基于抗黄曲霉毒素纳米抗体的亲和吸附材料的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基于单域重链抗体（又称纳米抗体技术）的免疫亲和吸附材料， 特别是针对黄曲霉毒素的免疫亲和吸附材料。 技术背景
[0002] 黄曲霉毒素是一类主要由黄曲霉菌、寄生曲霉菌等真菌产生的剧毒次级代谢 产物。它们的化学结构类似，为二呋喃香豆素衍生物，主要包括黄曲霉毒素^仏?8 1)、 B2(AFB2) 々(AFGi)、G2(AFGi)等。在天然污染的食品和饲料中，AFBi的污染最为常 见，其毒性和致癌性也最强，被世界卫生组织的癌症研究机构划定为I类致癌物。世界各国 及地区指定了严格的黄曲霉毒素限量标准，例如欧盟婴幼儿食品中AFBi允许量<0. 10μg/ kg〇
[0003] 现有的黄曲霉毒素检测方法主要有仪器分析法、免疫分析法以及薄层层析法。其 中仪器分析法具有灵敏度高、准确性和重复性好等优点，但是对于分析样品前处理要求较 高，需要尽量去除样品中的杂质以减少对后续检测的干扰。传统的前处理方法有液相萃取、 固相萃取等，处理过程繁琐且特异性不高。亲和层析技术基于配基与待测物质之间特异性 的识别，可通过一步操作实现对复杂混合样品中待测物的分离纯化。目前使用的黄曲霉毒 素亲和纯化介质一般采用多克隆抗体或单克隆抗体作为配基，存在不耐有机试剂、活性迅 速降低的问题。因此，需要开发活性高、稳定性好的新型配基替换传统抗体。单域重链抗体 是由羊驼重链抗体的可变区组成，又称为纳米抗体，具有耐酸碱、耐高温以及易于生产等特 性，相较于传统抗体具有明显的优势。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种针对黄曲霉毒素的免疫亲和吸附材料及其应用。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0006] 针对黄曲霉毒素的免疫亲和吸附材料包括载体和配基，所述配基为单域重链抗 体，具有SEQIDNO. :1、SEQIDNO. :3、SEQIDNO. :5、SEQIDNO. :7、SEQIDNO. :9、SEQ IDNO. :11、SEQIDNO. :13所示的氨基酸序列。该配基可特异性识别黄曲霉毒素。
[0007] 所述配基还可以为在前述序列的单域重链抗体基础上通过随机或定点突变技术 进行改造所获得的能与黄曲霉毒素特异性结合的抗体。
[0008] 所述载体为磁珠、琼脂糖凝胶微球、硅胶微球或多孔材料。
[0009] 上述黄曲霉毒素免疫亲和吸附材料的制备方法，其特征为：
[0010] 所述载体为磁珠时，制备方法为：取lmg羧基磁珠于离心管中，加入500~ 1000μ1活化缓冲液（10mM，NaH2P04,pH6. 0)，涡旋混合均匀，磁力架回收磁珠，再用活化缓 冲液洗涤2遍。分别加入1~5mg碳二亚胺（EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)，涡旋混合 后，静置30min。用偶联缓冲液（10mM，Na2HP04,pH7. 4)洗涤磁珠3遍，加入抗黄曲霉毒素 单域重链抗体，室温反应2~6h，得到共价偶联了抗黄曲霉毒素单域重链抗体的免疫磁珠；
[0011] 所述载体为琼脂糖凝胶微球时，制备方法为：将CNBr活化的干胶用0. 1MHC1洗涤 10~15次，每次平衡5~lOmin。用偶联缓冲液（10mM，Na2HP04,pH7. 4)洗涤5~15次， 加入抗黄曲霉毒素单域重链抗体，室温反应2~10h，得到共价偶联了抗黄曲霉毒素单域重 链抗体的免疫亲和吸附材料；
[0012] 所述载体为硅胶微球时，制备方法为：将硅胶微球用纯水和磷酸缓冲液（PBS， 10mM，pH6. 0)交替洗涤5~10次，用PBS缓冲液悬浮硅胶微球，加入抗黄曲霉毒素单域 重链抗体，混勾，加入终浓度1~l〇mg/ml的碳二亚胺（EDC)，迅速混勾，4°C搅拌反应12~ 24h，得到共价偶联了抗黄曲霉毒素单域重链抗体的免疫亲和吸附材料。
[0013] 将上述免疫亲和吸附材料（载体为琼脂糖凝胶微球和硅胶微球）装填至层析柱， 即得到黄曲霉毒素免疫亲和层析柱，方法为：根据层析柱容量，取适量上述免疫亲和吸附材 料于层析柱，加入5~10倍柱床体积的PBS(10mM，pH7. 4)洗涤后，4°C，保存于20%乙醇 溶液。
[0014] 共价偶联了抗黄曲霉毒素单域重链抗体的免疫磁珠无需装柱，直接吸附后磁铁分 离。
[0015] 本发明还涉及装载有所述黄曲霉毒素免疫亲和吸附材料的亲和层析柱。
[0016] 上述黄曲霉毒素免疫亲和吸附材料的应用，用所述黄曲霉毒素免疫亲和吸附材料 对样品提取液进行净化，富集黄曲霉毒素（AFBpAFB2、AFGiSAFG2)。黄曲霉毒素免疫亲和 吸附材料在去除黄曲霉毒素、净化黄曲霉毒素污染物料中的应用。这种处理不以疾病诊断 治疗为目的。当免疫吸附材料的载体为琼脂糖凝胶微球和硅胶微球时，方法为：首先用纯水 清洗免疫吸附材料，加入样品提取液，然后用纯水淋洗，再用甲醇洗脱特异性吸附的黄曲霉 毒素，收集的洗脱液，即为净化和富集后的样品提取液，可用于后续分析检测。当载体为磁 珠时，方法为：将免疫磁珠加入纯水中，磁力架回收磁珠，重复清洗3~5次，然后将免疫磁 珠加入样品提取液中，混匀，磁力架回收磁珠，纯水清洗1~3次后，甲醇洗脱特异性吸附的 黄曲霉毒素，收集的洗脱液，即为净化和富集后的样品提取液，可用于后续分析检测。
[0017] 本发明针对黄曲霉毒素的免疫亲和吸附材料配基为单域重链抗体，具有SEQID NO. :1所示的氨基酸序列，该配基可特异性识别黄曲霉毒素。该单域重链抗体容易获得，可 以通过生物学方法大量培养生产配基为单域重链抗体，避免了人工抗体等繁琐生产方法， 大大降低了生产成本。生产过程无需接触黄曲霉毒素，避免了对生产人员身体伤害。具有 耐酸碱、耐高温以及易于生产等特性，这些特性对于黄曲霉毒素的低成本、可重复使用的免 疫学检测方法有重要的实用价值。
【具体实施方式】
[0018] 下面通过黄曲霉毒素免疫亲和吸附材料的制备及应用，对本发明做进一步说明， 这些具体实施例不应以任何方式被解释为限制本发明的应用范围。
[0019] 实施例1 :
[0020] 抗黄曲霉毒素单域重链抗体（即针对黄曲霉毒素的单域重链抗体）免疫文库的构 建
[0021] 将黄曲霉毒素队与匙孔血蓝蛋白（keyholelimpethemocyanin，KLH)共价偶联， 得到黄曲霉毒素人工抗原AFBfKLH，取300μgAFBfKLH与弗氏完全佐剂乳化后，对羊驼 (Lamapacos)进行皮下多点注射免疫。加强免疫采用150μgAFBfKLH与弗氏不完全佐剂 乳化，间隔2周进行，每次免疫7天后静脉取血，采用间接ELISA法测定血清效价，选择血清 效价最高的样品分离淋巴细胞，提取RNA。
[0022]RNA的提取参照TAKARA公司RNAiso试剂说明书进行。以RNA为模板，oligodT 为引物，参照TAKARA公司反转录酶说明书合成cDNA第一链。
[0023] 采用PrimeSTAR高保真DNA聚合酶，经巢式PCR获得重链抗体的可变区编码基因 (采用的引物见表1)。第一轮PCR分别以引物AlpVh-LD和CH2-R扩增cDNA，反应条件为， 98Γ，10s，55Γ，20s，72Γ，lmin，20 个循环，98Γ，10s，68Γ，lmin，72Γ延伸lOmin。
[0024] 将第一轮PCR产物用1. 2 %的琼脂糖凝胶电泳，回收600bp~750bp的DNA片 段，作为第二轮PCR的模板，分别用引物AlpVh-Sfil和AlpVHHRl-Notl，AlpVh-Sfil和 八1口￥冊1?2-如《，进行扩增，反应条件为，98°(：，1〇8,50°(：，2〇8,72°(：，4〇8,5个循环，98°(：， 108,68°(：，408,30个循环，72°(：延伸101^11。经0嫩片段回收试剂盒回收、定量，于-20°(：保 存备用。将噬菌粒PHEN1和PCR扩增产物分别用SfiI、NotI双酶切，经琼脂糖凝胶回收、 定量后，以1 : 3摩尔比，在16°C，过夜连接。
[0025] 表1文库构建及鉴定所用的引物
[0028] 注：下划线表示限制性内切酶识别序列
[0029] 连接产物经乙醇沉淀后，溶于10μL无菌水，分十次进行电穿孔转化大肠杆菌 TG1。取10μL电击、培养后的菌液倍比稀释，涂布氨苄青霉素2ΧΥΤ培养板，37°C，倒置 培养12~16h，采用引物M13-R和pHEN-R进行菌落PCR，计算库容；其余部分全部涂布于 24cmX24cm氨苄青霉素2XYT培养板，37°C，倒置培养12~16h。用10mL，2XYT培养基将 培养板上的菌苔刮洗后，加入终浓度15~30%甘油，分装，-80°C保存备用。
[0030] 根据计算的库容量结果，接种10倍库容量的活细胞于20mL的2XYT(含2%葡萄 糖，l〇〇yg/mL氨苄青霉素），30°C，220r/min培养至0D600达0. 5,按感染复数20 : 1加入 辅助噬菌体，37°(：，22(^/11^11，6〇1^11。将培养物离心，用5〇1^的2\￥1'(含10(^8/1^氨苄 青霉素和50μg/mL卡那霉素）重悬沉淀，30°C，220r/min过夜培养后，3000g离心取上清， 加入5XPEG/NaCl溶液，冰上放置lh或4°C过夜，12000rpm离心30min，重悬沉淀于含10% 甘油的磷酸缓冲液（PBS，0.01M，pH7. 4)，即得到抗黄曲霉毒素单域重链抗体免疫文库，取 10μL测定滴度，其余分装于-80°C保存备用。
[0031] 实施例2:
[0032] 抗黄曲霉毒素单域重链抗体的淘选与鉴定
[0033] 采用固相亲和淘选的方法从实施例1所得抗黄曲霉毒素单域重链抗体免疫文库 文库中淘选针对黄曲霉毒素的单域重链抗体。将AFBi与卵清白蛋白（albumin，OVA)共价 偶联，得到人工抗原AFB「0VA。每孔加入100μL用PBS稀释的人工抗原AFB「0VA，4°C，包 被过夜，每轮淘选的包被浓度分别为100, 75, 50μg/mL;吸出包被液，PBS洗板3次，每孔加 入300yL3%BSA-PBS，37°C，封闭2h;PBS洗板6次，加入100yL噬菌体抗体文库（约含 2X10nCFU)，37°C，孵育1. 5h;吸出未结合的噬菌体，用PBST(含0. 5%Tween-20)洗板5次 (逐轮增加5次），再用PBS洗板1