一种以四肽为功能配基的亲和层析介质及其制备方法

文档序号:8328822阅读:509来源:国知局
一种以四肽为功能配基的亲和层析介质及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种以四肽为功能配基的亲和层析介质及其制备方法,属于生物化工 领域中的蛋白层析分离技术。
【背景技术】
[0002] 抗体是指机体的免疫系统在外界抗原的刺激下,由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分 化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。抗体具有多种生物 活性,包括特异性结合抗原、激活补体和结合细胞Fc受体等,主要用途包括疾病治疗、体外 诊断和检测、肿瘤定位显像等。
[0003] 常见的抗体分离方法有盐析、离子交换层析、疏水相互作用层析和亲和层析等。抗 体产品的质量要求通常较高,纯度大于90%,同时要求保持生物活性。盐析往往需要料液中 抗体浓度较高,而且沉淀得到的抗体纯度和收率都较低。常规的离子交换层析和疏水相互 作用层析能够分离抗体,但是特异性和选择性较低,需要多步分离。基于蛋白A或蛋白G的 亲和层析,是目前抗体分离的通用技术,选择性高,但介质价格昂贵,蛋白配基易被料液中 蛋白酶降解而脱落,增加后续分离的负担,且重复使用次数有限,操作成本较高。因此,开发 具有抗体选择性的新型层析介质成为研宄热点。
[0004] 从上世纪 80 年代 Porath 等(Porath et al.,FEBS letters, 1985, 185:306) 提出亲硫层析,到 1998 年 Burton 和 Harding (Burton and Harding, J. Chromatogr. A, 1998, 814:71)报道的疏水性电荷诱导层析,再到混合模式层析(Pezziniet al.,J. Chromatogr. A, 2011, 1218:216 ;Toueille et al. , J. Chromatogr. B, 2011, 879:836),以 及基于小分子配基的仿生亲和层析(Li et al·, Nat Biotech, 1998, 16:190 ;Roque et al. , J. Chromatogr. A, 2005, 1064:157 ;Qian et al. , J. Chromatogr. B, 2012, 898:15), 抗体分离技术不断得到改进。专利(CN101279243 ;CN101279244 ;CN101284224)报 道了疏水电荷诱导层析介质用于抗体选择性分离。专利(US Patent 8, 802, 448 ; US Patent 7,691,980)报道了混合模式层析介质分离抗体。然而,上述层析介质的功 能基团都是结构相对简单的小分子配基,因此抗体的亲和力和选择性有限,从复杂料 液中分离抗体难以得到理想的效果。相对于小分子配基,多肽配基则具有足够的亲和 力和选择性,且比蛋白配基具有更好的稳定性。已报道的多肽配基有六肽HWRGWV(US Patent 7, 408, 030)、八肽 FYWHCLDE (CN103014880)、环状五肽 cyclo [Link-M-WFRHY-K] (Menegatti et al.,Biotechnol.Bioeng. ,2013, 110:857)、环九缩酷酸肽 cyclo[A-Dap(Na-Ac)-RWHYFK-A-E] (Menegatti et al·,Anal. Chem. ,2013, 85:9229)以及 树状多肽 TG19318(Fassina et al.,J.Mol.Recognit.,1998,ll:128)等。上述多肽配基在 实际应用时,有些与抗体相互作用较强,需要酸性或碱性较强的条件才能洗脱,影响抗体活 性;有些配基的耐盐结合能力较弱,料液需要稀释。因此,开发性能更优良的多肽配基亲和 介质,缩短肽链长度,提高抗体吸附容量,且具有耐盐吸附特性,洗脱条件温和,对于抗体的 规模化制备具有重要的意义。

【发明内容】

[0005] 本发明的目的是提供一种以四肽为功能配基的亲和层析介质及其制备方法。
[0006] 以四肽为功能配基的亲和层析介质包括层析基质、空间臂和配基,所述的层析基 质为带有羟基的亲水性多孔微球,空间臂为己二胺,配基为酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸和组 氨酸组成的四肽。
[0007] 所述的层析介质的结构组成为:
[0008]
【主权项】
1. 一种以四肽为功能配基的亲和层析介质,其特征在于包括层析基质、空间臂和配基, 所述的层析基质为带有羟基的亲水性多孔微球,空间臂为己二胺,配基为酪氨酸、苯丙氨 酸、精氨酸和组氨酸组成的四肽。 层析介质的结构组成为:
2. 根据权利要求1所述的一种以四肽为功能配基的亲和层析介质,其特征在于所述的 层析基质为具有多孔结构和表面羟基的亲水性微球。
3. 根据权利要求1或2所述的一种以四肽为功能配基的亲和层析介质,其特征在于层 析基质为琼脂糖凝胶或纤维素微球。
4. 一种如权利要求1所述的以四肽为功能配基的亲和层析介质的制备方法,其特征在 于包括如下步骤: 1) 将层析基质抽干后,加入0.2-1倍层析基质质量的体积百分比为20%的二甲基 亚砜、0. 1-1倍层析基质质量的烯丙基溴和0. 1-0. 5倍层析基质质量的氢氧化钠,30°C下 180rpm摇床中活化8-48小时,抽滤,用去离子水洗涤得到活化层析基质; 2) 将活化层析基质和0. 1-0. 5倍活化层析基质质量的N-溴代丁二酰亚胺混合进行溴 代醇化,30°C下180rpm摇床中反应1小时,抽滤,用去离子水洗涤,得到溴代醇化的层析基 质; 3) 将溴代醇化的层析基质和0. 1-0. 3倍溴代醇化的层析基质质量的己二胺以及IM碳 酸钠缓冲液混合,碳酸钠缓冲液的pH为10-12, 30°C下180rpm摇床中反应8-24小时,得到 氣基活化基质; 4) 取氨基活化基质,分别用去离子水、无水乙醇和无水N,N-二甲基甲酰胺清洗,清 洗后的氨基活化基质加入到含有〇. 2-1倍活化氨基密度的四肽、0. 4-2倍活化氨基密度 的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,Ν,Ν',Ν' -四甲基脲六氟磷酸酯、0. 8-4倍活化氨基密度的 N,N-二异丙基乙胺的N,N-二甲基甲酰胺溶液中,25°C下水浴摇床中反应8小时,得到多肽 偶联后的介质; 5) 将多肽偶联后的介质依次用无水N,N-二甲基甲酰胺、无水乙醇和去离子水清洗,抽 滤,加入到乙酸钠和乙酸酐的混合液中,25°C下水浴摇床中反应1小时,去离子水洗涤,得 到以四肽为功能基团的亲和层析介质。
5. 如权利要求4所述的制备方法,其特征在于所述的乙酸钠和乙酸酐的体积比为1:1。
【专利摘要】本发明公开了一种以四肽为功能配基的亲和层析介质及其制备方法。二甲基亚砜溶液中加入抽干基质和烯丙基溴进行活化;活化基质与N-溴代丁二酰亚胺反应;将溴代醇化的基质与己二胺反应,得到氨基活化基质;依次用去离子水、无水乙醇和无水N,N-二甲基甲酰胺洗涤,加入含有四肽、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、N,N-二异丙基乙胺的N,N-二甲基甲酰胺溶液,偶联四肽配基;将偶联四肽的介质置于乙酸钠和乙酸酐的混合液中,得到以四肽作为功能配基的亲和层析介质。本发明所研制的新型层析介质,功能基团为酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸和组氨酸组成的四肽,基于抗体Fc片段的蛋白A结合位点而设计,抗体结合的选择性大幅度提高,可以用于抗体的高效分离。
【IPC分类】B01J20-281, C07K1-22, B01J20-30, B01D15-38
【公开号】CN104645949
【申请号】CN201510058143
【发明人】姚善泾, 王荣柱, 林东强
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年2月4日
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