许其随着时间的推移而被更换。在一个实施例中，不混溶的载体流体是氟碳油，诸如hfe7500、hfe7700或fc-40。这种油适当地还含有表面活性剂和其他添加剂，以保持微滴稳定性和维持生长所需的低水平的营养物和气体。

在特定用途的一个实施例(其中含水微滴与油的重量比较低)中，微滴有随时间收缩的趋势，即可能导致它们内的反应性的损失的现象。抵消这种影响的一种方法是使用已经水合的油。由于上述油通常不具有很高的溶解水的能力，水合通过在油相内创建胶束或水或含水缓冲液的次级微滴来合适地实现。这个缓冲物可以具有与微滴本身相同或不同的组成。在一些实施例中，这些胶束或次级微滴可以含有微滴本身盐含量的五倍，并且可选地含有甘油。通常这些胶束和次级微滴小一个数量级。

在一个实施例中，容器还包括表面，该表面设有多个位置，微滴可以位于这些位置处并且使用光学介导的电润湿力搅动这些位置以搅拌它们的内容物；也如上所述。

该装置还包括样本制备部件，该样本制备部件或者与装置本身成一体，或者单独地位于培养部件的上游，该样本制备部件包括用于从生物样本的等分试样在不混溶的载体流体中创建微滴乳液的装置。

这个样本制备部件包括用于将来自生物样本的微滴分离到载体流体中的分离装置，该分离装置包括向生物样本施加电润湿张力的至少一个位置。在一个实施例中，分离装置包括：

第一电润湿位置，该第一电润湿位置适于接收生物样本；

至少一个第二电润湿位置，该第二电润湿位置被布置成使得第一电润湿电极位和第二电润湿电极位置限定一路径，沿着该路径可以使用定向电润湿力来输送从样本分离的微滴；

ac驱动电路，该ac驱动电路布置在第一电润湿位置处，并且包含电极和相关联的ac电路或者由电磁光在其上的入射激活的半导体区，以及

dc充电电路，该dc充电电路布置在第一电润湿位置处，并且适于对生物样本的表面进行静电充电。

在一个实施例中，分离装置还包括用于在驱动电路和充电电路之间切换的控制电路，该驱动电路和充电电路分别适合地为ac电路和dc电路。在另一实施例中，分离装置还包括分析器，用于分析从生物样本产生的每个微滴的内容物。在这方面，生物样本可以是呈任何含水物质的形式，诸如血液、血浆、痰、尿液或从组织活检导出的物质。关于合适的分离装置的另外的信息可以在供读者参阅的我们的共同未决申请ep18201162.7中找到。容易理解的是，与这个分离装置相关联的微滴分离方法可以形成实行上述初始步骤(c)的基础。

转向用于随后操纵由分选部件产生的第一微滴的微滴操纵部件，这适当地是包含第一区域、第二区域和光学检测系统的微流体芯片，该光学检测系统包含通过一个或多个微流体路径链接在一起的真实电润湿电极或虚拟电润湿电极，第一微滴通过气动和/或电润湿力沿着该路径驱动。合适地，电润湿电极是虚拟的，并且建立在一个或多个oewod结构中的位置处。一般而言，这是在该方法中操纵微滴的方式，并且在一个实施例中，这些oewod结构包括：

第一复合壁，该第一复合壁包括：

第一基板；

基板上的第一透明导体层，该第一透明导体层具有在70nm至250nm范围内的厚度；

光活性层，该光活性层被导体层上的在400nm至850nm波长范围内的电磁辐射激活，该光活性层具有在300nm至1500nm范围内的厚度，以及

在光活性层上的第一介电层，该第一介电层具有在30nm至160nm范围内的厚度；

第二复合壁，该第二复合壁包括：

第二基板；

在基板上的第二导体层，该第二导体层具有在70nm至250nm范围内的厚度；和

任选地，在第二导体层上的第二介电层，该第二介电层具有在30nm至160nm范围内的厚度，其中第一和第二介电层的暴露表面被设置成间隔开20μm至180μm，以限定适于容纳微滴的微流体空间；

a/c电源，用于提供连接第一和第二导体层的第一和第二复合壁两端的电压；

具有高于光活性层的带隙的能量的至少一个电磁辐射源，该至少一个电磁辐射源适于入射在光活性层上，以在第一介电层的表面上引发相对应的虚拟电润湿位置；以及

用于操纵电磁辐射在光活性层上的入射点以改变虚拟电润湿位置的布置从而创建至少一个电润湿路径的装置，可以使微滴沿着所述至少一个电润湿路径移动。

在一个实施例中，这些结构的第一和第二壁是透明的，其中微流体空间夹在它们之间。在另一实施例中，第一基板和第一导体层是透明的，使得来自电磁辐射源(例如多个激光束、灯或led)的光能够入射到光活性层上。在另一实施例中，第二衬底、第二导体层和第二电介质层是透明的，使得可以获得相同的目的。在又一实施例中，所有这些层是透明的。

合适地，第一和第二基板由机械上较强的材料制成，例如玻璃金属或工程塑料。在一个实施例中，基板可以具有一定程度的柔性。在又一实施例中，第一和第二基板具有在100μm至1000μm范围内的厚度。在一些实施例中，第一基板包含硅、熔融石英和玻璃中的一种。在一些实施例中，第二基板包含熔融石英和玻璃中的一个。

第一和第二导体层位于第一和第二基板的一个表面上，并且通常具有在70nm至250nm(优选地为70nm至150nm)范围内的厚度。在一个实施例中，这些层中的至少一个由透明导电材料(诸如氧化铟锡(ito))、非常薄的导电金属膜(诸如银)或导电聚合物(诸如pedot)等制成。这些层可以被形成为连续的片或一系列离散的结构，诸如线。替代性地，导体层可以是导电材料的网格，其中电磁辐射被引导在该网格的空隙之间。

光活性层适当地包含半导体材料，该半导体材料可以响应于由第二电磁辐射源进行的刺激而生成局部电荷区域。实例包括厚度在300nm至1500nm范围内的氢化非晶硅层。在一个实施例中，通过使用可见光来激活光活性层。

在第一壁的情况下的光活性层以及可选地在第二壁的情况下的导电层涂覆有介电层，该介电层在厚度方面通常范围从30nm至160nm。这个层的介电性能优选地包括>10∧7v/m的高介电强度和＞3的介电常数。优选地，它在避免介电击穿的同时尽可能薄。在一个实施例中，介电层选自氧化铝、二氧化硅、氧化铪或薄的不导电聚合物膜。

在这些结构的另一实施例中，至少第一介电层(优选两者)涂覆有防污层，以帮助在各种虚拟电润湿电极位置建立期望的微滴/载体流体/表面接触角，并且附加地防止微滴的内容物粘附在表面上并且随着微滴移动通过芯片而减少。如果第二壁不包括第二电介质层，则第二防污层可以直接施加到第二导体层上。为了获得最佳性能，防污层应该有助于建立这样微滴/载体流体/表面接触角，该角当在25℃作为空气-液体-表面三点界面测量时应该在50至170°范围内。在一个实施例中，这些层具有小于100nm的厚度，并且通常是单分子层。在另一实施例中，这些层包含丙烯酸酯(诸如甲基丙烯酸甲酯或其被亲水基团(例如烷氧基甲硅烷基)取代的衍生物)的聚合物。防污层中的一层或两层是疏水的，以确保最佳性能。在一些实施例中，厚度小于20nm的二氧化硅的间隙层可以置于防污涂层和介电层之间，以便提供化学相容的桥接部。

第一和第二介电层以及因此第一和第二壁限定了微流体空间，该微流体空间在宽度方面至少为10μm，并且优选地在20至180μm的范围内，并且微滴包含在该微流体空间。优选地，在它们包含微滴之前，微滴本身具有比微滴空间的宽度大10％以上，合适地大20％以上的固有直径。通过这种方式，在进入芯片时，使微滴经受压缩，从而通过例如更好的微滴合并能力导致增强的电润湿性能。

在一个实施例中，第一和第二介电层涂覆有疏水涂层，诸如氟硅烷。

在另一实施例中，微流体空间包括一个或多个间隔物，用于将第一和第二壁隔开预定的量。间隔物的选项包括珠或柱状物、由已经通过光图案化产生的中间抗蚀剂层产生的脊部。替代性地，沉积材料(诸如氧化硅或氮化硅)可以用于创建间隔物。替代性地，薄膜层(包括具有或不具有粘合剂涂层的柔性塑料膜)可以用于形成间隔物层。各种间隔物几何形状可以用于形成由柱状物行限定的窄通道、锥形通道或部分封闭的通道。通过精心设计，可以使用这些间隔物来帮助微滴的变形，随后对变形的微滴进行微滴分裂和效果操作。类似地，当在液压下装载芯片时，这些隔离物可以用于物理分离芯片的各个区，以防止液滴群体之间的交叉污染并促进液滴在正确的方向上流动。

使用附接到导体层的ac电源偏置第一和第二壁，以在其间提供电压电势差；合适地在10至50伏的范围内。

这些oewod结构通常与波长在400nm至850nm的范围内(优选为660nm)且能量高于光活性层的带隙的第二电磁辐射源结合使用。合适地，光活性层将在虚拟电润湿电极位置被激活，在这些位置，所使用的辐射的入射强度在0.01至0.2wcm^-2的范围内。在一个实施例中，电磁辐射源被像素化，以便在光活性层上产生相对应的也被像素化的光激发区域。通过这种方式，在第一介电层上感应出像素化的虚拟电润湿电极位置。

在电磁辐射源被像素化的情况下，使用反射屏(诸如由来自led或其他灯的光照射的数字微镜器件(digitalmicromirrordevice，dmd))直接或间接地供应电磁辐射。这使得虚拟电润湿电极位置的高度复杂的图案能够在第一介电层上被快速创建和破坏，从而使得微滴能够使用紧密控制的电润湿力沿着基本上任何虚拟路径被精确操控。这在需要芯片沿着多条路径同时操作数千个这样的微滴的情况下也是特别有利的。这种电润湿路径可以被视为由第一电介质层上的虚拟电润湿电极位置的连续体构成。

电磁辐射源在光活性层上的入射点可以是任何方便的形状，包括常规圆形或环形。在一个实施例中，这些点的形态由相对应的像素的形态确定，而在另一实施例中，一旦微滴进入微流体空间，这些点的形态全部或部分对应于微滴的形态。在一个实施例中，入射点以及因此电润湿电极位置可以是新月形的，并且被定向在微滴的预期行进方向上。合适的是，电润湿电极位置本身小于粘附到第一壁上的微滴表面，并且在微滴和表面电介质之间形成的接触线上给出最大的场强梯度。

在oewod结构的一个实施例中，第二壁还包括光活性层，该光活性层使得能够通过相同或不同的电磁辐射源在第二电介质层上感应出虚拟电润湿电极位置。添加第二介电层使得微滴的润湿边缘能够从该结构的上表面过渡到下表面，并且向每个微滴施加更多的电润湿力。

在一个实施例中，形成该装置一部分的第一区域是容纳储存器，其包括用于引入第一微滴的入口和通过电润湿路径附接到第二区域的出口。第一区域还包括用于引入报告系统的端口，在一个合适的实施例中，该端口是用于引入第二含水微滴的第二入口，该第二含水微滴包含被设计为标识第一微滴中包含的细胞的性质的报告系统。在一个实施例中，储存器还包括位置阵列，第一微滴可以保持在这些位置，同时第二微滴在这些位置上被驱动，在该过程中引起第一和第二微滴的一定程度的合并。然后，所合并的第一/第二微滴(以下称为“所合并的微滴”)可以保持在这些位置，直到报告系统已经与细胞充分相互作用，从而随后生成最佳光学信号，此时这些微滴通过电润湿被输送到第二区域。在某些情况下，可能期望的是使用时间分辨测量来监控光信号的增长。在一个实施例中，采用涵括第一和第二区域两者的职责的单个区；例如通过在上述的合并位置处检测合并的微滴。第二区域合适地包含一个或多个检测窗，通过该一个或多个检测窗可以使用光学检测系统分析所合并的微滴。在一个实施例中，第二区域是芯片的透明区段。在另一实施例中，光学检测系统被设计成检测来自微滴的由报告系统和细胞或其表达产物之间的相互作用产生的光学信号。合适地，光学检测系统选自明场显微镜、暗场显微镜、用于检测化学发光的装置、用于检测福斯特共振能量转移的装置或用于检测荧光的装置。在一个实施例中，检测系统还包括用于照射所合并的微滴的光源和/或用于从检测器中的一个接收信号并以例如视觉显示或计数的形式向用户提供数据的微处理器。在一个实施例中，微处理器还通过反馈回路适于控制分选部件的性能、响应于由光学检测系统检测的信号将第一微滴引入第一区域的速率以及第一微滴和包含报告系统的微滴的合并速率中的一个或多个。

使用oewod结构进行液滴操纵的仪器的特别的优点是聚焦在样本上的光学寻址系统内置到仪器中。通过将光学检测所需的激发光和发射光与oewod控制所需的照射进行复用和解复用，可以将许多光学功能整合到一个更简单且成本更低的组件中。例如，可以使用长通分色镜将来自操纵柱的光转向到高灵敏度检测摄像机，从而对来自组件的照射发射进行解复用。另一实施例使用两个分色镜；第一镜用于复用来自灯的荧光激发光，并且第二镜用于解复用荧光发射。对于需要更复杂的照射方案(诸如时间分辨福斯特共振能量转移)的实施例，有利的是采用相同的结构化照射系统，该系统处理oewod操纵图案以应用时间相关且空间变化的照射图案。除了将分色镜用于这些复用操作之外，还可以使用诸如色散滤波器、色散透镜或光栅的元件。对于一些应用，执行时间复用是有利的，由此结构化照射系统被用于在激发源之间快速切换。

在一些实施例中，该装置还包括用于从第一和/或第二区域回收微滴的第三区域。在此，第一微滴可以被细分和隔离，以便以后从仪器中回收，例如以便获得更详细的验证性分析。在一个实施例中，第三区域包含来自连接到临时储存容器的第二区域的一个或多个出口。通过使用oewod输送机制补充第一和第二区域，可以按顺序执行微滴的多次回收，从而能够从一个端口分离地回收多个微滴。

除了光学介导的操纵外，该装置还可以包括泵和阀的网络，以通过选择性地向各个入口和出口施加液压来操纵装置内部的流动。优选地，这个网络包括连接到每个出口的两位阀和连接到相同阀的一组压力源(诸如泵)、收集容器和储存器。通过改变每个阀的构型，可以通过储存器和收集容器在装置内施加正压或负压，并且因此使物质流入、流出装置或在装置内流动。

上述本发明的装置和相关联的方法具有许多有益的应用。下面描述了一些示例应用和相关联的工作流。

所公开的装置和方法的一个示例应用是开发遗传修饰的细胞系。

在这个应用中，靶细胞通过样本制备部件的基于光学介导的电润湿的分离装置被封装在第一微滴中。转染试剂(例如经修饰的慢病毒)被封装在分离的第二微滴中。

然后，在如上所述的合并操作中，在oewod装置上合并第一和第二微滴，以形成经合并的微滴，使靶细胞暴露于转染试剂。将合并的微滴中的细胞置于合并和分裂操作的循环中，其中细胞群体在微滴中被分开，并且细胞周围的培养基通过连续稀释、补充耗尽的物质和去除已经积聚在液滴内的任何细胞排泄物而与新鲜培养基交换。

跟踪微滴群体中的每个细胞的位置，例如在测定期间通过显微镜检查，使得能够标识来自共同祖先的细胞用于分选目的，从而确保所培养的细胞群体的单克隆性。

与细胞系开发的常规方法相比，细胞保留率也增加，因为在所描述过程期间，没有已知会降低细胞的活力的冻融、分配、人工处理或反复长期传代的有害步骤。类似地，将细胞保持封装在液滴中消除克隆细胞相对于液体处理仪器表面丢失的可能性。另外，在这个过程中早期可以发现无活性细胞，并且替代地以活性细胞更换。

一旦确定所合并的微滴中的细胞已经培养持续足够长的时间，将包含报告测定的第三试剂引入到oewod装置中，并将其与含有靶细胞的微滴合并。可以根据例如所检测的荧光、化学发光或福斯特共振能量转移来测量报告测定的结果。

基于报告测定的结果，可以丢弃细胞的一个或多个第一亚群，并且可以使细胞的一个或多个第二亚群进一步增殖。从所培养的靶细胞亚群中取出样本，并将其从芯片中分配到孔板中(例如标准1536孔板)，用于芯片外的进一步分析。保留所培养的亚群的剩余祖细胞，用于芯片上的进一步培养。

然后对所取回的样本进行一次或多次芯片外分析，诸如：dna测序、rna测序、pcr分析、遗传图谱和微阵列测量。基于芯片外分析的结果，可以选择、取回和进一步培养芯片上的细胞的另外的亚群。

本发明的另一应用示例是筛选细胞以获得免疫功能。

在利用抗原(诸如毒素或疾病特性的生物标志物)进行免疫后，可以从生物体(诸如小鼠、人或灵长类动物)中收获天然免疫细胞(诸如b细胞、t细胞或树突细胞)的样本。然后对细胞进行处理和纯化，以便将其与周围组织、淋巴、血细胞和来自宿主生物体的其他组分分离。这可以通过解剖、离心、免疫沉淀、过滤和透析的混合来实现。

经纯化的免疫细胞被封装在微滴中，并被装载到oewod装置上。然后在第一测定中，将试剂(诸如免疫测定试剂、fret报告或报告细胞系)引入到含有靶细胞的微滴中。这可以如上所述通过创建试剂的第二微滴并实行合并操作来进行。

例如通过光学检测或显微镜检查来询问第一测定的结果，以确定靶细胞是否响应于免疫测定试剂而分泌出诸如抗体的蛋白质。基于第一测定的结果，含有靶细胞的微滴的亚群可以从装置中丢弃，而另一亚群被保留用于进一步的测试。

然后，第二试剂(诸如非靶报告)可以以类似于第二芯片上测定中的剩余的含有细胞微滴的方式引入。第二测定的结果利用诸如荧光光谱的光学技术进行测量，从而导致微滴亚群的第二轮选择和丢弃。可以重复上述过程，以使用一系列不同的报告测定来询问/筛选靶细胞，从而测量靶细胞对靶上物、脱靶物和无关靶的响应。

如本文所用，术语“靶上物”是指感兴趣的组织或抗原，并且靶细胞诸如对其产生应答抗体。例如，靶上物可能是癌组织。如本文所用，术语“脱靶物”是指在其中观察到或预期到不期望的影响的组织。脱靶物的示例可以是靠近癌组织或与癌组织相关联的健康组织。如本文所用，术语“不相关靶”是指预期与抗体没有生物学相互作用，但其可能对测定结果的准确性有负面影响(例如将大量抗体结合到没有有用的末端或混淆测量)的物质。

基于筛选测定的测量结果，选择细胞的最终亚群。然后将含有最终亚群的剩余的含有细胞微滴引入到所选择的裂解试剂和cdna合成试剂，以形成目前在靶细胞中表达的基因文库。从芯片外回收感兴趣的细胞，并使其经过基因测定，该测定指示编码dna负责芯片上表型测定中观察到的行为。

本发明的另一示例应用是筛选药物功能和功效，包括免疫调节药物和用于肿瘤抑制的药物。

在这种应用中，一系组药物靶细胞被封装在第一微滴中，并被装载到oewod装置上。还装载上包括用于测试的一系组药物化合物的一组第二微滴。

剂量测定系组通过对第二微滴进行的合并和分裂操作以创建含有各药物化合物的稀释范围的微滴的系组来形成。药物化合物可以呈微珠的形式、封装在囊泡中、或者由封装在液滴中的生产细胞表达。通过合并操作将药物剂量测定系组引入靶细胞；在含有微滴的第一细胞和药物剂量测定系组中的微滴之间的详尽的成逐对组合过程确保整个系组在复制中暴露于每种细胞类型。效应细胞(例如t-杀伤细胞或巨噬细胞)也可以与药物系组和靶细胞一起引入，以测试药物在调节免疫响应中的作用，并对存在不同组织的情况下的免疫响应进行详细的交叉比较。

靶细胞对药物系组的响应可以通过例如显微镜检查、荧光报告染色或报告测定来监控。筛选过程的结果可以用于告知受试药物在各种细胞和效应细胞条件下的效力。

本发明的另一应用示例在于诱导靶干细胞的分化。

在这种应用中，靶干细胞(例如诱导的多能干细胞、胚胎干细胞、间充质干细胞或造血干细胞)被封装在第一微滴中并被装载到oewod装置上。

一系组控制试剂化合物(例如生长因子、环境刺激剂、细胞间信号传导化合物和形态发生剂)被封装到第二微滴中，并且也被装载到oewod装置上。

第一微滴的亚群与含有对照试剂的第二微滴合并，以便将包含在第一微滴中的干细胞暴露于试剂，并且因此促进干细胞沿着靶途径的分化。

干细胞分化过程通过例如显微镜成像、表型报告化合物的检测以及通过进行报告监测来监控。所合并的微滴中的分化细胞可以通过分配步骤从oewod装置中回收，用于进一步培养或处理。

本发明的又一示例性应用在于组织体结构的受控形成。

在这个应用中，组织体祖细胞(例如肿瘤细胞或干细胞)被封装到第一微滴中，并被装载到oewod装置上。一系组控制试剂(例如生长因子、环境刺激剂、细胞间信号传导化合物和形态发生剂)被封装到第二微滴中，并且也被装载到oewod装置上。包含在第一微滴中的组织体祖细胞群体的亚群通过合并操作暴露于对照试剂，以便促进组织体和组织结构的形成。如此形成的组织体可以存储在oewod装置上的芯片上的专用区域，并通过液滴合并操作供应营养物和任何其他所需的生长培养基。以这种方式储存在芯片上的组织体可以进行药物筛选测定，如关于以上示例应用中所述。

本发明的另一示例应用在于crispr-cas9基因修饰筛选。

在这种应用中，靶细胞被封装在第一微滴中，并被装载到oewod装置上。包括一系组grna对的第二组微滴也被装载到该装置上。装载该系组grna对可能包括这样的准备步骤，即将冻干的grna点样到装置表面的靶区域，并且随后通过使微滴通过它们来重新水合包含该系组的区域。

这可以呈珠预备步骤的形式，在该珠预备步骤中grna结合到微珠上，并且这些珠被点样并冻干到流体的表面上。

通过合并操作将grna导入到靶细胞，这使得靶细胞与可编程限制酶(诸如cas9)以及在靶细胞中诱导遗传修饰所需的试剂一起占据grna。

将所合并的微滴中的细胞置于合并和分裂操作的循环中，其中细胞群体在微滴中被分开，并且细胞周围的培养基通过连续稀释进行交换。

跟踪微滴群体中的每个细胞的位置使得能够标识来自共同祖先的细胞用于分选目的，从而增加所培养的细胞群体的单克隆性。细胞保留率也增加。

一旦确定所合并的微滴中的细胞已经培养持续足够长的时间，将包含报告测定的第三试剂引入到oewod装置中，并将其与含有靶细胞的微滴合并。可以根据例如所检测的荧光、化学发光或福斯特共振能量转移来测量报告测定的结果。

基于报告测定的结果，可以丢弃细胞的一个或多个第一亚群，并且可以使细胞的一个或多个第二亚群进一步增殖。从所培养的靶细胞亚群中取出样本，并将其从芯片中分配到孔板中(例如标准1536孔板)，用于芯片外的进一步分析。保留所培养的亚群的剩余祖细胞，用于芯片上的进一步培养。

然后对所取回的样本进行一次或多次芯片外分析，诸如：dna测序、rna测序、pcr分析、遗传图谱和微阵列测量。基于芯片外分析的结果，可以选择、取回和进一步培养芯片上的细胞的另外的亚群。

具体实施方式

现在参考图1示出示例装置和相关联的示例性工作流程。

流体入口1接纳氟碳油中的空的和含有细胞的第一微滴的混合物的乳液2。然后，这些第一微滴通过oewod结构(未示出)被转移到分选区3，在该分选区中，所述第一微滴通过光学装置或通过如上所述的其它分选装置被分选成空的第一微滴4和含有细胞的第一微滴5。此后，含有细胞的微滴5中的每一个也都被转移到合并区8，也是通过oewod结构，在所述合并区，所述第一微滴在促进细胞生长和分裂的条件下保持持续限定的时间段。在这个时段结束时，第二入口6接纳第二微滴，该第二微滴包含对感兴趣的细胞类型7有选择性的荧光报告系统，然后这些第二微滴在合并区8与含有细胞的第一微滴5合并以形成所合并的微滴9。然后，所合并的微滴9借助于oewod结构被转移到光学窗10，在该光学窗中，使用包括led光源、光电探测器和微处理器的光学检测仪器11检测报告系统的荧光信号特性。光学检测仪器11部分地与光学操纵投影仪12结合。

图2示出了示例性装置的横截面图，该装置包括适用于快速操纵被乳化成氟碳油的含水微滴2的oewod结构，该氟碳油在25℃下具有5厘沲或更低的粘度，并且该含水微滴在其未受限状态下具有120μm的直径(例如，在80μm至120μm的范围内)。所述装置包括顶部玻璃板和底部玻璃板(13和14)，所述玻璃板每一个都厚500μm，涂覆有厚度为130nm的透明导电氧化铟锡层(ito)15。15中的每一个都连接到a/c电源16，且14上的ito层接地。14涂覆有800nm厚的非晶硅层17。13和17各自涂覆有160nm厚的高纯度氧化铝或氧化铪层18，所述层依次涂覆有二氧化硅间隙层，该间隙层支撑三氯(lh、2h、2h-全氟辛基)硅烷层19，以使18的表面疏水。13和17使用间隔物被间隔开80μm，使得微滴在被引入到装置中时受到一定程度的压缩。由led光源20照射的反射像素化屏幕的图像通常设置在14下方，并且从每个二极管21发射0.01wcm^-2水平的可见光(波长660或830nm)，并通过在通过14和15的多个向上箭头的方向上传播而入射在17上。在不同的入射点，电荷的光激发区域22在17中创建，这在18中在相对应的电润湿位置23处引起修改的液-固接触角。这些修改的性质提供了将微滴2从一个点23推进到另一点所必需的毛细作用力。20由微处理器24控制，该微处理器通过预先编程的算法确定在任何给定时间照射阵列中的21中的哪一个。