一种以胆固醇为配基的高效疏水相互作用色谱填料制备与应用
【专利说明】-种以胆固醇为配基的高效疏水相互作用色谱填料制备与 应用 发明领域
[0001] 本发明涉及一种以胆固醇为配基的高效疏水相互作用的色谱填料的制备方法及 其用于蛋白质复性与纯化，属于高效液相色谱技术和生物工程技术交叉领域。
【背景技术】
[0002] 胆固醇是生物膜上的主要组成部分。在HPLC中，以胆固醇分子作为色谱配 基，采用表面化学修饰合成色谱填料引起了色谱工作者的极大兴趣，并取得一定的 进展[Witkiewicz Z.，Mazur J.LC GC，1990,8(3) :224-236;Pesek J.J.，Matyska M.T. Interface Science，1997,5(2) :103-117]。已有的文献报道，以胆固醇为配基的色谱 填料主要集中于反相液相色谱（RPLC)研宄，其高效分离性能已得到验证和应用[Soukup J.，Jandera P. Journal of Chromatography A，2012,1228:125-134]。对于具有活性功能 的蛋白质而言，RPLC仅用于蛋白质分析。
[0003] 而与反相液相色谱法机理相同的疏水相互作用色谱（HIC)是采用流动相为盐-水 洗脱体系，色谱条件温和，被广泛应用于天然活性蛋白质分离和变性蛋白的复性与同时纯 化。目前，在HIC中应用最多的配基有两类：一类是线性链烷基（如丁基或辛基）和芳香基 团（如苯基），另一类是疏水性温和的配基有聚乙二醇（PEG)和聚丙二醇（PPG)等[Hubert P.，et al. Journal of Chromatography A，1991，539(2) :297_306]。前者配基所构成的填料 容易导致蛋白质，尤其是变性蛋白难以洗脱。后者疏水性弱的配基在变性蛋白复性过程中， 会造成吸附载量下降、变性蛋白易于直接穿透的缺点，从而使蛋白质的复性效率很低。
[0004] 本发明以胆固醇分子作为色谱配基，制备一种硅胶基质的高效疏水相互作用色谱 填料，并将该填料应用于天然蛋白质的分离和变性蛋白的复性与纯化。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于将细胞膜上的两性功能分子胆固醇作为色谱填料配基，制备一 种具有特殊功能的硅胶基质HPHIC填料，并对还原变性溶菌酶、重组人Flt31igand(FL)包 涵体和重组人干细胞因子（rhSCF)进行复性与同时纯化，以期克服HPHIC配基在变性蛋白 复性与纯化中由于其疏水作用较强或较弱会造成吸附载量过强或下降、变性蛋白难于洗脱 或易于直接穿透的缺点。
[0006] 为了实现上述任务，本发明采取解决技术方案如下：
[0007] 1.以空白基质为原材料，以胆固醇及其衍生物为配基，制备结构式⑴所示胆固 醇配基的硅胶基质高效疏水相互作用色谱填料；
[0008]
【主权项】
1. 结构式（I)所示高效疏水相互作用色谱填料
其中，R基团可以是：〇1(〇13)〇12〇12〇1 2〇1(〇13)2,〇1(〇13)〇12〇1 2〇)011，〇1(〇13)CH2CH2CH(CH2CH3)CH(CH3) 2,CH(CH3)CH2CH2CHC(CH3) 2等。
2. 权利要求1高效疏水相互作用色谱填料结构式（I)中的色谱配基为胆固醇类衍生物 即环戊烷多氢菲的衍生物，如胆固醇；
3. 权利要求1所述的高效疏水相互作用色谱填料制备方法，包括以下步骤： (1) 将硅烷偶联剂与活化硅胶反应得到环氧基硅胶； (2) 将环氧基硅胶与胆固醇以及胆固醇类衍生物反应得到高效疏水相互作用色谱填 料； (3) 将环氧基硅胶与含有羧基的胆固醇类衍生物反应得到具有高效疏水相互作用/弱 阳离子交换作用色谱填料；
4. 根据权利要求3所述高效疏水相互作用色谱填料制备方法，其特征在于包括以下步 骤： (1) 所用的活化硅胶经1 : 10~1 : 20 (g/mL，m/v) 15~20%盐酸活化2~6小时， 用蒸馏水洗至中性，100~150°C真空干燥12~24小时。其孔径在80~200A之间，粒径为 5~10ym的球状多孔硅胶。 (2) 按照1 : 1~1 : 2(g/mL，m/v)将干燥的活化硅胶和硅烷偶联剂分别加入装有 NaAc缓冲液的三颈圆底烧瓶中，调节温度80~90°C，机械搅拌反应3~5h，然后依次用 NaAc缓冲液、甲醇、水依次洗涤干净，真空干燥即可得到环氧基硅胶。 所述NaAc缓冲溶液浓度为45~55mmol/L，pH值为4. 5~6. 5。 (3) 按照1 : 0. 5~1 :l(g/g，m/m)将干燥的环氧基硅胶和胆固醇或胆酸分别加入 到干燥三颈瓶中，再依次加入1 : 1 : 0.l(mL/mL/mL，v/v/v)的无水乙醚、干燥的1，4_二 氧六环以及三氟化硼乙醚，在4~5°C条件下机械搅拌反应3. 5~4. 5h。反应结束之后分 别用无水乙醚、丙酮、甲醇、水清洗填料，真空干燥得到色谱填料。
5. 权利要求1所述的高效疏水相互作用色谱填料在变性蛋白的复性与纯化应用，其特 征在于 (1) 将该色谱填料用于还原变性的溶菌酶的复性与纯化。当在流动相中添加了 2.0~ 3.Omol/L脲时，其质量回收率及活性回收率分别为80~90 %和95~98%。 (2) 将该色谱填料用于重组人酪氨酸激酶配体（RecombinedhumanFlt3ligand， rhFL)的复性与纯化。将rhFL变性抽提液直接进样至流动相A平衡的色谱柱中，在优化色 谱条件下，采用0-100%流动相B的30min线性梯度洗脱，得到的目标峰馏分质量回收率为 45~50 %，纯度为95~97 %，生物比活为7. 2~8. 0X108IU/mg。 (3) 将该色谱填料用于重组人干细胞因子（Recombinedhumanstemcellfactor， rhSCF)的复性与纯化。将rhSCF变性抽提液直接进样至流动相A平衡的色谱柱中，在优化 色谱条件下，采用0-100 %流动相B的30min线性梯度洗脱，得到的目标峰馏分纯度为95~ 98%，质量回收率为55~65%，生物比活为1. 1~1.3X106IU/mg。 (4)所述的流动相六为2.5~3.0111〇1/1(順4)2504,20 . 0~50.0111111〇1/1腿2?04，口117.0~ 7.4 ;流动相B为20. 0~50.0 mmol/L KH2P04, pH 7. 0~7.4 ;或者所述的流动相A分别为 2. 5~3. Omol/L (NH4) 2S04, 20 . 0~50.0 mmol/L KH2P04, 2. 5~3. 5mol/L Urea，pH 7. 0~ 7.4 ;流动相B为20. 0~50.0 mmol/L KH2P04, 2. 5~3. Omol/L Urea，pH 7. 0~7.4〇 (5) 所述的流动相A和流动相B或称为平衡缓冲液和洗脱缓冲液，不同是均添加2. 5~ 3.0mol/LUrea。
【专利摘要】本发明提供一种制备和应用具有特殊功能的高效疏水相互作用色谱(HPHIC)填料的方法。将细胞膜上的两性功能分子胆固醇作为固定相配基，与硅胶基质表面化学修饰获得了仿生的HPHIC填料。该填料装填的HPHIC柱采用盐-水为洗脱体系，可应用于天然蛋白质分离，变性溶菌酶、重组人酪氨酸激酶配体(rhFL)包涵体和重组人干细胞因子(rhSCF)的复性与同时纯化。
【IPC分类】B01J20-281, B01J39-16, B01J20-22, C07K1-20, B01J39-08, C12N9-36, C07K14-475, B01J20-30, C07K14-705
【公开号】CN104841375
【申请号】CN201510232604
【发明人】王骊丽, 屈倩, 袁洁, 杨毅聪
【申请人】西北大学
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年5月8日