大孔琼脂糖的制作方法

文档序号:26098866发布日期:2021-07-30 18:09阅读:247来源:国知局
本发明涉及适用于生物样品的分离/纯化的多孔的交联的琼脂糖凝胶珠。颗粒特别适用于从生物样品中分离病毒颗粒,例如腺病毒。本发明进一步涉及制备所述珠的方法及其在分离/纯化应用中的用途。
背景技术
:琼脂糖是从红藻中提取的天然多糖。它是琼脂的两种主要组分之一,并通过去除另一种组分(琼脂胶)而从琼脂中纯化。在低温下在水性溶液中,琼脂糖形成水凝胶,该水凝胶形成含有孔的网络。孔径取决于加入的琼脂糖的浓度。从1960年代以来,琼脂糖凝胶(通常为球形珠的形式)已经在纯化应用中用作色谱法介质,并且各种分子量和性质的各种不同的琼脂糖是可商购获得的。琼脂糖凝胶具有许多有利的特性,例如高亲水性、高孔隙率和可用于官能化的羟基。琼脂糖经常在例如亲和色谱法、疏水相互作用色谱法(hic)、反相色谱法(rpc)和离子交换色谱法(iec)中用作基质。这些和其它色谱技术通常用于纯化生物样品(例如生物液体),通常用于分开存在于生物样品中的一种或多种组分(例如一种或多种生物分子(例如病毒))或去除不需要的组分。最常见地,病毒的分离/分开通过iec使用具有配体的基质来实现,其中特定的病毒对所述配体具有亲和性。使用iec分离病毒的合适的配体包括硫酸盐配体(s-配体)和季胺配体(q-配体)。例如,流感病毒通常通过iec使用与s-配体连接的基质分离/分开,而腺病毒的分离使用q-连接的基质(例如交联的琼脂糖基质)进行,q-配体直接或经由葡聚糖增量剂连接至所述q-连接的基质。除了色谱分离方法,磁性分离可以用于生物分子的分离/分开。在该方法中,使用携带适当配体的磁性珠。所需生物分子结合到配体,然后通过使用磁力分离器通过磁场实现分离。用于色谱分离应用的球形琼脂糖凝胶珠通常通过基于相分离的方法获得,包括例如悬浮凝胶化、喷雾凝胶化等。这些方法的基本过程是通过机械搅拌或喷雾将琼脂糖浓度通常在4-6%w/v范围内的水性琼脂糖溶液分散到有机相中。然后,这样形成的液滴在冷却时固化。用于磁性分离的磁性珠通常通过在将水性琼脂糖溶液分散到油相中之前将磁性材料加入到水性琼脂糖溶液中来制备。为了获得更刚性的珠,其将更好地承受在柱色谱法的方法中通常施加的压力,琼脂糖凝胶通常是交联的。交联通常通过使形成的珠与交联剂反应来实现。生物产品通常用于细胞生物学以及生物化学研究和工程领域内的许多应用中。生物产品例如用于药物开发,并且当今许多药物是所谓的生物制剂或生物药物,即从生物来源(例如血液、血液产品、体细胞、细菌、病毒、抗体等)中制造、提取或半合成的药物产品。此外,生物产品经常用于病毒疫苗领域,其中样品(例如含有生物产品的实例裂解物或血清)用作病毒来源。其中使用生物产品的另一个实例是基因治疗领域,其中病毒用作旨在用于治疗应用的基因的运载体。在通常用于基因转移的方法中,基于腺病毒的载体已被证明是特别有前途的。腺病毒是属于腺病毒(adenoviridae)科的直径为约90nm的无包膜dna病毒。腺病毒科由大量血清型和若干属组成,其可能感染动物和人两者。wo98/26048涉及通过阴离子交换色谱法随后通过尺寸排阻色谱法的病毒纯化。wo2006/052088涉及多孔碳水化合物颗粒的分离基质,其中抗体结合蛋白配体已经固定至所述多孔碳水化合物颗粒的分离基质。该基质适用于单克隆抗体的纯化。wo2008/039136涉及包含不溶性运载体的分离基质,硫酸盐配体经由增量剂连接至所述分离基质。所公开的基质适用于病毒的纯化,尤其是流感病毒的纯化。wo97/38018涉及生产多孔的交联的多糖凝胶的方法,其中在乳液和凝胶形成之前将双官能交联剂引入多糖溶液中。us6,537,793涉及使用选自琼脂糖、葡聚糖、丙烯酰胺、二氧化硅和聚[苯乙烯-二乙烯基苯]的基质的病毒纯化。更具体地说,本发明涉及通过离子交换色谱法纯化和定量腺病毒的方法。据称使用强阴离子交换剂是特别有利的,特别优选的是qsepharosexl,其是q-基团已经经由葡聚糖连接至其的琼脂糖基质。用于分离和/或分开生物分子的现有技术的珠和色谱法基质通常被优化用于分离/分开尺寸在5-10nm范围的颗粒,例如生物分子,如抗体、蛋白质、核酸等。较大的颗粒(例如病毒)通常使用特异性病毒相互作用配体已经连接至其的珠来分开。在一些现有技术的珠中,经由增量剂连接配体。在这些情况下,大的(病毒)颗粒基本上仅结合到珠的外表面,导致结合能力低。技术实现要素:在一个方面,本发明提供了制备多孔的交联的琼脂糖凝胶珠的方法,包括以下步骤:a)乳化,(i)制备琼脂糖浓度为0.3-0.8%w/v的琼脂糖水相(w),(ib)任选地加入磁性材料,例如磁铁矿,(ii)制备其中溶解有至少一种乳化剂的水不混溶性油相(o),(iii)将所述水相(w)和所述油相(o)混合,以获得w/o乳液,(iv)使所述w/o乳液形成珠。b)通过使所述珠与交联剂反应而使所述乳化的琼脂糖交联一次或多次,c)任选地,配体的偶联。在另一方面,本发明涉及多孔的交联的琼脂糖凝胶颗粒,其可通过以上公开的方法获得。在进一步的方面,本发明涉及多孔球形交联的琼脂糖凝胶珠,其琼脂糖浓度为约0.3-0.8%w/v或干重为约5-15mg/ml,并且任选地包含磁性材料。在进一步的方面,本发明涉及分离基质,其包含根据上述方法制备的多孔的交联的琼脂糖凝胶珠。在进一步的方面,本发明涉及将液体中的颗粒与所述液体中的其它组分分离的方法,包括以下步骤:a)使所述液体与如上所述的分离基质接触以允许吸附和/或吸收所述颗粒,b)任选地洗涤所述分离基质,c)通过加入释放所述颗粒的液体从所述基质中洗脱所述颗粒,d)从所述洗脱液中回收所述颗粒。在进一步的方面,本发明涉及如上所述的多孔的交联的琼脂糖凝胶珠在亲和色谱法、离子交换色谱法、疏水相互作用色谱法、反相色谱法、螯合色谱法、共价色谱法、尺寸排阻色谱法中作为基质的用途。根据本发明的珠尤其可用于分离大颗粒,例如尺寸为约20-400nm的颗粒。特别地,所述珠可用于分离病毒颗粒,例如生物样品中的病毒颗粒。孔足够大,使得颗粒可以与内部孔表面相互作用,并且珠对于机械处理具有足够的弹性,特别是在其中可以使用包含磁性材料的珠的间歇吸附方法中。具体实施方式定义和缩写本文所用的术语“生物分子”是指在活的生物体中天然存在的分子。生物分子包括大分子(如病毒、蛋白质、碳水化合物、脂质和核酸)以及小分子(如初级和次级代谢物和天然产物)。本文所用的术语“增量剂”是指与琼脂糖共价连接的分子,例如聚合物。本文所用的术语“配体”是指能够与靶化合物(例如生物分子,例如病毒)相互作用的分子。本文可互换使用的术语“分离基质”和“基质”是指增量剂和/或配体可以连接至其的不溶性运载体。本文所用的术语“树脂”是指用作色谱法介质的分离基质。根据本发明,树脂由琼脂糖凝胶珠构成。本文所用的术语“离子容量”是指携带配体的基质结合离子物类的容量。离子容量通常通过本领域已知的滴定方法确定,并表示为微摩尔或毫摩尔/ml沉降的基质。本文所用的术语“结合能力”是指基质结合颗粒物类(例如病毒颗粒)的能力。除了上述定义之外,本文使用以下缩写。如果本文所用的缩写没有定义,则意味着其具有其通常接受的含义。dbc动态结合能力ech表氯醇gmac缩水甘油基三甲基氯化铵vp一种或多种病毒颗粒最常见的是,腺病毒的分离/分开通过离子交换色谱法使用具有q-配体的基质来实现。q-配体是非常无选择性的,因为通常存在于原始病毒进料中的许多其它蛋白质也与之结合。因此,使用q-配体的色谱方法不能以简单和有效的方式提供纯腺病毒,并且可能需要重复和/或互补的纯化步骤。鉴于现有技术,在许多方面需要从生物产品中分离/分开颗粒(例如生物分子,例如病毒),尤其是用于医学和诊断领域。在实验室规模和大规模生产两者中,都需要提供增加的容量和更有效的分离和分开颗粒(尤其是大生物分子)的改进的方法。用于色谱法分离基质的琼脂糖凝胶珠通常配备有配体,所述配体连接于琼脂糖的表面,连接于珠的外表面和珠的孔内的表面两者。在使用这样的基质分离液体中的颗粒期间,使液体与基质接触以使颗粒能够吸附到配体。对配体没有亲和力的液体中的其它组分将通过基质而不被吸附,并且可以容易地被洗掉。影响基质容量的一个重要因素是可用于吸附待分离/分开的颗粒(例如生物分子)的珠的有效表面积。表面积取决于琼脂糖凝胶珠的孔径与颗粒尺寸的关系,并因此改进基质容量的一种方式是使用孔径足够大以使颗粒能够进入孔中的珠。优选地,珠的孔径为待分离的颗粒尺寸的约两倍。用于分离基质的现有技术的珠通常被优化用于分离较小的颗粒,即尺寸在5-10nm范围内的颗粒,例如生物分子,如抗体、蛋白质、核酸等。当使用现有技术的珠从生物样品(例如细胞裂解物、血清等)中分离较大颗粒(例如病毒颗粒)时,与待分开的颗粒相互作用的可用表面积因此被限制在珠的外部。因此,珠对较大颗粒的容量明显低于对较小颗粒的容量,并因此需要较大量的珠、较大的分离柱、较大量的溶剂等用于它们的分离。在琼脂糖凝胶的制备中形成的琼脂糖珠的孔径取决于例如水相中琼脂糖的含量。低琼脂糖含量提供具有较大孔径的珠,反之亦然。已经显示,根据本发明的方法制备的珠具有足够大的孔径以使大颗粒(例如直径为约20-400nm的颗粒)能够进入孔中。典型的现有技术琼脂糖珠使用约4-6%w/v的琼脂糖含量制备,因此提供适用于过滤方法和/或分离尺寸为约5-10nm的颗粒的珠。根据这些现有技术的方法制备的琼脂糖珠通常产生粒度在40-80μm范围内的琼脂糖珠,而根据本发明的方法制备的琼脂糖珠的尺寸在40-200μm范围内。因此,在一个方面,本发明提供了制备多孔的交联的琼脂糖珠的方法,包括以下步骤:(a)乳化,(i)制备琼脂糖浓度为0.3-0.8%w/v的琼脂糖水相(w),(ib)任选地加入磁铁矿,(ii)制备其中溶解有至少一种乳化剂的水不混溶性油相(o),(iii)将所述水相(w)和所述油相(o)混合,以获得w/o乳液,(iv)使所述w/o乳液形成珠。(b)通过使所述珠与交联剂反应而使所述乳化的琼脂糖交联一次或多次,(c)任选地,配体的偶联。更具体地,在步骤(a)(i)中,以预定的浓度制备琼脂糖水性溶液。在步骤(a)(i)中获得的溶液将构成水相,并表示为w。水相中的琼脂糖浓度在0.1-1%w/v之间的范围内,例如在0.3-0.8%w/v范围内,并且更特别地在0.4-0.6%w/v范围内。用于本发明的琼脂糖通常是标准琼脂糖,但也可以是琼脂糖的任何合适的衍生物,即已被化学修饰的琼脂糖。例如,可以使用羟乙基琼脂糖、羟甲基琼脂糖或烯丙基琼脂糖。在这些类型的衍生的琼脂糖中,链内氢键的数量减少,导致比天然琼脂糖更低的熔融和胶凝温度。确切的温度由取代的程度确定。这些衍生的琼脂糖通常称为低熔点(lmp)琼脂糖。一些类型的琼脂糖可能仅在8-15℃下胶凝。这些类型的琼脂糖称为超低熔融或胶凝温度琼脂糖。通过在水中将适量的琼脂糖在搅拌下混合而制备琼脂糖水性溶液。通常需要升高的温度以使水-琼脂糖混合物中的琼脂糖进入溶液,例如高于琼脂糖熔点的温度。合适的温度将取决于所用的琼脂糖的类型,并且通常高于80℃,例如90℃或更高。该方法还可以包括磁性珠的制备。在这种情况下,将步骤(ib)加入到该方法的步骤a)中。在步骤(ib)中,在将水相(w)与油相(o)混合之前,将磁性材料(例如磁铁矿颗粒)加入到在步骤a)(i)中获得的水相中。具体地,可以在加入琼脂糖之后立即将磁性材料加入到琼脂糖和水的混合物中。磁性材料的浓度通常在10-90g/l琼脂糖溶液的范围内,例如30-70g/l琼脂糖溶液或40-60g/l琼脂糖溶液。典型地,磁性材料的浓度为50g/l琼脂糖溶液。在步骤a)(ii)中,制备水不混溶性油相(o)。在油相中,溶解/分散至少一种油溶性和/或油分散性乳化剂。合适的乳化剂的实例包括乙基纤维素、脱水山梨糖醇酯例如乙氧基化的脱水山梨糖醇酯(tweentm)、脱水山梨糖醇倍半油酸酯(例如arlaceltm83)、脱水山梨糖醇三油酸酯(例如spantm85)、脱水山梨糖醇单油酸酯(例如spantm80)、脱水山梨糖醇三硬脂酸酯(例如spantm65)、聚甘油酯例如六甘油五油酸酯(po-500、po-310)、聚乙二醇氢化蓖麻油或亲脂性-亲水性嵌段聚合物。油相中的乳化剂的浓度可以例如在0.1-2.0%w/v之间,例如在0.5-1.0%w/v之间,并且水相与油相的体积比可以是2:1-1:100,例如2:1-1:10或1:1-1:10。在步骤a)(iii)中,通过将水相(w)和油相(o)混合获得乳液。混合通常通过常规混合技术(例如使用顶置式搅拌器或通过静态混合)来实现。在混合两相之前,将它们适当地来到相同的温度。当混合各相时,各相的合适温度是高于所用琼脂糖的胶凝点的温度,并因此取决于所用的琼脂糖的类型。由于衍生的琼脂糖(例如甲基琼脂糖、羟乙基琼脂糖或烯丙基琼脂糖)较低的胶凝温度,优选在比天然琼脂糖更低的温度下混合衍生的琼脂糖。例如,将水相(w)和油相(o)在约40-70℃的温度下(例如50-60℃)混合。在超低熔融或胶凝温度琼脂糖的情况下,各相可以在约20-30℃的温度下混合。在步骤a)(iv)中,通过冷却至低于胶凝温度的温度,使w/o乳液液滴固化,即胶凝成琼脂糖珠。当获得所需尺寸的珠时,使乳液达到胶凝温度或更低。对于天然琼脂糖,这可以方便地为10-30℃或室温,即约20℃的温度。对于超低胶凝温度琼脂糖,可能需要更低的温度,例如0-8℃。在替代的方法中,通过膜乳化获得珠。在该方法中,迫使在步骤a)(iii)中获得的分散相通过微孔膜的孔。因此形成乳化的液滴,并利用逐滴机理在孔的末端分离。在上述制备方法的一个具体实施方案中,步骤a)具体如下:(i)在高于琼脂糖的熔点的温度下制备浓度为0.4-0.6%w/v的琼脂糖水相(w),(iii)在约40-70℃的温度下混合水相(w)和油相(o),和(iv)使w/o乳液达到低于胶凝温度的温度(通常10-30℃,例如约22℃)并形成颗粒。高孔隙率的珠(如本文所公开的琼脂糖珠)通常是柔软的并且容易压碎。通过交联琼脂糖,可以改进珠的强度。因此,为了获得具有改进的物理稳定性以及改进的流动和填充以及流动特性的珠,其将更好地承受在柱色谱法期间经常施加的压力,本发明的方法包括使在步骤a)中提供的交联琼脂糖凝胶珠的步骤。因此,在步骤b)中,通过使珠与交联剂反应,将乳化的琼脂糖珠交联一次或多次。交联通常通过使用本领域技术人员公知的方法和试剂使形成的珠与交联剂反应来实现。合适的交联剂通常是双官能化合物,即具有两个可与琼脂糖的羟基反应的官能团的化合物,例如表氯醇或二环氧化物。在替代的方法中,交联可以在步骤a)(iv)的珠形成之前通过使琼脂糖与杂双官能试剂反应来进行,即在步骤a)(iii)中获得的w/o乳液中的琼脂糖上进行。典型的实例是通过溶液中的琼脂糖与烯丙基卤化物或烯丙基缩水甘油基醚反应获得的烯丙基琼脂糖溶液。然后,在珠的乳化和固化之后,烯丙基可以用于交联,例如通过溴化以形成能够与琼脂糖聚合物中的羟基发生交联反应的反应性溴醇和/或环氧化物。通常,交联通过将交联剂加入到乳化的珠的浆料中来实现,任选地在升高的温度下,并且任选地在碱(例如氢氧化钠或类似物)的存在下实现。进行交联反应的合适的温度取决于交联剂。在交联剂是表氯醇的情况下,交联反应通常在22-90℃范围内,例如在30-60℃范围内,并且尤其是在45-55℃范围内的温度下进行。方便地搅拌混合物以确保交联剂的基本上均匀的分布。交联剂可以一次性加入,但优选在反应时间期间分散地分几部分加入。通常,反应时间在约4小时至约24小时变化,尤其是约8小时至约20小时,例如约12小时至约16小时。当认为反应完成时,用蒸馏水或去离子水洗涤珠以去除任何未反应的试剂并过滤。在初始交联步骤之后,如果需要,可以进行另外的一个或多个交联步骤。交联剂可以以例如每克琼脂糖0.5-50mmol,通常1-25mmol的量使用。在本发明的一个实施方案中,交联剂是表氯醇。本发明的方法任选地包括在步骤(b)之后将配体偶联至固化的琼脂糖珠的另外的步骤。技术人员熟知偶联这样的配体的方法。合适的配体包括带电基团,例如季胺配体、硫酸盐配体、病毒亲和配体、多模式配体。在本发明的典型的实施方案中,配体是季胺配体。特别优选的季胺配体是q-配体,即三烷基铵配体,例如三甲基铵配体。在一个实施方案中,本发明的方法包括用增量剂接枝琼脂糖珠的步骤。增量剂是共价连接到琼脂糖的柔性的非交联的聚合物。增量剂可包含合成或天然来源的聚合物。在接枝的说明性方法中,首先活化琼脂糖凝胶,例如通过通常在碱(例如naoh等)存在下与表氯醇反应而环氧活化。然后,通常在碱(例如naoh等)和还原剂(例如nabh4或类似物)存在下使所获得的活化的琼脂糖凝胶与增量剂反应。增量剂通常可以是可溶性多糖,例如葡聚糖。在一种方法中,上述方法包括用增量剂接枝在步骤b)中获得的珠的另外的步骤。在替代的方法中,该方法包括在第一步中将配体连接于增量剂,并且在随后的步骤中,用增量剂-配体复合物接枝在步骤b)中获得的珠。在又一种方法中,功能性单体(例如带电单体)可以接枝聚合到琼脂糖凝胶上,形成从琼脂糖分子增量的功能性接枝聚合物。在一个方面,本发明涉及多孔的交联的琼脂糖凝胶珠,其可通过上述方法获得。与现有技术方法中使用的琼脂糖含量相比,在制备根据本发明的琼脂糖珠的方法中使用的琼脂糖的低含量提供了具有比通过现有技术的方法获得的珠中的孔大得多的孔的珠。已经显示,根据本发明的方法制备的珠具有足够大的孔,以使大颗粒(例如尺寸为约20-400nm的颗粒)能够进入。除了使大颗粒能够进入孔中之外,根据本发明的方法制备的珠的大孔径,大孔径提供了可用于配体偶联的更大的表面积,这进而增加珠的结合能力。因此,本发明的方法提供了可用于从液体中分离颗粒(例如生物分子)的多孔球形交联的琼脂糖凝胶珠。所述珠特别可用于分离尺寸为约20nm或更大(例如50nm或更大)的颗粒。如上所述,所述方法提供了琼脂糖浓度在0.1-1%w/v之间的范围内,例如在0.3-0.8%w/v范围内,并且更特别地在0.4-0.6%w/v范围内的珠。因此,本发明提供了多孔球形交联的琼脂糖凝胶珠,其琼脂糖浓度在0.1-1%w/v之间的范围内,例如在0.3-0.8%w/v范围内,并且更特别地在0.4-0.6%w/v范围内。通过本发明的方法获得的珠的干重可以在约5-15mg/ml范围内。干重可以变化,并且取决于许多因素,例如交联循环的次数、在珠中存在/不存在增量剂和存在/不存在磁性材料,其中干重随着进行的交联循环的次数以及增量剂和/或磁性材料的存在而增加。例如,交联一次、未接枝增量剂或配体且不包含磁性材料的珠的干重通常在该范围的下限,例如约5-9mg/ml,而交联三次、接枝葡聚糖且不包含磁性材料的珠的干重通常在较高范围,例如约9-15mg/ml。另外包含磁性材料的珠通常具有甚至更高的干重。珠的干重与珠的孔隙率相关,其中低干重对应于较高的孔隙率,反之亦然。通常,预期低干重的珠(例如本发明的珠)导致较低的配体浓度,因为低琼脂糖含量需要较低的可用于配体偶联的表面积。低配体浓度进而预期提供较低的珠的离子容量。计算本发明的珠的配体浓度,并且发现其令人惊讶地高。例如,对于珠029271(交联一次、与q-配体偶联并且不接枝葡聚糖),计算配体浓度为2700μmol/g。这可以与现有技术树脂magsepharose(4%琼脂糖、接枝葡聚糖并与q-配体偶联)的977μmol/g的配体浓度比较。因此发现本发明的q-偶联的琼脂糖珠具有比从现有技术的q-偶联的琼脂糖珠预期的高得多的配体浓度。研究了本发明的珠的结合能力。将珠与q-配体偶联,并如下文实验部分中所详述的测量对病毒的结合能力。发现本发明的珠在结合能力方面优于具有类似粒度的现有技术的珠。因此,在一个方面,本发明提供了多孔球形交联的琼脂糖凝胶珠,其琼脂糖浓度为约0.3-0.8%w/v,或干重为约5-15mg/ml,任选地包含磁性材料。在本发明的一个实施方案中,多孔的交联的琼脂糖珠的粒度为40-200μm。有利地,粒度在约50-150μm范围内,例如80-120μm。在一个实施方案中,本发明提供了多孔的交联的琼脂糖凝胶珠,其中配体连接至所述凝胶珠。合适的配体包括带电基团,例如季胺配体、硫酸盐配体、病毒亲和配体、多模式配体。在本发明的典型的实施方案中,配体是季胺配体。特别优选的配体是q-配体,即三烷基铵配体,例如三甲基铵配体。在一个实施方案中,本发明提供了多孔的交联的琼脂糖凝胶珠,其经由增量剂将配体连接至所述凝胶珠。增量剂有利地是柔性的非交联的聚合物,其在运载体和配体之间提供距离。增量剂可以包含合成或天然来源的聚合物。天然聚合物的实例包括葡聚糖、淀粉和纤维素及其混合物。有利地,增量剂是葡聚糖分子。这样的葡聚糖增量剂的分子量可以在10-200kda范围内,例如分子量在20-140kda范围内,有利地在约50-90kda范围内。或者,增量剂是合成的聚合物,例如聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺或聚乙烯醚聚合物或其任何混合物。合成的增量剂可以具有与以上讨论的葡聚糖增量剂的分子量相似的分子量。由于琼脂糖珠是软材料,大孔可能导致珠的弱化的结构,使它们在传统的柱色谱法中易受压力(尤其是在高流速下)的影响。适用于需要大的多孔珠的应用的替代的分离方法是磁性珠色谱法或磁性珠间歇吸附。简而言之,该方法使用通常配备有配体的磁性珠,感兴趣的生物分子结合到所述配体。然后通过简单地将上清液倒掉而去除上清液,同时用外部磁场将具有捕获的生物分子的磁性珠保持在适当位置。在该方法中,珠上没有压力使其温和且柔和,并因此也适用于敏感的靶分子。磁性珠通常使用与用于非磁性珠的制备程序类似的程序来制备。磁性材料通常在乳化步骤期间并入珠中。至于非磁性珠,磁性珠通常配备有合适的配体,例如亲和配体或离子交换配体。磁性珠的制备程序在本文以下实验部分详细描述。用于磁性珠的合适的磁性颗粒包括例如磁铁矿。因此,在一个实施方案中,多孔琼脂糖凝胶珠进一步包含磁性颗粒,例如磁铁矿。典型地,根据该实施方案,磁性颗粒的量为20-80g/l琼脂糖溶液。在一个方面,本发明涉及分离基质,其包含如上所定义的多孔的交联的琼脂糖凝胶珠。这样的基质可用于将颗粒(例如生物分子)与液体中的其它组分分离。在有利的实施方案中,配体连接于包含在分离基质中的珠。连接的合适的配体如上文所述,并根据待分开的颗粒来选择。在一个方面,本发明涉及将液体中的至少一种颗粒与其它组分分离的方法。分离的目的是为了纯化所需的颗粒或从液体中去除一种或多种颗粒。因此,在一个实施方案中,所述方法包括使包含所述颗粒的液体与分离基质接触。在有利的实施方案中,分离基质是上述基质。从中分离所述至少一种颗粒的液体可以是其中已经产生颗粒的培养液,例如发酵肉汤或细胞培养上清液。或者,液体可以是生物液体,例如源自人或动物的血液、血清等。这样的液体可以包含希望从其中分离感兴趣的颗粒的各种化合物。在一个方面,本发明涉及将液体中的至少一种颗粒与所述液体中的其它组分分离的方法,包括以下步骤:a)使所述液体与如上所述的分离基质接触以允许吸附和/或吸收所述一种或多种颗粒,b)任选地洗涤所述分离基质,c)通过加入释放所述一种或多种颗粒的液体从所述基质中洗脱所述颗粒,d)从所述洗脱液中回收所述一种或多种颗粒。在一个实施方案中,所述分离方法进一步包括通过沉降、过滤、倾析或离心或(在磁性珠的情况下)通过磁场分离来自步骤a)的所述液体和所述基质的步骤。因此,根据本发明,将颗粒(例如病毒)与液体中其它通常不需要的组分分离。液体可以是细胞培养液,其中培养了产生病毒的细胞,并且液体中的不需要的组分例如是宿主细胞蛋白质、营养物残留物、聚集体等。在一个实施方案中,通过上述方法分离的一种或多种颗粒是病毒。在具体实施方案中,所述病毒是腺病毒。根据本发明的分离方法可以用于与用于颗粒分离的其它步骤组合的纯化方案中。例如,分离/纯化方法(例如过滤和/或其它色谱法方法)可以合适地与本发明的分离方法组合。技术人员可以容易地定义在这样的纯化方案中的适当步骤和一种或多种方法以及这样的步骤的顺序。在一个方面,本发明涉及根据如上所述的多孔的交联的琼脂糖凝胶珠在亲和色谱法、离子交换色谱法、疏水相互作用色谱法、反相色谱法、螯合色谱法、共价色谱法中作为基质的用途。实验在三个或四个步骤中制备琼脂糖珠:(a)乳化琼脂糖溶液,任选地加入磁铁矿,(b-i)交联,(b-ii)葡聚糖接枝(任选地),(c)配体偶联。制备具有和不具有磁铁矿的珠两者。(a)琼脂糖溶液的乳化制备两种单独的溶液:(w)将琼脂糖(0.5%w/v)加入到含有蒸馏水的圆底烧瓶中。在高于90℃的温度下以约200rpm搅拌混合物。当所有琼脂糖溶解时,将温度降低至50-60℃。(o)在以150rpm搅拌下将乙基纤维素n50(aqualon)加入到含有甲苯的乳化反应器中。将溶液加热至50-60℃。当溶液(o)中的所有乙基纤维素n50溶解时,将琼脂糖溶液(w)在约2分钟期间倒入乳化反应器中。增加搅拌器的速率,并且每15分钟获得使用粒度分布计(“mastersizer2000”,metrohm)测量样品的粒度。每次取样后,增加搅拌速率直至获得所需的粒度(约100μm)。然后将搅拌速率降低至约225rpm,并将乳液以0.5℃/分钟的速率冷却至20℃。将乳液倒入具有乙醇的烧杯中,同时搅拌,并使凝胶沉降18小时。将液体倾析并加入新的乙醇,将该程序重复四次。然后加入蒸馏水并倾析五次。测量粒度分布,并在显微镜下检查凝胶的损伤。用于乳化的乙基纤维素的温度和浓度在各实验之间是变化的,如在表1中指示的。含磁铁矿的琼脂糖凝胶的乳化程序如对于非磁铁矿凝胶所述,在加入琼脂糖后直接向琼脂糖-水混合物中补充加入磁铁矿(<5μ,aldrich)。磁铁矿浓度为50g/l琼脂糖溶液。(b-i)交联在圆底烧瓶中将浓度为75%的乳化的珠的浆料加热至35℃。将2.55mna2so4加入到溶液中并溶解1小时。将温度升高至90℃(在一个实验中,升高至50℃)保持1小时,然后以1℃/分钟的速率降低至47℃。将0.18mnaoh(50%)与nabh4一起加入,然后在5小时间隔期间加入另外的naoh(50%)和表氯醇(ech)。反应进行14±2小时。在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤所获得的树脂。对于一些样本,进行两个另外的交联步骤。在另外的交联步骤中,条件与第一交联步骤所述的相同,除了温度不超过50℃并且不加入nabh4。用sec、干重测量和光学显微镜目测检查所获得的树脂。(b-ii)葡聚糖接枝(任选地)在圆底烧瓶中以80rpm搅拌葡聚糖(葡聚糖t40、葡聚糖70(amershambiosciences)、葡聚糖110(pharmacosmos))在蒸馏水中的混合物,直到葡聚糖溶解。在单独的烧瓶中,将水加入到来自步骤b的交联的树脂中,预先在蒸馏水中洗涤并排出。以300rpm搅拌混合物并在27℃的水浴中温热。加入naoh粒料,并将混合物静置直至naoh溶解(约15分钟)。加入表氯醇(ech),并将混合物放置2小时用于环氧活化,然后用蒸馏水洗涤,直到获得中性ph。将环氧活化的树脂加入到含有葡聚糖的烧瓶中,随后加入水,并将混合物以120rpm搅拌。将烧瓶放置在40℃的水浴中并放置20分钟。然后将n2气体鼓泡通入溶液,同时搅拌20分钟。将naoh(50%)和nabh4加入到浆料中,并反应18小时。加入蒸馏水,并在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤树脂。(c)配体偶联用naoh(4-8m)洗涤来自步骤(b-i)或(b-ii)的珠,转移到圆底烧瓶中,并:在冰浴上冷却,然后加入表1中所示量的缩水甘油基三甲基氯化铵(gmac)。将反应混合物在冰浴上保持10分钟,然后在室温下放置18±2小时,或者在室温下加入na2so4和gmac,并且在室温下10分钟后,将反应混合物加热至35℃,并在35℃下搅拌18±2小时。用蒸馏水洗涤所获得的树脂。用于制备琼脂糖珠的实验参数总结呈现在表1中。除非另有说明,否则所有树脂交联一次。表11交联5次2交联3次na=未解决琼脂糖珠(非磁铁矿珠)干重的确定适当搅拌琼脂糖珠的浆料,然后使用塑料巴斯德移液管将其转移至1ml特氟龙立方体中。施加真空(-0.8至-0.9巴),并且当树脂表面干燥时,将样品在真空下再放置20秒。在真空下将立方体分开,并将1ml树脂塞转移到玻璃过滤器中,并用丙酮洗涤。将样品在105℃的烘箱中干燥过夜,然后在真空下在干燥器中放置1小时,然后称重样品。结果示于表2中。表2孔径的估计通过nacl和四种不同葡聚糖类型(即具有显著不同尺寸的颗粒)的反sec分析制备的珠的孔径。将琼脂糖含量为0.5%且交联一次的珠的浆料倒入24mlhr10/30柱(gehealthcare)中,该柱具有连接于顶部的另外的柱填充管。将管的两端密封,并使0.2mnacl缓冲液流过柱。将另外的填充管去除并用适配器单元和过滤器替换。在开始色谱法之前,对柱进行不对称性测试以确保其被正确填充并且洗脱峰是对称的。sec通过hplc(äktatmexplorer,gehealthcare)进行,并且每个样品的保留体积用折射率仪测量。分析显示颗粒之间的洗脱体积没有显著差异,这指示珠具有足够大的孔以允许大颗粒进入,并因此适用于病毒和大分子应用。结果总结于表3中。表3颗粒洗脱体积[ml]nacl24.6196,000葡聚糖24.171,000,000葡聚糖22.353,000,000葡聚糖21.12天然葡聚糖18.02-20.55将根据本发明制备的三种不同的珠用作腺病毒的sec的基质,以研究交联和珠中磁性材料的存在的影响。测试的珠不接枝葡聚糖并且没有配体连接。sec在得自agilenttechnologies的hplc系统(1290infinity)上进行,使用0.2mnacl溶液和80%20mmtris缓冲液作为流动相。结果总结于表4中。表4在珠之间洗脱体积没有发现显著差异,指示交联和磁性材料的存在对珠的孔径没有显著影响。为了研究树脂和腺病毒之间的相互作用是否仅是离子相互作用,使用两种不同盐浓度的缓冲液进行腺病毒的尺寸排阻色谱法,一种具有0.2mnacl,而一种具有0.4mnacl。使用交联一次、不接枝葡聚糖且不偶联配体的含磁铁矿的树脂。流速为0.09ml/分钟,并且柱体积为22.7ml。结果总结于表5中。表5盐浓度[m]洗脱体积[ml]0.223.80.423.5如果在腺病毒和树脂之间仅存在离子相互作用,则当改变缓冲液的离子强度时,洗脱体积将改变。事实上,发现情况并非如此,当使缓冲液的离子强度加倍时,洗脱体积保持大部分相同。因此可以得出结论,树脂和腺病毒之间的相互作用不仅是离子相互作用。q-配体密度的评估通过测量由根据本发明的q-偶联的琼脂糖珠组成的树脂的离子容量,评估偶联到所制备的珠的q-配体的量。用8个树脂体积的0.5mhcl,随后用16个树脂体积的1mmhcl洗涤树脂。将排出的树脂(1ml)转移到配备有氯离子选择性电极的塑料杯。加入聚乙烯醇在milli-q水(6ml,0.2%w/w)中的溶液,使得电极被液体覆盖。搅拌混合物,并将预定量的0.1magno3(10ml,过量)滴定到溶液中,同时测量氯化物电势。随着银离子的加入,形成agcl沉淀。当加入全部体积的agno3时,停止滴定并确定氯化物电势。氯化物电势与偶联到珠的q-配体的浓度相关。使用来自metrohm的905titrando和800dosino用于测量。评估结果总结于表1中。从表1中可以得出结论,对于琼脂糖交联一次并且树脂:gmac比为1:6(v/v)的珠,获得最高的离子容量。另外,发现硫酸钠的浓度对所得树脂的离子容量具有主要影响。结合能力在间歇吸附测试中评价制备的树脂的腺病毒的结合能力。测试六种不同的珠。1)通过用含有300mmnacl的20mmtrisph8.0缓冲液稀释纯化的腺病毒样品至6.4×1010vp/ml的浓度来制备病毒进料。将获得的病毒进料保持在-70℃下。2)将25%珠/树脂的浆料以不同的体积移液到eppendorf管中。然后,将非磁性珠以7800×g的相对离心力离心1分钟,并使用mag-rack捕获磁性珠。通过移液去除过量的液体。3)将病毒进料(1ml)加入到每个eppendorf管中,并将混合物在摇床上混合的同时孵育1小时。然后将混合物离心,并通过hplc(tricorn550柱,其配备有粗过滤器试剂盒并填充有qsepharosexltm树脂)分析上清液(200μl)。通过uv检测确定平衡浓度c*(即上清液中剩余的病毒数)。病毒颗粒的浓度在本文中表示为每体积的病毒颗粒(vp/ml)。通过定量聚合酶链反应(qpcr)确定原病毒进料中的浓度(c0)。使用下面的等式(1)和(2)计算每种类型的珠的结合能力qmaxc0xvbatch-c*xvbatch=q*xmp(1)q*=(qmaxxc*)/(kd+c*)(2)其中c0是生物分子的初始浓度,c*是生物分子的平衡浓度,vbatch是生物悬浮液的体积,q*是珠的平衡负载,mp是颗粒质量,和kd是树脂的解离常数。进行根据本发明的两种树脂和现有技术的树脂的腺病毒的动态结合能力的比较研究。将树脂填充在柱中,并在超过突破点(breakthroughpoint)时负载腺病毒样品。所用的色谱法条件如下:样品:腺病毒浓缩并渗滤至加入300mmnacl的20mmtrisph8,缓冲液:20mmtrisph8+300mmnacl停留时间:10分钟流速:0.2ml/分钟收集0.5ml级分,并通过hplc使用nacl梯度在qsepharosexl上分析,以确定何时发生突破。结合能力计算为在突破点(vp)负载的病毒颗粒的总量除以柱床体积(ml)。结果总结于表6中。表6样本结合能力(vp/ml)ls-0268685.67e+11ls-0268375.04e+11captoq(现有技术)3.78e+11当前第1页12
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