生物靶标与固相酰脲的选择性结合的制作方法
【专利说明】生物靶标与固相酰脲的选择性结合
[0001] 相关申请的声明
[0002] 本申请要求2012年5月31日提交的美国临时申请号61/653, 729和也在2012年 5月31日提交的美国临时申请号61/653, 740的优先权，其内容通过引用整体并入本文。
[0003] 领域
[0004] 本文中公开的实施方案涉及使用带有酰脲的固体表面选择性地结合独立地存在 或存在于组装物中的生物靶标的方法。这样的生物靶标的尺寸可以广泛地变化，且在特定 实施方案中，它们的尺寸可以包括约20微米或更多至数百万道尔顿。这样的生物靶标具体 地包括细胞、细胞的亚结构、病毒和/或聚集体，其中所述方法的目的是从局部环境取出它 们，可能纯化它们用于随后的应用。本文中公开的方法还可以与其它分级分离步骤组合，以 实现大生物靶标的更高纯化程度，或进一步纯化已经从其中除去大生物靶标的样品的不同 期望组分。
[0005] 置量
[0006] 基于涉及的功能机制，可以将沉淀方法分类成2类：沉淀和共沉淀。经典的沉淀方 法经常采用大量添加剂，所述添加剂以使得要沉淀的物质不溶的方式改变溶剂的特性。所 述添加剂本身可以保持可溶性，且当将上清液与沉淀物分离时会除去大部分添加剂。然后 将沉淀物再悬浮于流体中，所述流体缺乏用于介导沉淀的试剂。痕量的试剂可以容易地除 去，因为它们不会与要沉淀的产物形成永久结合。例子包括使用以下试剂的沉淀：盐诸如硫 酸铵、柠檬酸钠和磷酸钾等；有机聚合物诸如聚乙二醇、聚丙二醇、葡聚糖和聚乙烯吡咯烷 酮等；和有机溶剂诸如丙酮、氯仿和醇等。
[0007] 共沉淀方法通常如下工作：结合要沉淀的物质，并将它的溶解度降低至其自发地 形成沉淀的点。可以使用该技术选择性地沉淀具有研宄或商业利益的蛋白或病毒。同样，可 以使用该技术从含有目标蛋白或DNA质粒的制品中选择性地沉淀一种或多种污染物物质。 从蛋白和DNA质粒制品除去的重要污染物具体地包括病毒和内毒素。与经典沉淀相比，共 沉淀通常有利之处是，它经常使用较低量的沉淀剂，但是不利之处是，沉淀的产物的回收不 仅采用其在没有沉淀剂存在下的再悬浮，而且可能造成对额外处理步骤的需求，所述额外 处理步骤转移保持以痕量与目标产物结合的残余沉淀剂。这经常通过引入破坏产物和共沉 淀剂之间的相互作用的试剂来完成。共沉淀剂的例子包括阴离子聚合物、阳离子聚合物和 脂肪酸等。用于转移残余沉淀剂的物质包括高浓度的中性盐诸如氯化钠、离液剂和有机溶 剂等。
[0008] 经典沉淀方法和共沉淀方法都已经用在病毒的纯化中。许多类型的化学表面具有 结合病毒的能力。一些包括经过化学修饰以通过正电荷或负电荷或疏水性（诸如离子交换 剂和疏水相互作用色谱介质）介导与病毒的相互作用的表面。这些材料具有合乎需要的结 合不同病毒种类和相当低的成本的特性，但是也具有不希望的结合大量蛋白和需要广泛过 程开发的特性。可替换地，与其它蛋白相比，抗体作为生物亲和配体在表面上的固定化可以 对病毒是特异性的，且仅需要有限的过程开发，但是具有固定化的抗体的表面通常仅结合 单一病毒种类，且它们相对是非常昂贵的。
[0009] 酰脲已经表现出作为在人皮肤养护产品中广泛使用的非炎性试剂或抗炎剂的活 性。一个常见的例子是尿囊素，其难溶于水溶液，且在约36mM的浓度时饱和。超过该浓度的 量作为晶体存在。已经将一些酰脲共价地固定化在二氧化硅颗粒上。已经证实了 1-[3-(三 甲氧基甲娃烧基）丙基]脲在二氧化娃上的固定化（Bicker等人· J. Chromatogr. A, 1218 882-895 2011)，并且该构建体用于多种小分子化合物的亲水相互作用色谱。已经在二氧化 硅上固定化了掺入脲片段的双齿烷氧基硅烷（Kotoni等人J. Chromatogr. A，1232 196-211 2012)，其也用于亲水相互作用色谱，并且被发现可用于糖的分析。已经描述了与多价阳离 子组合的尿囊素用于从含有抗体的细胞培养物上清液澄清聚集体的用途（J. Chromatogr. A,129133-40 2013)〇
【发明内容】
[0010] 本文中公开的实施方案提供了从样品选择性地分离生物靶标的方法，所述方法 包括以下步骤：（i)提供在其表面处具有一个或多个酰脲部分的固体；（ii)使所述样品 与所述固体接触，由此使所述样品中的大部分生物靶标结合所述固体的表面上的酰脲；和 (iii)将所述固体与所述样品分离。在某些实施方案中，所述生物靶标被认为是"大的"。本 文中结合生物靶标使用的术语"大的"应当理解为包括单个生物靶标或具有约20微米至数 百万道尔顿的聚集体大小的生物靶标组装物。示例性的生物靶标包括细胞和细胞亚结构诸 如细胞器、包涵体、内毒素、聚集体和病毒。在其表面处具有一个或多个酰脲的固体具体地 包括酰脲晶体或固定化在表面上的酰脲。在某些实施方案中，所述酰脲具体地包括尿囊素。 [0011] 在某些实施方案中，所述样品是局部环境，且所述方法提供了从该环境选择性地 除去生物靶标的方式。在某些这样的实施方案中，所述样品是与固体材料接触的空气，所述 固体材料在其表面上具有一个或多个酰脲。在一个特定实施方案中，空气传播的生物靶标 是病毒或其它病原性因子，且所述酰脲是尿囊素。
[0012] 在某些实施方案中，所述样品是与固体材料接触的液体，所述固体材料在其表面 上具有一个或多个酰脲。在一个这样的实施方案中，所述样品是水，所述生物靶标包括病原 性微生物或其衍生的亚结构诸如内毒素，且所述酰脲是处于过饱和浓度的尿囊素。在另一 个这样的实施方案中，所述样品是含有期望蛋白（诸如含有重组蛋白）的蛋白制品，且所述 酰脲是处于过饱和浓度的尿囊素。在某些这样的实施方案中，所述蛋白制品可以含有细胞、 细胞碎片、微生物和其亚结构，包括要从液体除去的内毒素。在某些这样的实施方案中，可 以将有机多价离子与酰脲组合，以增强不希望的物质的除去。在某些这样的实施方案中，可 以将用酰脲和/或有机多价离子处理过的样品与包含有机多价离子的其它固体组合，以进 一步增强不希望的物质的除去。
[0013] 在某些实施方案中，可以如下从在其表面处具有一个或多个酰脲的固体回收所述 生物靶标：通过溶解所述固体，或通过破坏所述靶标与所述酰脲的相互作用。在一个这样的 实施方案中，所述酰脲是尿囊素。在一个这样的实施方案中，所述方法提供了从所述固体回 收病毒的额外步骤，其中所述样品含有期望的要纯化的病毒。在另一个这样的实施方案中， 所述方法提供了从所述固体回收胞器的额外步骤，其中所述样品含有期望的要纯化的细胞 器。
[0014] 附图的简要说明
[0015] 图1显示的时程图指示了根据本文中公开的方法，高分子量聚集体的减少和宿主 细胞蛋白污染物的减少。
[0016] 图2A和2B显示了根据本文中公开的方法用IgM-84抗体处理之前和之后的尺寸 排阻色谱曲线。
[0017] 图3显示了根据本文中公开的方法用抗-HER2单克隆IgG抗体处理之前和之后的 尺寸排阻色谱曲线。
[0018] 详细描沐
[0019] 已经令人惊讶地发现，在其表面处具有一个或多个酰脲的固体会介导足够强的对 生物靶标（包括大生物靶标）的亲和力，简单地通过取出所述生物靶标所结合的固体，可以 从样品选择性地提取所述生物靶标。随后可以抛弃或回收所述提取的生物靶标。大生物靶 标应当理解为包括单个靶标或具有20微米至数百万道尔顿（D)的聚集体大小的靶标组装 物，且具体地包括细胞和细胞的亚结构（诸如细胞器）、微生物和微生物的亚结构（诸如内 毒素）和聚集体。较小的生物靶标（具体地包括蛋白）可表现出对固体表面上的酰脲更低 的亲和力，这会促进它们与结合至酰脲的较大靶标的分离。
[0020] 在某些实施方案中，所述生物靶标具有在选自以下的范围内的大小：（1)约IOnm 至约200nm，（2)约200nm至约1微米，（3)约1微米至约20微米，和⑷约20微米或更大。 本领域技术人员会明白，所述生物靶标的确切大小将是靶标本身的性质的函数。在要纯化 较小生物靶标的情况下，本文中公开的方法可以与其它纯化技术组合以提供期望的纯化程 度。
[0021] 不受任何特定理论约束，实验数据指示，通过范德华相互作用（具体地包括氢键） 可以介导尿囊素的亲和力。这样的键与大多数共价键相比在更大程度上受PH、电导率和有 机修饰剂的存在影响，但是与非共价相互作用（诸如静电或疏水相互作用）相比在更低程 度上受它们影响。这可以解释以下现象：在许多情况下，酰脲对特定生物靶标的亲和力几乎 不受pH和盐浓度或有机修饰剂的存在的变化影响，所述变化会急剧地影响静电或疏水相 互作用。但是，酰脲对给定的生物靶标的表观亲和力可以受靶标的固有溶解度（为PH或盐 浓度的函数）的变化或有机修饰剂的存在的影响。
[0022] 鉴于所述结合发生在固体的酰脲表面处，显然，酰脲表面的总表面积越高，它的能 力越大。因此，较小的颗粒通常会提供比类似质量的较大颗粒更高的能力，较小的晶体通常 会提供比类似质量的较大晶体更高的能力，且通常有利的是使用具有最小适用尺寸的颗粒 或晶体。
[0023] 在某些实施方案中，本发明提供了使用过饱和的或固定化的酰脲结合病毒和/或 内毒素、同时基本上不结合蛋白的方法。术语过饱和的表示这样的情形：其中微粒、粉末状 或结晶材料以特定浓度存在，在该浓度，当溶解最大量的材料时，固体物质仍然存在。
[0024] 在某些实施方案中，本发明提供了通过除去蛋白来纯化病毒的方法。在其它实施 方案中，本发明提供了在除去病毒和内毒素的同时纯化蛋白的方法。在其它实施方案中，本 发明提供了与从样品或局部环境除去和任选地灭活病毒联合地结合病毒的方法，诸如在从 气体或液体过滤病毒的背景下，或用于清洁或保护性应用。
[0025] 在某些实施方案中，本发明提供了通过除去蛋白和其它小分子污染物来纯化细胞 器的方法。细胞器的子集与固体表面上的过饱和量的酰脲（诸如尿囊素）共沉淀，诸如以 细胞器所在的制品的体积的1-20%范围内的量。当用含有尿囊素的饱和溶液的缓冲液洗涤 固体材料时，消除基本上未与尿囊素结合的蛋白和小分子污染物。随后通过加入缺乏尿囊 素的缓冲液来溶解尿囊素，回收细胞器。可以通过超滤来浓缩纯化的细胞器。本领域技术 人员显而易见，生物活性的细胞器的回收可以依赖于含有可溶解性组分的缓冲液以便保留 生物活性或至少避免包含可能降低生物活性的条件和化合物。
[0026] 在某些实施方案中，本发明提供了通过除去污染性蛋白和其它小分子来纯化包涵 体的方法。
[0027] 在某些实施方案中，本发明提供了通过使用酰脲共沉淀剂纯化病毒的方法，其中 用不溶性酰脲共沉淀病毒，分离具有结合的期望病毒的固体材料，然后通过引入从所述酰 脲解离所述病毒的竞争剂来从所述固体回收所述病毒。该方案可以受益于低溶解度酰脲 (包括尿囊素和尿酸）的应用。在某些实施方案中，有利的是使用低溶解度酰脲，因为它会 限制再悬浮的病毒中的残留酰脲的量。
[0028] 在某些实施方案中，本发明提供了通过使用酰脲共沉淀剂纯化病毒的方法，其中 用不溶性酰脲共沉淀病毒，分离具有结合的期望病毒的固体材料，然后通过溶解酰脲（例 如通过加入水或适当的不含酰脲的缓冲液）来从所述固体回收所述病毒。病毒共沉淀和回 收的效力可以被环境的PH和盐浓度影响，以及所采用的酰脲的相对量影响。在与使用多价 离子的共沉淀的直接对比中，增加盐浓度可以增加酰脲共沉淀的效力。在与使用多价离子 (特别是更常用的多价阳离子）的共沉淀的进一步对比中，酰脲沉淀可以在酸性PH是更有 效的，即使共沉淀表现出对阴离子交换剂的强结合的病毒种类。
[0029] 在某些涉及病毒