专利名称：制取高纯环孢菌素a及相关环孢菌素的色谱分离方法
技术领域：
本发明涉及一个新的提纯环孢菌素A(Cy A)及相关环孢菌素的色谱分离方法，该方法适用于医药工业中。
据该方法，可以以经济有利的条件制备医药上可接受纯度的活性物质，即所制得的环孢菌素A的纯度例如完全符合PHARMEUROPA(PHARMEUROPA，第4卷，第四期，第270页，1992年12月)的纯度要求。
A Rüegger及其同事[Helv.Chim.Acta 59,112,(1976)]成功地从多孢木霉属(LINK exPERS)分离出环孢菌属A，这是人们第一次制得地一个新的，具有极强免疫抑制性的物质。经过25年以上的认真研究后，人们熟悉了具有免疫抑制性及抗真菌活性的相关环孢菌素[R Traber等人，Helv.Chim.Acta 70,13(1987)]。
目前，人们毫不怀疑地认定，环孢菌素A是在进行有机器官移值手术后，用于抑制免疫防御性的，具有突出功能的药剂，因此，往日人们不遗余力地努力改进的制备方法，使得制取的救命药剂能满足日愈提高的，在量与质方面的要求。
迄今沿用的，用于提纯含有环孢菌素A的粗提取液的技术解决方法大多数包括了多级的色谱分离方法，其中使用了作为洗提剂的有机溶剂。
因此，上述的A.Rüegger所作的工作，首先是在不断增加甲醇的条件下在硅胶60 Merck(0.063-0.2毫米)上，用氯仿进行色谱分离，接着将得到的产物放在Sephadex LH 20上，在甲醇中进行凝胶色谱分离，然后，将其放在氧化铝上(Brockmann,Aktl)，在甲苯中，在不断提高加入量的醋酸乙酯的条件下，进行色谱分离。
后来的研究工作中，也使用了类似的方法(见表1)。
经常使用的吸附剂是sephadex LH 20，硅胶60Merck(0.063-0.2毫米)，以及中性氧化铝。
所用的展开剂相可以是大多数的有机溶剂混合物。
由于氯仿与二氯甲烷其有高毒性，它不仅作为溶剂能残留在制得的活性物质中，而且在大量地加工处理这些物质(蒸馏物，废物排除)时会产生安全工艺问题，因此，在实际中是不大适用的。
此外，在使用梯度或复杂的例如三元的等临界混合物时，在洗提物蒸发之后重新加入展开剂是复杂的，昂贵的。
在加拿大专利文献，CA 2 096 892中，BIOGAL描述了类似的方法，其中，在进行色谱分离以前，对粗提取液进行温度处理，即在约一个小时的时间内，将粗提取液加热到110℃，接着在5个小时内，冷却至室温，然后，在一级的硅胶60色谱仪中，在加入高含量的氯化烃的情况下，经过两次依次加入展开剂后，可分离制得约15％给料量的环孢菌素A，其纯度约为97.6％，但是，这种方法在工业规模上不能满足所制取的活性物质在产率与纯度上的要求。此外，这种复杂的天然物质，由于其对热的不稳性，以及可能的同分异构化作用。因此不适宜受温度作用的影响。
迄今所知的用一级色谱分离提纯的专利申请只有FUJISAWA(WO 9 213094)和BIOGAL(CA2 096 892)，其中，当然需要昂贵的展开剂组合或梯度，为此，产生了对展开剂进行再生处理的问题。
对这些方法进行精确的判断，仍缺乏大多数的有关产率与产品纯度的数据资料。
以下是一些现有技术中，对环孢菌素A进行提纯的已知色谱分离方法
R.M.Nicoud，在LC-GCINIL,5卷，5期，43-47页和K K.Unger(Hrsg.)在HPLC手册，第2部，GIT出版社，Darmstadt,1994(也请参见本文插
图1)简述了有关SMB技术。
据上述SMB技术，可以得到具有创造性的解决方法，即据色谱分离方法所提纯的环孢菌素A，能满足下列的在产率与产品纯度方面的要求
·这种新方法应能制取高于70％的环孢菌素A加入量的，符合PHARMEUROPA质量要求的环孢菌素A产品(相对于色谱分离提纯步骤)。
·这种方法应该满足年生产量的最高要求，同时显著降低在固定相中所需用的溶剂与物料的需要量。
·这种技术解决方法应该是简宜，迅速与大功效的。即所用的溶剂和吸附剂必须在尽可能长的时期内可再使用。为此，也取消了很难调节的或再生的，等临界应用的溶剂混合物与梯度。
·不需使用氯化烃。
·这种方法可以自动化控制，即可连续操作运转。同时能满足适合于GMP产品的要求。
用作色谱分离提纯方法的原料是，据已知方法(例如DD295872A5)从含有环孢菌素A的干菌丝进行萃取(醋酸乙酯)和脱脂(石油醚/甲醇/水)后所得到的粗提取液。它除了一系列的至多是未知的黄色与红色的物质以及含有油状的生成物外，例如还有如下列的环孢菌素的组合物
①据PHARMEUROPA，第4卷，第4期，第270等页的HPLC分析规范
在第一个色谱分离步骤中，可以分离出极性的环孢菌素(C,B,L,U)与非极性的环孢菌素(G,D)。由此形成了两个有价值的馏份。该馏份中除了环孢菌素A外，只含有极性的杂质或非极性的杂质。由此就可以在第二个色谱分离步骤中，有利地从各自的杂质中分离出孢环菌素A。
据本发明，可采用常规的HPLC方法，并与模拟移动床技术(SMB)组合使用，以便可用色谱分离方法制取高纯度的环孢菌素A，即如下所示1、色谱的HPLC或SMB工艺2、色谱的SMB工艺 请见表1-4
本发明涉及一个从含有环孢菌素的粗提取液中提纯环孢菌素A及相关的环孢菌素的方法。其中，使用硅胶作为吸附剂的色谱分离方法。其特征是，在采用以硅胶作为吸附剂的色谱分离方法下，从含有环孢菌素的粗提取液中分离提纯环孢菌素A及相关的环孢菌素。
a．)在第一个色谱分离步骤中，借助于制备性FIPLC或SMB技术，把粗提取液，按照分离的浓度剖面图(profil)中的分离步骤，分离成一个含有非极性伴生物的有价值馏份1，以及一个含有多个极性的伴生物的有价值馏份2，
b．)接着，把上述的有价值馏份1(精制品)和有价值馏份2(提取液)进行第二次色谱分离步骤，其中采用SMB工艺。不仅第一次色谱分离步骤，而且第二次色谱分离步骤，都可以在正相/醋酸乙酯系统或反相，乙腈/水系统中进行。特别地采用SMB技术会带来下列优点
·可以完全实现绝对连续操作运转，即通过新的色谱分离模式，可以取消断续的物料注入方式。这种连续操作运转的色谱分离方式可优先应用于工业领域。
·SMB技术可以在浓缩溶液的条件下实施。这样就可以降低溶剂的消耗，并同时也司减少回收溶剂所需的时间。
SMB工艺与HPLC工艺的比较
实现SMB分离工艺的最主要的技术上的先决条件是，精确调节不同的分部流量(见实施例)。以便能确保依赖于反应时间(Schaltzeiten)的洗提液流头的准稳定状态。
此外，为了达到最佳SMB分离，在所用的色谱系统中，必须充分了解有价值产物及杂质的吸附等温线，这就需要事先进行分析测定。
此外，还可以引入所谓的第五作用区域，遗弃常规的四个作用区域的SMB的迄今通用的双组分分离过程。通过在第五区域内安置的冲洗系统，也可以同时消除杂质。其中，有关的环孢菌素A显示了K’-极限值。为此，使有价值产物可以得到质量上的进一步改进。
通常，采用标准的SMB工艺，可以使大多数其K’值为0.6-2.0的混合物得到很好的分离(K’=1，表示有价值产物)，然而，有些组分可能是在上述范围之外，所以通常未能在提取液中充分冲洗，致使相对于进料而言，会富集在精制品中(见附图1)。
据本发明的新方法，在第四与第一作用区域之间的转换过程中，这些吸附柱可以被具有强烈洗提能力的溶剂(例如，甲醇)所冲洗，以达到指定的状况，装置上的相关吸附栏，都安置于第五区域内，并且在一个循环期间，完全与其余四个区域的密闭环形结构断开，(见附图1)。
上述的第五区域划分为两个分步骤
1、在第一个分步骤期间，用个有强烈洗提能力的合适的溶剂冲洗第五区域的吸附柱，为此，会减少仍粘附的杂质的固相层。
宜用甲醇作为上述冲洗剂，在冲洗RP材料的情况下，也可以使用纯乙腈，因此，通过取消附加的溶剂，可以简化回收溶剂问题。
2、在第二分步骤中，用冲洗剂把各个分离过程中所需要的洗提剂全部冲洗掉。
如果在各区域中的吸附柱的安置情况是，把大多数的吸附柱安置于第五区域中。那么可以便强化冲洗过程。因为在冲洗过程中，这些吸附柱是并联布置的。
在对第一个色谱分离步骤的所谓的有价值馏份2进行高度提纯的问题上，我们可以得到另外的最佳方法，这个馏份除了环孢菌素A外，主要含有极性的杂质，如环孢菌素U与L。这里，当置换在SMB装置上的提取液和精制品的取样点时，就会出人意料地发现，上述有价值馏份可以很好地分离。其中，极性杂质被含有环孢菌素A的有价值产物所洗提，即显示更短的逗留时间。这意味着，在第二色谱分离步骤中使用这个特殊的SMB操作过程时，在这个步骤中可以唯独有RP-18系统操作运转，这样就可以很好地简化溶剂回收问题(表1)。
下列三个实施例皆基于对第二个色谱分离步骤适用的SMB工艺。其中，所采用的原料物质，在其杂质剖面上，是例如经第一个色谱分离步骤，用常规制备的HPLG制得的有价值馏份。
实施1描述了借助于SMB工艺，在正相系统Si60/醋酸乙酯中制备第一色谱步骤的高纯度中间产物的方法。该产物除了环孢菌素A外，还有占主要份量的极性杂质。
其结果是明显地降低极性的环孢菌素(特别是U,L与B,C)，为此，表现出与SMB工艺相结合的分离系统的主要特性。
实施2描述了一个高纯度中间产物的纯化方法，该中间产物作为有价值馏份1含有占优势的非极性杂质，该方法是借助于SMB技术，在系统反相RP-18/乙腈，水(60∶40，容积比)中进行的。
经过使用SMB分离工艺，发现非极性的环孢菌素(特别是G与D)明显降低。
实施例3描述了借助于SMB工艺，在正相层/醋酸乙酯系统中制备的高纯度的中间产物的方法，该中间产物中含有有价值馏份1和占优势的非极性杂质。
与实施1比较，通过置换提取液/精制品的取样点，可以大大降低非极性杂质含量，而且可节约溶剂。
上述细微分离过程显示了令人惊奇的结果，甚至迄今用分析的HPLC方法也不可能实现的，即把色谱上特别相似的伴随物质与环孢菌素A相分离。
上述制得的环孢菌素A，经再结晶后，不仅符合USP ⅩⅩⅢ的质量要求，且也符合EUROPEANPHARMACOPOEIA,2版，1995年的规范。
附图1具有五个作用区域的SMB工艺的方框图，
对附图1的说明
在区域1和区域4之间的循环中加入展开剂，并在区域2和3之间进行检验过程。在区域4和区域1之间加入新鲜的洗提剂。在区域3和区域4之间取出精制品(环孢菌素A)，而在区域1和2之间取出提取液(环孢菌素A+杂质)。每个吸附柱配备有四个装在加料(加入物质)，洗提剂，提取液(有价值产物+杂质)和精制品(有价值产物)系统的阀门。通过相对于洗提方向采集点和加料点的置换来摸拟载体物质的“移动”。因此，可以在吸附柱系统中的相层之间形成连续的物料分布，而且使接受点上的洗提物浓度保持不变。
此外，在试验中惊人地发现，通过SMB工艺可以比传统的色谱方法更完全地分离副环孢菌素U和L，以及G和D。而且，在该步骤中同时可达到更高的产率。其结果是相对于一定的生产率，可以使用更小的设备。而且对吸附柱充填物料，以及洗提剂的需要量更少。
当然，原则上可以在第一色谱分离步骤中采用SMB工艺(表3)。为此，原则上在处理合适的粗提取液(装入少量大体积物质，主要是亲脂性)时，也可以在第一处理步骤中，在反相层/乙腈，水系统中采用SMB分离工艺(表4)。此外，因为我们还发现，当置换精制品/提取液的位置后，也可以在反相层/乙腈，水系统中使极性杂质从环孢菌素A中分离出。所以也可以只在反相层/乙腈，水系统中通过两次实施SMB工艺来进行环孢菌孢A的纯化，或者也可以在置换精制品/提取液的位置后，在正相/乙酸乙酯系统中，使非极性杂质从环孢菌素A中分离。此外，可以在采用正相层/醋酸乙酯系统中的条件下，通过两次实施SMB工艺来进行环孢菌素A的纯化。
表1
环孢菌素A-粗提取液
↓
↓↓
表2
环孢菌素A-粗提取液
↓
↓↓
表3
环孢菌素A-粗提取液
↓
↓
表4
环孢菌素A-粗提液
↓
↓
实施例1在第二色谱分离中，根据SMB技术，在正相/醋酸乙酯系统中，使绝大多数的极性环孢菌素(环孢菌素C,B,L,U)与环孢菌素A相分离。
实施例2借助于SMB技术，在RP-18/乙腈，水系统中，使绝大多数的非极性的环孢菌素(环孢菌素G,D)与环孢菌素A相分离
实施例3通过置换提取液和精制品的采集部位，可以在第二色谱处理中，借助于SMB技术，在正相/醋酸乙酯系统中，使绝大多数的非极性环孢菌素(环孢菌素C,G,D)与环孢菌素A相分离。
权利要求
1、从含有环孢菌素的粗提取液中提纯环孢菌素A与相关环孢菌素的方法，其中使用了以硅胶作为吸附剂的色谱分离方法，其特点是，
a)在第一色谱分离步骤中，借助于制备性HPLC或“模拟流动床”技术，通过在分离的浓度剖面图中的分馏步骤把粗提取液分离成一个含有非极性伴生物的有价值馏分1和一个含有多个极性伴生物的有价值馏分2，
b)在后续的第二色谱分离步骤中，借SMB技术，又再次提纯上述有价值馏份1(精制品)和有价值馏份2(提取液)。
2、据权利要求1的方法，其特征在于
a)上述第一色谱分离步骤，和第二色谱分离步骤均可以在正相/醋酸乙酯或反相，乙腈/水系统中实施，
b)借助于SMB技术，在反相，乙腈/水系统中处理上述有价值馏份1(精制品)；第二色谱分离步骤的有价值馏份2(提取液)是在正相/醋酸乙酯系统中处理，
c)上述有价值馏份2(提取液)，借助于SMB技术，在反相，乙腈/水系统中处理；笫二色谱分离步骤的有价值馏份1(精制品)在正相/醋酸乙酯系统中处理。
3、据权利要求1的方法，其特征在于是，引入第五区域进行冲洗步骤，其中，首先用甲醇，接着用展开剂冲洗，并且在第五区域中，在多个吸附柱的情况下并联地(Paeallelscbaltung)流过这些吸附柱。
4、据权利要求2的方法，其特征是在第二色谱分离步骤中，在乙腈/水的比例是从40～-80∶20～60之间，优选60∶40(容积比)的反相，乙腈/水系统中进行分离。
5、据权利要求1与2的方法，其特征在于，上述SMB装置中展开剂的温度与吸附柱的温度保持在40-80℃，并以60℃为宜。
6、据权利要求2的方法，其特征在于，在上述反相/乙腈，水系统中，展开剂的PH值调节为2-5，并以PH=3为宜。
全文摘要
本发明涉及一个新的色谱分离方法,它可用于以工业规模提纯含有环孢菌素类的粗提取液。在该方法中,用模拟移动床(SMB)方法完全或至少部分地代替常规的色谱制备分离方法,据该法所提纯制得的环孢菌素A符合USP XXⅢ的质量要求及欧洲药典,1995,第二版的要求。
文档编号B01D15/02GK1212703SQ9719270
公开日1999年3月31日 申请日期1997年3月14日 优先权日1996年3月21日
发明者U·沃伊特, R·亨佩尔, J·金克尔, R－M·尼科乌德 申请人:德雷斯顿药品工厂有限公司