一种高效液相色谱反相键合相的超/亚临界流体封端方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种高效液相色谱反相键合相的超/亚临界流体封端方法。
【背景技术】
[0002] 以C18为代表的高效反相液相色谱柱一直被描述为药物发现、开发、方法验证 (validation)的心脏，高效反相液相色谱柱也极其广泛地应用在药物代谢及动力学、生命 科学、医疗健康、生物分析检测、毒品和兴奋剂检测、食品安全分析、环境分析、军事、国土安 全等领域。高效反相液相色谱制备柱也是最重要的分离纯化技术之一。
[0003] 常规HPLC方法的开发几乎总是从C18作为出发点，反相色谱占了 80%以上的应 用。无论是过去、现在还是可预见的未来，以球形B型硅胶为材料骨架的高效反相液相色谱 柱在实际应用中一直占有统治地位。
[0004] 过去数十年来，无数努力集注于改善硅胶的品质、优化键合化学和封端技术。
[0005] 二十多年前，使用有机硅材料取代无机硅材料作为起始原料生产球形硅胶代表一 个划时代的革命，生产的球形硅胶命名为B型球形硅胶。无机A型硅胶重金属含量很高，硅 胶表面若干位置严重酸化及螯合效应等导致许多碱性化合物回收率低。球形B型硅胶重金 属含量很低，在非常大的程度上消除了 A型无机硅胶表面若干位置严重酸化及螯合效应等 问题。用B型球形硅胶合成高效液相色谱填料，导致高效液相色谱柱产品质量有质的飞跃。
[0006] 十多年前，Waters公司首先引入市场的超高压超高效UPLC技术，使用小于2 ymB 型球形硅胶生产的UPLC超高效液相色谱柱，和Advanced Material公司首先引入市场的 1. 7 y m和2. 6 y m核壳硅胶型球形硅胶生产的UHPLC超高效液相色谱柱代表另一个划时代 的革命。UPLC，UHPLC超高效液相色谱柱柱效是传统5 y m的高效反相液相色谱柱的三至四 倍，因此使用短的5cm长度UPLC，UHPLC超高效液相色谱柱经常可以到达同5 y m25cm长度 的高效液相色谱柱同样的效果，但分析时间缩短三至四倍，大大提高了分析速度。
[0007] 在键合化学上，过去数十年来除了优化传统的C18、C8、Phenyl键合化学外，最重 要的是Supelco公司首先引入市场的极性嵌入式（Polar embedded)键合相。极性嵌入 式（Polar embedded)键合相是C18高效反相液相色谱〃卫星群〃中最重要的产品，是C18 和C8键合相最重要的补充。极性嵌入式（Polar embedded)键合相起源于Supelco ABZ。 Supelco ABZ的键合方法是用aminopropyl键合相和长链羧酸缩合反应形成一个C16酰胺。 这个键合相对碱性化合物具有比较好的峰形，但很明显是以牺牲酸性化合物和两性化合物 峰形为代价，因为aminopropyl键合相的順 2功能团不可能完全反应，键合相在酸性pH值 下表面电荷为正。需要说明的是，市场上一些C18就是使用携带正电荷的键合或封端试剂 生产的。从ABZ起头，Supelco充分认识到上述战略的副作用，因此首先使用氨丙基硅烷合 成C16酰胺硅烷，然后键合到B型球形硅胶上，这就是Supelco著名的Discovery K: Amide。 由于没有专利保护，其他色谱厂商踊跃模仿，最终形成以酰胺或酰酯作为代表的极性嵌入 式（Polar embedded)键合相群。极性嵌入式（Polar embedded)键合相的选择性独特，一 些在C18和C8键合相上困难的分离可能在极性嵌入式（Polar embedded)键合相上得到很 好的解决。在相同条件下，合格的酰胺极性嵌入式键合相比相应的C18键合相对碱性化合 物有更好的峰形，因为酰胺和碱性化合物有极性-极性（电荷转移）的相互作用，客观上部 分屏蔽了酸性硅醇基效应。合格的酰胺极性嵌入式键合相能够在100%水相条件下使用，而 且比所谓的水相C18稳定得多。
[0008] 尽管取得了这些进展，键合相封端问题没有获得很好的解决，一直是困扰色谱领 域最大的问题。迄今为止全部的尝试只获得有限的成功，键合相封端几乎全部使用固-液 回流。事实上，不管什么样的催化剂和封端试剂被使用，固-液回流下的封端是一个死胡 同。用同一厂商同一工艺生产的不同孔径和不同粒径的B型球形硅胶，用同一键合化学生 产的C18键合相最能够体现这一点。一般来说，大孔硅胶C18键合相酸性硅醇基效应（例 如300A C18)明显小于相应的中孔硅胶2〇〇A C18键合相，中孔硅胶200A C18键合相酸 性硅醇基效应明显小于相应的小孔硅胶l()〇A C18键合相。此外，一般来说，同一孔径B型 球形硅胶，用同一键合化学生产的C18键合相，10 ym粒径键合相酸性硅醇基效应明显小于 5 y m粒径键合相。5 y m粒径键合相又明显小于3 y m粒径键合相，3 y m粒径键合相粒径键 合相又明显小于1. 7 um粒径键合相。
【发明内容】
[0009] 研宄发现，封端试剂在固-液回流状态下很难扩散到硅胶的一些小孔内部，因此 无法封闭相应的酸性硅醇基，色谱中体现为许多碱性化合物拖尾严重。球形硅胶是由二氧 化硅纳米粒子聚合而成。小粒径硅胶孔隙明显小于大粒径硅胶，封端试剂在固-液回流状 态下很难扩散到硅胶的一些小孔内部，因此无法封闭相应的酸性硅醇基。
[0010] 为了解决上述技术问题，本发明提供了一种高效液相色谱反相键合相的超/亚临 界流体封端方法，用于最大程度消除硅醇基的酸性效应。从基础科学的观点，超临界流体封 端或亚临界流体封端方法应该是最终版本的封端技术，因为在超临界流体或亚临界流体状 态下，扩散系数是固-液回流状态的1000倍，封端试剂能充分扩散到硅胶的所有小孔内部 而且通过化学反应最大程度封闭活性硅醇基。理论上，这种方式几乎是唯一的可行性。
[0011] 本发明提供的高效液相色谱反相键合相的超/亚临界流体封端方法，是使用二氧 化碳超临界流体和/或二氧化碳亚临界流体作为载体将封端试剂和催化剂带到装有硅胶 反相键合相的超/亚临界流体反应器中，封闭条件下进行封端反应。
[0012] 本发明方法所述反相键合相覆盖所有的反相和含反相机理的填料，包括但不限 于：单官能基团，二官能基团和三官能基团C18、C8、phenyl、hexyl-phenyl、C5、C4、C1、 PFPP，极性嵌入式（Polar embedded)键合相例如酰胺或酰酯，C3Q等。
[0013] 所述高效液相色谱反相键合相覆盖所有硅胶或含硅胶的填料，包括但不限于：B 型球形硅胶、核壳硅胶、有机和无机混杂硅胶。
[0014] 所述封端试剂和催化剂可使用领域内公开的试剂。例如，封端试剂包括但不限 于：1，1，3, 3, 5, 5-六甲基环三硅氮烷，八甲基环四硅氮烷，1，1，3, 3, 5, 5, 7, 7, 9, 9-环五聚 二甲基硅氧烷，1，1，3, 3, 5, 5, 7, 7, 9, 9, 11，11-十二甲基环己硅氧烷，1，1，3, 3, 5, 5-六苯基 环三硅氮烷，1，1，3, 3, 5, 5, 7, 7-八乙基环丁硅氨烷，1，1，3, 3, 5, 5, 7, 7, 9, 9-十二乙基环戊 硅氧烷，1，1，3, 3, 5, 5, 7, 7, 9, 9，11，11-十^乙基环己硅氧烷，^甲基^氣硅烷，^甲基^甲 氧基硅烷，三甲基氯硅烷，甲氧基三甲基硅烷，二甲基叔丁基氯硅烷，正丁基二甲基甲氧基 硅烷，N-丁基甲基二氯化硅，正丁基甲基二甲氧基硅烷，丁基三甲氧基硅烷，叔丁基三氯硅 烷，甲基三氯硅烷，甲基三甲氧基硅烷等和它们的联合使用。催化剂包括但不限于N，0-双 三甲基硅基乙酰胺，氨，三乙胺，1，1，1，3, 3, 3-六甲基二硅亚胺，N，N-二甲基三甲基硅胺等 和它们的联合使用。
[0015] 优选地，上述高效液相色谱反相键合相的超临界流体封端方法中，所述封端反 应时间为3~24小时；所述封端反应的压力条件为50~600bar ;所述封端反应温度为 31. 2 ~200。。。
[0016] 优选地，上述高效液相色谱反相键合相的超/亚临界流体封端方法，还包括封端 反应结束后冷却的步骤，以及冷却后释放封端试剂和催化剂的步骤。
[0017] 优选地，上述高效液相色谱反相键合相的超/亚临界流体封端方法，释放封端试 剂和催化剂后，还包括清洗封端反应产物的步骤，以及干燥封端反应产物的步骤。
[0018] 优选地，上述高效液相色谱反相键合相的超/亚临界流体封端方法中，所述的清 洗是将封端反应