便携式血细胞计数监测器的制造方法
【专利说明】便携式血细胞计数监测器 夺叉引用
[0001] 本申请要求以下申请的权益：提交于2013年10月11日的美国临时申请第 61/890, 071号；提交于2013年9月16日的美国临时申请第61/878, 431号；和提交于2013 年3月13日的美国临时申请第61/780,732号，上述每个申请的全部内容通过引用并入于 此。 联邦政府替助研究声明
[0002] 本发明是利用美国国家科学基金会资助的加速创新研究拨款下（日期从2011 年 8 月 1 日至 2013 年 7 月 31 日的，名为"Creation of an Ecosystem for Biophotonic Innovation"的NSF加速创新研究拨款第1127888号）的部分政府支持，以及根据合作协议 第PHYO120999号的、来自生物光子学科技中心（一家由美国加州大学戴维斯分校管理的指 定NSF科技中心）的支持而完成的。美国政府享有本发明中的某些权益。
【背景技术】
[0003] 家庭测试或个人测试可以使得对要在诊所或实验室内进行的监测测试的需求减 至最小，减少医疗保健成本并提高受试者的生活质量。测试仍然是许多人的生活质量的关 键方面，特别是对于那些可能无法或者不愿意为了获得适当的监测服务以维持其健康而外 出的老年人和体弱者尤为如此。家庭测试受挫于医疗仪器的复杂性、使用的困难、成本以及 普通人难以获得。在创造和提供可以在实验室外提供实验室质量测试的系统、设备和方法 方面存在一些挑战。
【发明内容】
[0004] 在一些实施方式中，本发明提供了一种设备，包括：a)载玻片，其被配置用于接收 体液，其中所述载玻片包括：i)第一腔室，其中所述第一腔室包含能够检测所述体液中的 第一分析物的第一试剂；以及ii)第二腔室，其中所述第二腔室包含能够检测所述体液中 的第二分析物的第二试剂；以及b)成像系统，其被配置用于从所述载玻片获取可视数据。
[0005] 在一些实施方式中，本发明提供了一种设备，包括：a)载玻片，其被配置用于接收 体液；b)成像系统，其被配置用于从所述载玻片获取可视数据；以及c)发射器，其中所述发 射器在至少一英里的距离上无线传输所获取的可视数据。
[0006] 在一些实施方式中，本发明提供了一种用于分析体液的方法，所述方法包括：a) 将所述体液提供至载玻片，其中所述载玻片包括第一腔室和第二腔室；b)在所述第一腔室 中使用第一试剂检测所述体液中的第一分析物；c)在所述第二腔室中使用第二试剂检测 所述体液中的第二分析物；d)通过成像系统从所述载玻片获取可视数据；e)将所述可视数 据转换成至少一个图像，其中所述转换通过包括处理器的计算机系统来进行；以及f)通过 处理器计数所述图像中的至少一种分析物。
[0007] 在一些实施方式中，本发明提供了一种系统，包括：a) -种设备，其包括：i)载玻 片，其被配置用于接收体液；ii)成像系统，其被配置用于从所述载玻片获取可视数据；以 及iii)发射器，其中所述发射器无线传输所获取的可视数据；以及b)接收器，其接收从所 述发射器无线传输的可视数据，其中所述发射器和所述接收器被配置用于在至少1英里的 距离上通信。
[0008] 在一些实施方式中，本发明提供了一种套件，包括：a) -种设备，其包括：i)载玻 片，其被配置用于接收体液，其中所述载玻片包括第一腔室和第二腔室；以及ii)成像系 统，其被配置用于从所述载玻片获取可视数据；b)第一试剂，其能够检测所述体液中的第 一细胞类型；以及c)第二试剂，其能够检测所述体液中的第二细胞类型。
【附图说明】
[0009] 图1图示了用于分析体液的系统。
[0010] 图2图示了用于分析体液的载玻片。分图A图示了与载玻片中的腔室连接的通道。 分图B图示了包括对照腔室的载玻片。分图C图示了包括用于体液分析的多个腔室的载玻 片。
[0011] 图3是用于分析体液的系统的示图。
[0012] 图4图示了用于分析体液的系统，该系统具有可移动载玻片和可移动滤光器组装 件。分图A图示了如何能够相对于成像系统定位载玻片。分图B和分图C图示了能够使可 移动滤光器组装件移动的方式。
[0013] 图5的分图A是用于计数血液样品中的白细胞并确定其类型的过程的流程图。分 图B是基于荧光而图示出血液样品中的不同类型的白细胞的示图。
[0014] 图6是用于计数血液样品中的红细胞的数目的过程的流程图。
[0015] 图7不出了用于分析体液的系统和设备的框图。
[0016] 图8的分图A图示了所使用的体液采集和分析载玻片的俯视图。分图B图示了手 指托架和躯体采集器。分图C图示了包括本发明的成像系统和载玻片/腔室的外壳。
[0017] 图9是适用于血液样品分析的、用于体液分析的自动化系统的示意图。分图A图 示了样品制备。分图B图示了成像系统。分图C图示了自动化血细胞计数分析。
[0018] 图10图示了使用成像系统获得的可视数据。分图A图示了白细胞（white blood cell)的合并的荧光图像。分图B图示了由来自分图A的阈值关注区域形成的计数蒙片 (count mask)。分图C是白细胞视觉图像中每个物体的荧光强度的散点图。分图D是分图 C中的数据的直方图。分图E是分图D的分图的俯视图，其中已经用3个二维高斯曲面拟合 了表面。分图F是图示用于血小板分析的总变差去噪荧光图像的视觉图像。分图G是图示 从分图F中的图像确定的血小板总数的图表。分图H是红细胞的暗场视觉图像。分图I是 模板匹配结果与分图H的插图的叠加图。
[0019] 图11图示了基于图像确定的全血细胞计数（CBC)参数与来自自动化血细胞分析 仪的临床结果的对比。分图A是图示红细胞的视觉图像分析与临床值的图表。分图B是图 示标绘出所述两种方法的红细胞平均值的、这两种方法之间的差异的图表。分图C是图示 血小板的视觉图像分析与临床值的图表。分图D是图示标绘出所述两种方法的血小板平均 值的、这两种方法之间的差异的图表。分图E是图示白细胞的视觉图像分析与临床值的图 表。分图F是图示标绘出所述两种方法的白细胞平均值的、这两种方法之间的差异的图表。 分图G是图示粒细胞的视觉图像分析与临床值的图表。分图H是图示标绘出所述两种方法 的粒细胞平均值的、这两种方法之间的差异的图表。分图I是图示淋巴细胞的视觉图像分 析与临床值的图表。分图J是图示标绘出所述两种方法的淋巴细胞平均值的、这两种方法 之间的差异的图表。分图K是图示单核细胞的视觉图像分析与临床值的图表。分图L是图 示标绘出所述两种方法的单核细胞平均值的、这两种方法之间的差异的图表。
[0020] 图12是图示可与本发明的示例实施方式相结合使用的计算机系统的第一示例架 构的框图。
[0021] 图13是图示可与本发明的示例实施方式相结合使用的计算机网络的示图。
[0022] 图14是图示可与本发明的示例实施方式相结合使用的计算机系统的第二示例架 构的框图。
【具体实施方式】
[0023] 全血细胞计数（CBC)是最常见的实验室测试之一，而血细胞计数对于许多病症而 言可能是重要的疾病第一指标。CBC提供了关于红血球（红细胞（RBC))、白血球（白细胞 (WBC))和血小板等血液的细胞部分的信息。某些细胞类型的异常高或异常低的计数可指示 出许多形式的疾病的存在。因此，由于血细胞计数可以提供受试者的健康状态概况和对治 疗的反应，因而其成为医学上最常进行的测试之一。
[0024] 获取全血细胞计数一般需要访问抽取和分析血液的诊所。这种做法给患者带来了 不便，特别是在患者是老年人、无行动能力者或者居住在不易获得临床服务的偏远地区的 情况下尤为如此。例如，生活在农村地区的患者可能需要定期行走过远的距离去获得常规 测定。这种不便不仅令患者不满，而且还产生了阻挠患者依从性的风险。将血细胞计数仪 器移到家里是一种具有挑战性的解决问题的方式，这是因为仪器往往大而笨重，昂贵，并且 对于没有临床经验的人不直观。
[0025] CBC数据可能不仅包括关于所述三种细胞类型的数目的信息，而且还可包括关于 红细胞和白细胞的群体和亚群的大小和形状的信息。CBC允许临床医师得到关于患者的重 要信息。CBC数据本身，或者辅以临床数据或其他实验室数据，对于构建患者的鉴别诊断可 能十分关键。通过获取血细胞计数信息并将结果与参照、标准或用健康组织获取的结果作 比较有可能作出诊断。具体而言，CBC可以给出关于低RBC(贫血症）、高RBC(红细胞增多 症）、低WBC (白细胞减少症）、高WBC (白细胞增多症）、低血小板（血小板减少症）、高血小 板（血小板增多症）的临床信息，以及关于不同白血球类型的低计数和高计数的数据。CBC 因此可以是在形成临床诊断、筛查患者健康的变化以及监测疾病进展或治疗等方面的重要 出发点。当前，CBC最常通过访问诊所来进行。抽血者通过将血液抽入试管来采集血液样 品，所述试管通常含有用于防止采集到的血液凝结的抗凝剂。血液样品继而被运送至实验 室以供分析。或者，可以使用"手指针刺"（诸如在糖尿病测试中常用的手指针刺）抽出血 液样品。对血液样品的分析可以人工进行或在自动化分析仪中进行。
[0026] 当前，大多数的血液样品由自动化血细胞分析仪进行自动分析。对于这样的自动 分析，首先充分混合血液样品，通常与抗凝剂混合，并将其放置在分析仪中的机架上。这些 分析仪取几百微升制备的血液并将其与流体系统中的若干种试剂相结合。继而使制备的细 胞穿过一个或多个激光束，并且经常穿过小的带电孔隙。分析仪使用荧光信号、光散射信号 和阻抗变化（库尔特效应（Coulter effect))的组合来检测和计数血小板、红细胞和白细 胞。这些分析仪分析红细胞的大小并确定细胞血红蛋白浓度。这样的分析仪还区分白细胞 的亚群（对于五分类计数（5-part differential count)，将之分为中性粒细胞、淋巴细胞、 单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞）。这些分析仪提供了对血液参数的快速而准确的 测量；然而，这些仪器需要特殊试剂（经常是专属试剂），并且包含精密的光电倍增管和流 动通道。自动化血细胞分析仪笨重、昂贵并且技术复杂，所有这些因素限制了使用自动化血 细胞分析仪的可得性和便利性。此外，自动化分析仪通常不能正确地鉴别血液中的某些异 常细胞。在这些情况下，需要人工检查样品的视野来鉴别仪器所无法分类的任何异常细胞。
[0027] 用于提供全血细胞计数的替代方法可以依靠例如在血细胞计数器上对样品的人 工计数。人工CBC通常通过在显微镜下观察用受试者血液的样品制备的载玻片（血膜或外 周涂片）来进行。可以使用容纳指定体积的稀释血液（因为如果其未被稀释，则其中存在 太多的细胞）的计数腔室来计算每升或每微升血液中红细胞和白细胞的数目。为了鉴别不 同白细胞的数目，可以制作血膜，并且可以计数大量的白细胞（例如，至少100个）。该计数 给出了特定类型（例如，粒细胞和单核细胞）的白细胞的百分比。通过将该百分比乘以白 细胞总数，可以获得每种类型的白细胞的绝对数目。人工计数方法经常费力地手动进行，其 中技师在显微镜下人工地检查染色的细胞。因此，对样品中的血细胞的人工计数增大了分 析的错误率和成本。
[0028] 以及时的方式获得血细胞计数测试对于许多经受治疗的受试者或者对于监测其 健康而言至关重要。例如，大多数化疗药物通常每21天施用一次，并且可能导致骨髓抑制、 红细胞抑制、白细胞抑制以及血小板抑制。骨髓抑制通常遵循在受试者的循环血细胞中的 21天周期性下降和恢复。在循环中，白细胞和血小板存活约10天，而红细胞存活约120天。 在循环之后约10天，白细胞和血小板的数目通常处于其最低点或"最底点（nadir)"。如果 最底点过低并且患者在那时发烧，则患者被认为患有"发热性中性粒细胞减少"并将通常需 要积极的静脉注射（IV)抗生素 一一通常在住院条件期间施用。尽管对接受这样的骨髓抑 制性药物的受试者体内的红细胞、白细胞和血小板计数的监测至关重要，但该受试者可能 难以定期访问诊所来提供血液样品。本文的发明满足了对于开发可以方便地实现从受试者 的体液提供准确、高性价比和高效的血细胞计数的系统、设备和方法的巨大需求。
[0029] 本文描述了公开对允许准确分析体液的，用于样品制备、测量和分析的方法的开 发的系统、设备和方法。在一些实施方式中，本发明提供了用于通过使用以下各项来计数红 细胞、血小板和白细胞亚群的新颖而简单的方法：（i)亚微升体积的血液，（ii)单步试剂， 以及（iii)大视野、低放大倍数成像。本发明使样品制备和操作所需步骤的数目减至最小， 并提供了允许从小体积的样品确定全血细胞计数的简单实用的方法。样品可以是唾液样 品，或者是通过手指针刺获得的较小血液样品（图1)。针对血细胞计数而使用非常少量的 血液不仅减小了所述方法对受试者造成的不适，而且还使整个过程更简单、更方便和更高 效。
[0030] 本发明的设备和系统小巧便携，从而允许在多种地点分析样品。在一些实施方式 中，本发明允许在无需受试者访问诊所或实验室的情况下监测受试者。例如，本发明的设备 的便携性特质允许受试者在不离开其住所或办公室的情况下提供样品并获得全血细胞计 数。在一些实施方式中，本发明允许由受试者的医生对身处住所的受试者进行健康监测。
[0031] 本发明降低了在基于流的设备中进行分析所需的样品制备和操作的复杂度。本 发明的套件、系统和设备包括被配置用于分析体液的载玻片和腔室。这样的载玻片和腔室 可以预包装有或者不预包装有能够检测和鉴别体液中的分析物或细胞类型的一系列试剂。 在一些实施方式中，将能够检测分析物或细胞类型的试剂预包装在本发明的载玻片或腔室 内。试剂在载玻片内的预包装可以提供单步处理步骤，这降低了样品制备的复杂度。在一些 实施方式中，不将能够检测分析物或细胞类型的试剂预包装在本发明的载玻片或腔室内。 可以提供试剂作为"备料"，其可以容易地与体液相结合和添加至本发明的腔室。本发明的 载玻片和腔室可以用于通过成像系统对血液样品进行即时分析，或者它们可被储存和递交 以供例如由病理学家稍后检查。
[0032] 成像系统可被配置用于获取载玻片中的一个腔室内或多个腔室内的体液的视觉 图像。成像系统可显著地比流动系统更小、更便携和更坚固。本发明可以利用高质量的、廉 价的相机传感器从载玻片或腔室获取高质量的可视数据。本发明的系统可被配置用于提供 对所获取的视觉图像的分析。可以使用廉价的仪器来记录大视野的图像。在一些实施方 式中，可以使用与无透镜全息重建或稀疏重建技术相结合的蜂窝电话图像传感器，以接近 常规显微镜物镜的分辨率的分辨率，在亮场和荧光模式下对大区域进行成像。例如，可以在 17mm3成像体积上以亚微米精度追踪细胞，从而凸显出使用廉价的仪器进行的测量的质量。 可以使用消费级相机传感器，以24_2视野和600nm分辨率记录图像。在一些实施方式中， 传感器可以是一次性的。
[0033] 本发明的系统提供了自动化血液学分析的效率与基于图像的传统细胞学检查的 效能。本发明的系统允许对培养腔室内的细胞进行成像，并且提供对该腔室内的细胞类型 的分析。在一些实施方式中，本发明的系统、设备和方法将低分辨率图像的获取和分析与专 门设计的数据分析方法相结合，所述数据分析方法提供对红细胞、白细胞和血小板的准确 计数，并且给出对白细胞的准确的三分类。在一些实施方式中，本发明包括提供处于利用临 床仪器所达到的置信区间内的全血细胞计数的套件、系统、设备和方法。 设备和系统
[0034] 关于全血细胞计数分析的异常结果可指示出多种健康状况，包括感染、器官移植 排异、心脏疾病、自身免疫疾病、白血病、贫血、炎症和癌症。本发明提供了可以用于以简单、 准确而廉价的方式分析受试者的体液的设备和系统。体液的非限制性示例包括血液、全血、 血清、血浆、唾液、尿液、乳汁、粘液和痰。
[0035] 图1图示了用于进行对诸如血液或唾液样品等体液进行分析的设备和系统10。系 统10图示了体液采集和固定载玻片100以及自动化便携式载玻片分析仪150。载玻片100 被配置用于接收体液，例如，来自从受试者