血小板筛选芯片及其制作方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种血小板筛选芯片及其制作方法和应 用。
【背景技术】
[0002] 输注血小板可预防和治疗血小板减少或血小板功能缺陷引起的出血等疾病，但患 者多次输血后，易产生血小板相关抗体，导致血小板输注无效（PTR)。因此，在血小板输注 前，对患者进行血小板抗体的检测，选择适当的血小板输注是非常必要的。特别是血小板抗 体阳性患者进行交叉配型以筛选相容性供者，可显著提高血小板输注的疗效。目前检测血 小板抗体与交叉配型实验主要是MASPA法和Capture-P法，这些方法使用的进口试剂昂贵， 检验成本较高，增加了患者的负担；同时检测的时间较长，步骤较多，对结果的可靠性产生 一定影响。
【发明内容】
[0003] 基于此，有必要提供一种在血小板输注时，可快速进行输注血小板配型实验且成 本较低的血小板筛选芯片及其制作方法和应用。
[0004] 一种血小板筛选芯片，包括基板、涂覆在所述基板表面的金层、位于所述金层表面 的引发剂自组装单层及位于所述引发剂自组装单层上的聚合物层，所述聚合物层的聚合物 修饰有羧基，待筛选的所述血小板可与所述羧基反应而被连接在所述聚合物层上。
[0005] 在其中一个实施例中，所述基板为多孔芯片基板，所述金层涂覆在所述基板的孔 底。
[0006] 在其中一个实施例中，所述引发剂自组装单层的材料为硫醇引发剂。
[0007] 在其中一个实施例中，所述聚合物层的聚合物单体为寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯及 甲基丙烯酸羟乙酯中的至少一种。
[0008] -种血小板筛选芯片的制作方法，包括如下步骤：
[0009] 使用自组装单层技术在涂覆有金层的基板表面形成引发剂自组装单层；
[0010] 无氧条件下，将含有引发剂自组装单层的基板置于聚合物单体溶液中进行聚合反 应，所述聚合物单体溶液包括〇. 8mmol/12mL的2-2'联批陡、5mmol/12mL的聚合物单体、 0. 04mmol/12mL的CuCl2以及0. 04mM/12mL的抗坏血酸，溶剂是体积比为1:1的水与甲醇的 混合溶剂；
[0011] 聚合反应结束后将得到的芯片清洗干净，置于含有l〇mg/mL 丁二酸酐和15mg/ mL4-二甲氨基吡啶的二甲基甲酰胺溶液中进行羧基功能化处理，在所述聚合物上修饰羧 基。
[0012] 在其中一个实施例中，所述基板为多孔芯片基板，所述金层涂覆在所述基板的孔 底。
[0013] 在其中一个实施例中，所述引发剂自组装单层为硫醇引发剂。
[0014] 在其中一个实施例中，所述聚合物单体为寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯及甲基丙烯酸 羟乙酯中的至少一种。
[0015] 一种血小板的筛选方法，包括如下步骤：
[0016] 按照上述任一实施例所述的血小板筛选芯片的制作方法制作血小板筛选芯片；
[0017] 将制作好的所述血小板筛选芯片置于0· 2mol/L N-羟基琥珀酰亚胺和0· Imol/ Ll-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的水溶液中进行活化修饰；
[0018] 将待筛选的血小板点样在活化修饰处理后的所述血小板筛选芯片上；
[0019] 将点样后的所述血小板筛选芯片固定在表面等离子共振仪的流动池中，通入PBS 缓冲液直至获得稳定的基线，通入封闭试剂封闭残余的活化基团，最后通入血清样本，通过 表面等离子共振仪直接检测血清样本与血小板的相互作用结果，从而筛选得到符合要求的 血小板。
[0020] 在其中一个实施例中，所述封闭试剂为浓度lmol/L、pH8. 0的乙醇胺溶液。
[0021] 通过使用上述血小板筛选芯片，可将待筛选血小板点样于芯片的特定区域，构建 成高通量的血小板芯片，再利用表面等离子共振技术（SPR)技术快速、非标记、高敏感度的 特点，直接筛查待测血清样本，分析待测血清样本与待测血小板的相容性，从而筛选得到符 合要求的血小板。该血小板筛选芯片成本较低，血小板筛选效率高，具有较大的市场推广潜 力。
【附图说明】
[0022] 图1为利用血小板筛选芯片进行的血小板抗体快速筛选和配型的方法的基本流 程图；
[0023] 图2为实施例部分的血小板阵列芯片图，利用点样仪将24个机采血小板和PBS(对 照点）点样于芯片的特定，构成5X5的矩阵；
[0024] 图3为利用血小板筛选芯片检测待测血清样本结果，其中，图3a为血清样本与带 筛选的血小板有相互作用过程，即阳性，图3b为血清样本与带筛选血小板无相互作用过 程，即阴性；
[0025] 图4为利用血小板筛选芯片检测血小板抗体的结果；
[0026] 图5为利用Capture-P固相捕获法检测血小板抗体的结果。
【具体实施方式】
[0027] 下面主要结合附图及具体实施例对血小板筛选芯片及其制作方法和应用作进一 步详细的说明。
[0028] 如图1所示，一实施方式的血小板筛选芯片100包括基板110、涂覆在基板110表 面的金层120、位于金层120表面的引发剂自组装单层130及位于引发剂自组装单层130上 的聚合物层140。
[0029] 本实施方式的基板110可以为多孔芯片基板，多孔形成点阵，如5*5点阵、6*6点阵 等。金层120涂覆在多孔基板的孔底。
[0030] 本实施方式的引发剂自组装单层130为硫醇引发剂。
[0031] 聚合物层140的聚合物修饰有羧基，待筛选的血小板可与羧基反应而被连接在聚 合物层上。进一步，在本实施方式中，聚合物层140的聚合物单体为寡聚乙二醇甲基丙烯酸 酯(如OEGMA526等）及甲基丙烯酸羟乙酯中的至少一种。
[0032] 本实施方式还提供了一种血小板筛选芯片的制作方法，其包括如下步骤：
[0033] 步骤一：使用自组装单层技术在涂覆有金层的基板表面形成引发剂自组装单层。
[0034] 步骤二：无氧条件下，将含有引发剂自组装单层的基板置于聚合物单体溶液中进 行聚合反应，聚合物单体溶液包括〇. 8mmol/12mL的2-2'联批陡、5mmol/12mL的聚合物单 体、0. 04mmol/12mL的CuCl2以及0. 04mM/12mL的抗坏血酸，溶剂是体积比为1:1的水与甲 醇的混合溶剂。
[0035] 步骤三：聚合反应结束后将得到的芯片清洗干净，置于含有10mg/mL 丁二酸酐和 15mg/mL4-二甲氨基吡啶（DMAP )的二甲基甲酰胺（DMF )溶液中进行羧基功能化处理，在聚 合物上修饰羧基。
[0036] 此外，本实施方式还提供了一种血小板的筛选方法，包括如下步骤：
[0037] 步骤一：按照上述任血小板筛选芯片的制作方法制作血小板筛选芯片。
[0038] 步骤二：将制作好的血小板筛选芯片置于0. 2mol/L N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)和 0. lmol/Ll-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC)的水溶液中进行活化修饰。
[0039] 步骤三：将待筛选的血小板点样在活化修饰处理后的血小板筛选芯片上。
[0040] 步骤四：将点样后的血小板筛选芯片固定在表面等离子共振仪的流动池中，通入 PBS缓冲液直至获得稳定的基线，通入封闭试剂封闭残余的活化基团，最后通入血清样本， 通过表面等离子共振仪直接检测血清样本与血小板的相互作用结果，从而筛选得到符合要 求的血小板。
[0041] 其中，封闭试剂可以为浓度lmol/L、pH8. 0的乙醇胺溶液。
[0042] 通过使用上述血小板筛选芯片，可将待筛选血小板点样于芯片的特定区域，构建 成高通量的血小板芯片，再利用表面等离子共振技术（SPR)技术快速、非标记、高敏感度的 特点，直接筛查待测血清样本，分析待测血清样本与待测血小板的相容性，从而筛选得到符 合要求的血小板。该血小板筛选芯片成本较低，血小板筛选效率高，具有较大的市场推广潜 力。
[0043] 以下为具体实施例部分：
[0044] 1、仪器和材料
[0045] I. 1 仪器：
[0046] SPR分析仪(美国，Plexra)