一种用于单球水平的抗肿瘤药物筛选微流控芯片及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于聚合物芯片的加工、制作、修饰及其应用领域，具体涉及一种用于三维单球水平的抗肿瘤药物筛选微流控芯片及应用。
【背景技术】
[0002]单层细胞培养是体外细胞培养的主要方法，它具有培养简单、易操作、费用低、可大量应用的优点，被广泛用作体外药理毒理研究的实验模型。但常规的体外单层培养方法不能提供组织正常生长发育所需的环境条件，而生长环境对细胞基因表达及行为有着重要的影响，体内每个细胞的基因组是相同的，但不同器官组织中其表型和功能结构不同，如胚胎细胞异位移植可使细胞恶化发展成畸胎瘤，而在子宫中能发育成正常胚胎；同样，畸胎瘤细胞在胚胎中可转化为正常细胞。在单层细胞培养中，细胞附在底物平面上生长，因缺少立体支架，只能向二维发展，不能生成细胞外基质。由于缺乏体内特异性生长因子及分化因子作用，细胞不能分化而失去原体内时的立体形态。因此，单层细胞培养所反映的生物学性状，与体内组织细胞相差甚远。因此为细胞提供与体内相似的支架系统，创建与原体内类似的生长环境，促使细胞增殖、分化及呈现出类似体内组织结构和功能性状是体外细胞培养的发展趋势。细胞三维培养就是基于上述特点，通过一些特殊的培养技术所建立的体外立体培养方法。三维培养体系为细胞提供类似体内生长环境的支架或基质，细胞通过紧密连接和缝隙连接等连接方式建立细胞间及细胞与胞外基质间的联系，形成一定的三维结构。三维培养细胞基因表达、基质分泌及细胞功能活动与单层培养细胞均有明显差异，而与体内细胞更为相似。因此三维细胞培养既能保留体内细胞微环境的物质结构基础，又能体现细胞培养的直观性及条件可控制性，把体外无细胞及单层细胞培养体系与组织器官及整体研究联系起来。
[0003]临床肿瘤治疗通常会出现多药耐药(multidrug resistance, MDR)现象，即肿瘤细胞对多种化疗药物产生交叉耐药性。近年来虽然对其机制进行了大量研究，但临床上还没有可行方法抑制肿瘤细胞的这种多药耐药性。在体外药物耐药性研究中通常采用单层细胞培养模型，该模型的基本单元是单个瘤细胞，忽略了肿瘤作为一个特殊异质性群体其细胞生长微环境和细胞间的相互作用，因此在此基础上得到的结果与体内实验结果往往有很大差异。有研究表明三维培养肿瘤细胞的结构功能与单层培养肿瘤细胞明显不同，而类似与体内实体瘤，用三维培养的肿瘤细胞进行生物医学研究能比较真实反映肿瘤体内情况。在三维培养肿瘤细胞抗肿瘤药物筛选研究中，肿瘤细胞多细胞微球的大小会直接形象肿瘤细胞对药物的抗药性。
[0004]近年来利用制作弧形凹陷微结构形成三维细胞结构来研究细胞行为和功能越来越被人所关注。现在报道的微结构形成三维细胞结构一方面可为体外培养细胞提供与其组织来源相似甚至相同的细胞生长微环境和细胞联系，从而既有利于各类细胞的分化定向诱导，又有利于细胞分化表型的维持和增殖；另一方面可望在体外构建与各类组织、器官相应的细胞三维生长类似物或等同物。而其应用领域也涉及干细胞分化，胰岛细胞功能再生、肿瘤细胞的抗药性，体外器官重建等诸多方面。随着生物医学领域的需求，制作弧形凹陷微结构方法也在飞速发展，主要的方法有:冰刻蚀，软刻蚀、电子束刻蚀，原位合成法，气动技术等(1、Park, J.Y.; Hwang, C.Μ.; Lee, S.-H., Ice-lithographicfabricat1n of concave microwells and a microfluidic network.B1medicalMicrodevices2008, 11(1)，129-133 ;2、Xu, Y.;Xie, F.;Qiu, T.;Xie, L.;Xing, ff.; Cheng, J.,Rapid fabricat1n of a microdevice with concave microwells and its applicat1nin embryoid body format1n.B1microfluidics2012, 6(I)，016504)。
[0005]尽管上述方法现在已经发展的较为成熟，但仍有很多因素限制了其更加广泛的应用:软刻蚀、电子束刻蚀等技术修饰的精度高，但其需要专业化的昂贵仪器并且操作复杂；原位合成法虽然操作简单，但其用于原位合成的分子价格昂贵并且合成的体系有时会用到大量有机试剂；气动方式技术简单、快速、成本低廉，但所需要的通道模板是要求带有小孔结构的通透模板，制作方法繁琐、操作复杂。上述方法中，只能形成统一大小的凹陷的小孔，不能用一步法形成多个尺寸的凹陷小孔，而在肿瘤细胞的药物筛选中，肿瘤微球的大小对于抗肿瘤药物筛选有着直接的影响。
[0006]综上所述，发明一种简单，快速，可控性强、并且价格低廉的一步法制作多个尺寸的制作弧形的用于三维单球水平的抗肿瘤药物筛选微流控芯片具有十分重要意义的。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供用于单球水平的抗肿瘤药物筛选微流控芯片及应用，以解决以往制作工艺中存在的操作步骤繁琐复杂、价格昂贵，快速形成肿瘤微球及其抗肿瘤药物的高通量和高内涵的药物筛选。
[0008]本发明提供了一种用于单球水平的抗肿瘤药物筛选微流控芯片，该芯片为2层整合芯片，上层为流体小室，长700微米，宽700微米，高80微米，具有平行的12组平行的微流控单元，每个单元不同直径大小的凹陷小孔与流体通道，进行平行三维单球水平的抗肿瘤药物筛选实验；
[0009]该芯片的制备方法如下:
[0010](I)利用光蚀刻技术制作含有多个直径尺寸的小孔的SU-8聚合物模板；
[0011](2)对SU-8聚合物模板在85摄氏度加热5分钟进行热熔，使小孔的形状由直角形变为凹陷型；
[0012](3)对热熔后的SU-8聚合物模板进行整体的紫外曝光90秒；
[0013](4)将未固化PDMS聚合物溶液(单体与硅烷偶联剂体积配比为10:1)倾倒入SU-8聚合物模板上，85摄氏度加热固化PDMS聚合物溶液40分钟，剥离固化PDMS聚合物芯片，得到PDMS聚合物反模芯片；
[0014](5)将未固化PDMS聚合物溶液(单体与硅烷偶联剂体积配比为10:1)倾倒入上述的PDMS聚合物反模芯片上，85摄氏度加热固化PDMS聚合物溶液40分钟，剥离固化PDMS聚合物芯片，得到具有直径不同的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片；
[0015](6)利用软刻蚀技术制作含有流路通道的PDM S聚合物芯片；
[0016](7)利用等离子体仪器不可逆封接含有流路通道的PDMS聚合物芯片和有直径不同的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片；
[0017](8)对上述的整合芯片进行表面修饰，即得本发明微流控芯片；
[0018]其中，表面修饰条件为:0.2%PF-127处理4个小时，后用无菌水和PBS溶液各冲洗2次。
[0019]本发明提供的用于单球水平的抗肿瘤药物筛选微流控芯片，该方法中所形成的微米级别的凹孔，该微孔的宽度和结构为设计固定，微孔的直径大小依次设定为:200，300，400，500，600，700，800微米；凹陷形小孔的深度通过调节乳酸乙酯显影SU-8聚合物模板的时间来控制，时间为5分钟，凹陷形小孔的曲率形状通过在加热板调节热熔的加热时间来控制，加热时间为5分钟。
[0020]本发明还提供了所述微流控芯片的应用，该芯片用于形成直径不同的U87细胞的三维小球及其抗肿瘤药物的筛选。
[0021]本发明提供的微流控芯片的应用，先对弧形凹陷小孔的PDMS聚合物芯片进行表面修饰，以达到细胞不贴附表面的作用，接种U87细骨细胞悬液，在重力的条件下，U87细胞会自发的形成三维微球，在形成微球的过程中，由于小孔直径的不同，细胞沉降的数量不同，会形成大小不同的U87细胞微球。
[0022]本发明提供的微流控芯片的应用，所述抗肿瘤药物的筛选方法为:在微流控芯片每个功能单元中接种U87细胞悬液，培养20-24小时后，U87细胞形成三维的单个微球;U87细胞微球培养4-5天后，加入抗肿瘤药物处理24-30小时。
[0023]本发明提供的微流控芯片的应用，所述的抗肿瘤药物为白藜芦醇和PI3K抑制剂P1-103，浓度分别为200微摩/升和1.5纳摩/升。
[0024]本发明的优点在于:
[0025]1、可一步法形成多个尺寸的小孔，用于形成大小不同的肿瘤微球；
[0026]2、还有12个功能单元，可进行流体操作；
[0027]3、无需昂贵的仪器，操作简单、快速；
[0028]4、实验成本低廉；
[0029]5、不涉及有机试剂，环境友好；
[0030]6、可与其它技术集成化。
【附图说明】
[0031]图1为用于单球水平的抗肿瘤药物筛选微流控芯片设计图；(I)为上层