一种高载量琼脂糖层析介质及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体地说是涉及一种高载量琼脂糖层析介质及其制备 方法，及其在纯化蛋白和其他生物大分子纯化领域的应用。
【背景技术】
[0002] 蛋白分离纯化是蛋白质科学与产品工程领域的关键因素之一，在来源复杂、结构 与性质各异的蛋白质及相关生物活性物质领域，如何实现高效分离纯化是研究者们一直致 力解决的问题。层析介质是层析技术的最基本组成部分，其结构与性质是影响蛋白最终分 离纯化效果最关键的因素之一。随着基因工程蛋白学、蛋白质工程学、疫苗工程学等学科及 其应用领域的不断发展，大规模高效蛋白分离纯化对高通量层析技术提出了更高的要求， 介质需要具有更高的载量，即在相同甚至更少的用量下分离纯化更多的目标蛋白。
[0003] 以金属螯合层析为例。金属螯合层析又称为固定化金属离子亲和层析，是20世纪 70年代中期发展起来的一种层析方法。其分离原理主要是根据蛋白质表面的组氨酸、色氨 酸、半胱氨酸等，能与Ni2+、Cu2+和C 〇2+等金属离子特异性地发生相互作用，从而对蛋白实 现良好分离（如文献 1 :Kara A，0sman B，Yavuz H，et al. Immobilization of-Amylase on Cu2+Chelated Poly(ethylene glycol dimethacrylate n-vinyl imidazole)Matrix via Adsorption[J] .React.Funct.Polym. ,2005,62(1) :61 68)。金属螯合层析具有选择性高、 介质容量大、通用性好、分离条件温和等特点，已成为蛋白纯化特别是重组蛋白纯化领域最 有效的技术之一。例如，利用基因工程技术将组氨酸标签与目标蛋白融合表达，通过一步金 属螯合层析，即可获得纯度很高的重组目标蛋白（如文献2:Guti6rrez R，Del Valle E Μ Μ,Ga1 an Μ A.Characterization of Mass Transport Processes in IMAC Chromatography by Dynamics Methods[J].Biochem.Eng.J.,2007,35(3):264 272)〇
[0004] 金属螯合层析介质一般由基质、螯合基团和金属离子三部分组成。琼脂糖具有良 好的亲水性、多孔性、大量可供衍生的羟基、稳定性、非特异性吸附低等特点，是目前应用 最为广泛的用于制备层析介质的基质。琼脂糖基质经过活化后，与亚氨基二乙酸（IDA)、氮 基三乙酸(NTA)或羧甲基天冬氨酸(CM-ASP)等螯合剂反应，再螯合金属离子，制备得到金属 螯合介质。除了蛋白种类外，金属螯合介质的载量主要与介质自身结构，特别是与金属离子 密度和蛋白可及面积这两个参数密切相关。金属螯合层析介质是影响金属螯合层析效果的 关键材料，其性能特别是载量、强度等都直接影响最终纯化效果。其中，采用高载量的介质 显著能够提升纯化过程的处理能力，降低介质使用成本，缩短处理时间，从而大大提高纯化 效率。
[0005] 在介质上引入葡聚糖是提高其载量的一种重要方法（如文献3:Lenh〇ff A M.Protein Adsorption and Transport in Polymer-functionalized Ion-exchangers [J] · J · Chromatogr · A，2011，1218 (49): 8748 8759)。文献发现，在强阳离子介质制备过程中 引入葡聚糖后，介质的静态吸附量和动态吸附量分别提升了54-78%和150-188% (如文献 4：Shi Q H,Jia G D,Sun Y.Dextran-grafted Cation Exchanger Based on Superporous Agarose Gel :Adsorption Isotherms,Uptake Kinetics and Dynamic Protein Adsorption Performance!! J] · J. Chromatogr. A, 2010,1217(31): 5084 5091)。我们将这种 方法引入金属螯合层析介质的制备过程，结果发现，所制备介质对组氨酸标记乳酸脱氢酶 的载量较商品介质提升了 26.6%。但是，我们同时发现，经该方法引入的葡聚糖呈均相分布 于整个介质中，整个接枝过程在增加介质与蛋白结合位点以提高其载量的同时，也在一定 程度上对介质内部孔道有堵塞作用，这种堵塞阻碍了蛋白进入介质内部，对进一步提高介 质载量产生不利影响(如文献5:张静飞，赵岚，黄永东，张志刚，马光辉，苏志国.葡聚糖接枝 型高载量金属螯合介质的制备与性能.过程工程学报[J]，2015,15(1): 111-118)。前人通过 制备壳/核结构、并只在壳层接枝葡聚糖并偶联配基的方法提高介质载量(如文献6:A ·阿 克森，J ·伯格斯特伦，G ·格拉德，B · -L ·约翰逊，N ·诺尔曼.分离基质，CN 101765458 A)。如何在葡聚糖接枝过程中，既发挥引入葡聚糖对介质载量的提升作用，又避免其因堵塞 孔道而阻碍蛋白进入的现象。基于此，急需提出新的葡聚糖接枝方法，以制备高载量层析介 质。
[0006] 有鉴于上述的缺陷，本设计人，积极加以研究创新，以期创设一种高载量琼脂糖 层析介质及其制备方法，使其更具有产业上的利用价值。
[0007] 有鉴于上述的缺陷，本设计人，积极加以研究创新，以期创设以期创设一种高载量 琼脂糖层析介质及其制备方法，使其更具有产业上的利用价值。
【发明内容】
[0008] 基于上述考虑，本发明的目的是提供一种高载量琼脂糖层析介质及其制备方法， 通过线性葡聚糖的引入和调控，使之在保持葡聚糖对蛋白结合位点产生促进作用的同时， 避免其对孔道的堵塞作用，从而最大程度地提升了介质载量。以金属螯合层析介质为例，采 用该方法所制备介质对组氨酸标记乳酸脱氢酶的载量是市售商品介质的2.5倍左右。本发 明采取以下思路:首先，采用异双官能团活化剂对琼脂糖基质进行活化;其次，向活化基质 引入葡聚糖，通过控制活化程度，有效调控葡聚糖在基质内的接入程度，形成键合了葡聚糖 的壳层和不含葡聚糖的内核的复合结构;再次，以这种壳/核复合型琼脂糖微球为基质，继 续衍生，配基包括金属离子、疏水配基、离子交换基团和蛋白等，最终制备得到高载量琼脂 糖层析介质。以金属螯合介质为例，继续活化这种壳/核复合型琼脂糖基质，并依次与螯合 剂反应、螯合金属离子，最终制备得到高载量金属螯合介质。
[0009] 本发明是通过以下技术方案实现的。
[0010]本发明提供一种高载量琼脂糖层析介质，其结构式如图1所示。该介质是以琼脂糖 为基质的一种壳/核复合型结构，其中壳层经化学键合了葡聚糖，内核不含葡聚糖。介质的 壳层和内核均螯合了配基，壳层和内核这两部分的配基密度差异化。
[0011] 本发明提供一种上述高载量琼脂糖层析介质的制备方法，包括以下步骤：
[0012] S1:采用一端活性一端惰性的异双官能团活化剂活化琼脂糖基质，使琼脂糖基质 上连有惰性基团。
[0013] S2:活化该惰性基团，通过调控惰性基团的活化程度，调控葡聚糖的接入程度，形 成壳层厚度和内核大小均可控的复合结构。
[0014] S3:以这种连有葡聚糖的壳/核复合结构为基质，继续衍生反应，制备高载量层析 介质。以金属螯合介质为例，继续活化这种连有葡聚糖的壳/核复合结构，再依次与螯合剂 反应、螯合金属离子，制备金属螯合介质。
[0015] 进一步的，所述步骤S1中，所述琼脂糖基质，其琼脂糖浓度范围2 % -15 %。
[0016] 进一步的，所述步骤S1中，所述琼脂糖基质可以是交联基质，也可以是未交联基 质。
[0017] 进一步的，所述步骤S1中，所述异双官能团活化剂系含稀丙基化合物，所述含稀丙 基化合物为烯丙基缩水甘油醚和烯丙基溴中的一种或混合物。
[0018] 进一步的，所述步骤S2中，所述调控葡聚糖的接入含量范围0. l-600mg/ml [0019] 进一步的，所述步骤S2中，所述复合结构分子量范围2kDa-150kDa。
[0020]进一步的，所述步骤S3中，所述螯合剂选自亚氨基二乙酸、羧甲基天冬氨酸、氮基 三乙酸中的一种。
[0021 ] 进一步的，所述步骤S3中，所述金属离子选自附2+、(]112+、&32+、？62+的一种。
[0022] 进一步的，所述步骤S3中，除金属离子外，还可以是离子交换基团、疏水基团、蛋白 等。
[0023] 借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
[0024] (1)通过在介质制备过程中引入葡聚糖，大大增加了介质可结合蛋白的位点数目， 介质结合蛋白的能力从而大幅度改善，最终介质对蛋白的载量得到有效提高。
[0025] (2)通过采用