用于纯化抗体的方法
【专利说明】用于纯化抗体的方法 发明领域
[0001] 本发明设及使用固定化至固体支持物的超抗原(诸如蛋白A、蛋白G或蛋白L)的蛋 白纯化领域。具体地，本发明设及洗涂缓冲液组分和在洗涂步骤中使用所述洗涂缓冲液除 去宿主细胞污染物从而使期望的蛋白产物的损失最小化的方法。 阳00引发明背景 在过去的十年中，蛋白A亲和层析作为从哺乳动物细胞培养进料流捕获单克隆抗体(mAb)的主要候选方法已经变得充分建立。由于蛋白A配体和抗体的Fc-区域之间的特异 性结合，该高特异性的亲和步骤能够在单个步骤中除去98%的杂质。在蛋白A层析的通常 操作条件下，将经澄清的细胞培养进料流应用于柱，直到实现抗体的某个加样质量。然后通 常将柱用高离子强度缓冲液洗涂W除去通过非特异性相互作用与树脂结合的宿主细胞污 染物。然后通常将抗体通过抑转换从柱洗脱，并收集用于进一步处理。因此，该工作的主 要目的是研究与盐组合的去污剂用于破坏离子和疏水相互作用并增强宿主细胞污染物的 除去由此减小下游单元操作的纯化负担的用途。
[0003] 对于大规模纯化，将许多努力放置在优化洗涂和洗脱缓冲液的组分W使产物收率 最大化。但是，在同时纯化许多不同蛋白产物的生产情形中，为每种单独蛋白产物开发单独 的洗涂缓冲液需要大量时间和资源来筛选多种缓冲液组分W确定对于每种特别的蛋白产 物而言适当的洗涂缓冲液。可W与不同类型的蛋白一起有效地使用的"一般"中间洗涂缓冲 液将是有用的和合乎需要的。本发明提供了使用运样的洗涂缓冲液组分的蛋白纯化方法。
[0004] 发明概述 在一个方面，本发明设及通过超抗原层析从含有至少一种污染物的溶液纯化蛋白的方 法，所述蛋白包含抗体、抗体片段或免疫球蛋白单个可变结构域（immunoglobulin single vari油le domain),所述方法包括：a)将所述蛋白吸附至固定化在固体支持物上的超抗原； b)通过使含有吸附蛋白的固定化超抗原接触包含脂族簇酸盐的第一种洗涂缓冲液，除去至 少一种污染物；和C)从固定化在固体支持物上的超抗原洗脱所述蛋白。
[0005] 在一个方面，本发明设及一种通过蛋白A层析从污染的蛋白溶液纯化蛋白的方 法，所述方法包括： (a)用蛋白A平衡缓冲液平衡固定化在固相上的蛋白A ; (b)将来自污染的溶液的蛋白吸附至固定化在固相上的蛋白A ; (C)通过用第一种蛋白A洗涂缓冲液洗涂所述固相，除去至少一种污染物，所述第一种 蛋白A洗涂缓冲液包含约50 ml至约55 ml tris碱、约45 ml至约50 ml乙酸、至少一种 脂族簇酸盐，具有约抑7. 5,其中所述脂族簇酸盐选自约100 ml辛酸钢、约20 ml癸酸钢和 约20 ml十二酸钢讯 (d)用蛋白A洗脱缓冲液从所述固相回收蛋白。在本发明的一个方面，在没有加入化C1的情况下制备所有缓冲液。
[0006] 在一个实施方案中，所述蛋白A洗涂缓冲液进一步包含约1 ml至约500 ml醋酸 钢。在一个实施方案中，所述蛋白A洗涂缓冲液包含约300 ml醋酸钢。
[0007] 在一个方面，本发明设及通过蛋白L层析从污染的蛋白溶液纯化蛋白的方法，所 述方法包括： (a)用蛋白L平衡缓冲液平衡固定化在固相上的蛋白L; 化）将来自污染的溶液的蛋白吸附至固定化在固相上的蛋白L; (C)通过用第一种蛋白L洗涂缓冲液洗涂所述固相，除去至少一种污染物，所述第一种 蛋白L洗涂缓冲液包含约50ml至约55mltris碱、约45ml至约50ml乙酸、至少一种 脂族簇酸盐，具有约抑7. 5,其中所述脂族簇酸盐选自约100ml辛酸钢、约20ml癸酸钢和 约20ml十二酸钢讯 (d)用蛋白L洗脱缓冲液从所述固相回收蛋白。在本发明的一个方面，在没有加入化C1 的情况下制备所有缓冲液。
[0008] 在一个实施方案中，所述蛋白L洗涂缓冲液进一步包含约1ml至约500ml醋酸 钢。在一个实施方案中，所述蛋白L洗涂缓冲液包含约300ml醋酸钢。
[0009] 附图简述 图1.辛酸盐浓度研究结果-抗-0SM。
[0010] 图2.辛酸盐浓度研究结果-抗-IL13。
[0011] 图3.簇酸对比研究结果。 阳〇1引发明详述 应该理解，本发明不限于特别的方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，其当然可W变 化。还应该理解，本文中使用的术语仅用于描述特别的实施方案的目的，且无意进行限制。 在本说明书和所附权利要求中使用的单数形式"一个"、"一种"和"所述"包括复数指示物， 除非上下文另外清楚地指示。因此，例如，对"多肤"的提及包括两种或更多种多肤的组合 等。
[0013] 当提及可测量的值诸如量、时间持续等时，本文中使用的"约"意在包括从指定的 值变化±20%或± 10%(包括±5%、± 1%和±0. 1%)，因为运样的变化适于执行所公开的方 法。
[0014] 除非另外定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域 的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管与本文描述的那些相似或相当的任何方法 和材料可W用于实践本发明的测试，但是本文描述了优选的材料和方法。在描述和要求保 护本发明时，将使用W下术语。
[0015] "多肤"、"肤"和"蛋白"在本文中互换地用于表示氨基酸残基的聚合物。多肤可 W具有天然的（组织来源的）起源，从原核或真核细胞制备物重组或天然表达，或经由合 成方法化学产生。该术语适用于运样的氨基酸聚合物：其中一个或多个氨基酸残基是对应 的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，W及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存 在的氨基酸聚合物。氨基酸模拟物表示运样的化学化合物：其结构不同于氨基酸的一般化 学结构，但是其作用方式类似于天然存在的氨基酸。在科学和专利文献中充分描述了非天 然残基；在下面描述了可用作天然氨基酸残基的模拟物的几种示例性非天然组合物和指 南。芳族氨基酸的模拟物可W通过用例如W下氨基酸替换而产生：0-或心糞基（naphyl) 丙氨酸；D-或k苯基甘氨酸；D-或嚷吩基丙氨酸；D-或kl、-2、3-或4-巧基丙氨 酸；D-或心3嚷吩基丙氨酸；D-或k(2-化晚基）-丙氨酸；D-或k(3-化晚基）-丙氨酸； 0-或心(2-化嗦基）-丙氨酸；0-或心(4-异丙基）-苯基甘氨酸：D-(S氣甲基）-苯基甘 氨酸；D- (S氣甲基）-苯丙氨酸：D-对氣-苯丙氨酸；D-或k对联苯基苯丙氨酸；K-或 k对甲氧基-联苯基苯丙氨酸：D-或吗I噪（烷基）丙氨酸；和D-或k烷基丙氨酸 (ainine)，其中烷基可W是被取代的或未被取代的甲基、乙基、丙基、己基、下基、戊基、异丙 基、异下基、sec-isotyl、异戊基或非酸性的氨基酸。非天然氨基酸的芳族环包括，例如，嚷 挫基、苯硫基、化挫基、苯并咪挫基、糞基、巧喃基、化咯基和化晚基芳族环。
[0016] 本文中使用的"肤"包括为本文具体举例说明的那些肤的保守变异的肤。本文中使 用的"保守变异"表示使用另一种生物学上相似的残基替代氨基酸残基。保守变异的例子包 括、但不限于，一个疏水残基诸如异亮氨酸、鄉氨酸、亮氨酸、丙氨酸、半脫氨酸、甘氨酸、苯 丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、正亮氨酸或甲硫氨酸置换另一个疏水残基，或一个极性残 基置换另一个极性残基，诸如精氨酸置换赖氨酸、谷氨酸置换天冬氨酸、或谷氨酷胺置换天 冬酷胺等。可互相置换的中性亲水氨基酸包括天冬酷胺、谷氨酷胺、丝氨酸和苏氨酸。"保 守变异"还包括使用取代的氨基酸替代未取代的母体氨基酸，前提条件是，针对取代的多肤 的抗体也与未取代的多肤发生免疫反应。运样的保守置换是在本发明的肤的种类的定义之 内。本文中使用的"阳离子的"表示在pH7.4具有净正电荷的任何肤。通过本领域技术人 员已知的和本文描述的标准方法，可W确定肤的生物活性。
[0017] 当关于蛋白使用"重组"时，表示该蛋白已经通过引入异源核酸或蛋白或者改变天 然核酸或蛋白进行了修饰。
[0018] 本文中使用的"治疗性蛋白"表示运样的任何蛋白和/或多肤：其可W施用给哺乳 动物W引起组织、系统、动物或人的生物学或医学应答，所述应答是例如研究人员或临床医 师所寻求的。治疗性蛋白可W引起超过一种生物学或医学应答。此外，术语"治疗有效量" 是指运样的任何量：与未接受该量的相应受试者相比，该量导致、但不限于疾病、病症或副 作用的痊愈、预防或改善，或者疾病或障碍的进展速率的下降。该术语在其范围内还包括有 效地增强正常生理功能的量、W及在患者中有效地造成增强或有助于第二种药学试剂的治 疗效果的生理功能的量。
[0019] 本文中鉴定的所有"氨基酸"残基呈天然的心构型。与标准多肤命名法一致，氨 基酸残基的缩写如在下表中所示。
[0020] 表1.氨基酸缩写。_
阳021] 应当指出，所有的氨基酸残基序列在本文用式表示，所述式从左至右的方向为从 氨基端至簇基端的常规方向。
[0022] 在另一个实施方案中，所述多肤是抗原结合多肤。在一个实施方案中，所述抗原结 合多肤选自可溶性的受体、抗体、抗体片段、免疫球蛋白单个可变结构域、Fab、F(ab'）2、Fv、 二硫键连接的Fv、scFv、闭合构象多特异性抗体、二硫键连接的scFv或双抗体。
[0023] 本文中使用的术语"抗原结合多肤"表示能够结合抗原的抗体、抗体片段和其它蛋 白构建体。
[0024] 术语Fv、Fc、Fd、F油或F(油)2使用它们的标准含义（参见，例如，Harlow等人， AntibodiesALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory, (1988))。
[00巧]"嵌合抗体"表示一类经工程改造的抗体，其含有来源于供体抗体的天然存在的可 变区（轻链和重链）W及来源于受体抗体的轻链和重链恒定区。
[00%]"人源化抗体"表示一类经工程改造的抗体，其具有来源于非人供体免疫球蛋白的 它的CDR，该分子的剩余的免疫球蛋白衍生的部分来源于一种（或多种）人免