一种治疗银屑病中药制剂的澄清方法
【专利摘要】本发明公开了一种治疗银屑病中药制剂的澄清方法，向料液比为1∶5的治疗银屑病中药制剂水提液中先后加入总体积4％的天然澄清剂B组分和2％的A组分，于60℃水浴，两组分间隔1h，每0.5h搅拌1min，后离心处理，取上清液。本发明采用的澄清除杂方法，不需要任何特殊设备，具有设备投资少、操作工艺简单，克服了传统醇沉除杂法耗醇量大，工艺费时，乙醇回收过程繁琐等缺陷。同时，细胞实验结果表明治疗银屑病中药制剂同未化裁的银屑灵方均有抑制角质形成细胞增殖的作用，药味精简合理，且比化学药物甲氨蝶呤毒性小。
【专利说明】
一种治疗银屑病中药制剂的澄清方法
技术领域
[0001] 本发明涉及治疗银肩病的中药制剂的澄清除杂工艺，属于医药技术领域。
【背景技术】
[0002] 银肩病是一种由多基因遗传决定的、多环境因素刺激诱导的免疫异常性慢性增生 性皮肤病，具有反复发作的特点。银肩病病因与发病机制非常复杂，目前无根治的药物。研 究显示银肩病能显著增加患者心脑血管等重大疾病的发病率，增加患者的心理负担。中医 药在治疗银肩病方面不仅可以有效缓解症状、减少复发率、且毒副作用低、价格适宜、适合 长期使用。
[0003] 银肩灵方是国医大师榻国维教授临床用于治疗银肩病的专用药物（批号：粵 Z20080123)，榻老认为银肩病的发生是由于体质不耐，禀赋不足，外邪侵入肌肤腠理，而致 气血凝滞，营卫失和，经络阻塞，以致瘀毒遏伏肌表，新血难于充养，燥瘀互结，缠绵难愈。治 疗银肩病的中药制剂（银肩灵优化方PS0RI-CM01)是发明人以银肩灵方化裁而来，该药由 土茯苓、赤芍、肿节风、甘草等7味药材组成，具有活血化瘀、凉血消斑、除湿止痒的功效。近 年来发明人通过大量提取生产PS0RI-CM01并对其不同剂型进行临床疗效与基础研究，实 验结果提示：PS0RI-CM01能够抑制角质形成细胞过度增殖（余靖宏，赵瑞芝，卢传坚.银肩 灵优化方对银肩病豚鼠及炎性刺激角质形成细胞增殖的影响[J].中华中医药杂志，2013， 05 =1531-1534.);降低皮损面积和改善皮损严重程度，临床治疗寻常型银肩病获得良效 (LU Chuan-jian，XIANG Yu，XIE Xiu-li, etc. A Randomized Controlled Single-Blind Clinical Trial on 84 Outpatients with Psoriasis Vulgaris by Auricular Therapy Combined with Optimized Yinxieling Formula(PS0RI-CM01)[J]? Chinese Journal of Integrative Medicine, 2012,03 ：186-191.)〇
[0004] 目前在中药颗粒剂、片剂和口服液等多种剂型的水提澄清工艺中广泛使用醇沉 法，它通过增加提取液中醇的含量令提取液中的淀粉、蛋白质、胶质、鞣质等水溶性杂质溶 解度降低，继而以沉淀析出，该方法乙醇消耗大，工艺流程时间长，醇溶解性低的化学成分 损失较多。II型ZTC1+1澄清剂在中草药制剂生产工艺中澄清速度快，保留了更多的有效成 分，降低了成本，缩短了生产时程，其制剂的稳定性优于水提醇沉法，是中草药制备水提醇 沉工艺中乙醇的理想替代品。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种治疗银肩病中药制剂水提液的快速、高效澄清方法，解 决传统醇沉除杂方法所存在的耗醇量大、设备投资高，乙醇回收工序复杂，工艺流程时间长 等问题。
[0006] 为实现以上目的，本发明通过以下技术方案实现：取治疗银肩病的中药制剂常规 煎煮提取，提取液减压浓缩，置于60°C水浴，先加入4%水提液体积的II型ZTC1+1天然澄 清剂B组分，lh后加入2%体积的II型ZTC1+1天然澄清剂A组分，期间每半小时搅拌1分 钟令杂质成分凝聚沉淀，然后在离心机中以4000r/min离心10min，取上清液；所述的II型 ZTC1+1天然澄清剂：它是一种以天然多糖为原料制成的天然高分子物质，由A、B两个组分 组成，A组分为黄褐色可溶性固体粉末或浅褐色液体，主要含淀粉酶，配成1 %的水溶液使 用；B组分为浅黄色可溶性固体粉末或浅褐色液体，主要含淀粉酶的复合酶，用1 %醋酸配 成1 %浓度的溶液使用，先加入的B组分起主絮凝作用，另一 A组分带有相反电荷，起辅助絮 凝作用。
[0007] 所述的II型ZTC1+1天然澄清剂经过以下配制：
[0008] A组分，精密量取1. Og II型ZTC1+1天然澄清剂，加入少量在蒸馏水，搅拌成糊状， 再加入蒸馏水配制至l〇〇mL的粘胶液，溶胀24h，用双层纱布过滤；
[0009] B组分，精密量取1. Og II型ZTC1+1天然澄清剂加入少量体积分数为1 %的醋酸 溶液，搅拌成糊状，再加体积分数为1 %的醋酸溶液配制成l〇〇mL的粘胶液，溶胀24h，用双 层纱布过滤。A组分和B组分按1 : 2体积配比使用，先加入B组分，后加入A组分。
[0010] 作为优选的，所述煎煮3次，前2次每次lh，第3次45min，将煎煮液混合，用纱布 滤过，加去离子水定容，使治疗银肩病中药制剂水提液的料液比为1 : 5。
[0011] 上述澄清方法适用于提取方法相近或相似的治疗银肩病中药制剂的颗粒剂、片剂 或口服液的澄清。
[0012] 本发明采用的方法不需要任何特殊设备和大量乙醇，只需要加入II型ZTC1+1天 然澄清剂，工艺周期短，提高除杂效率，既可降低固形物，同时又保留了有效成分，且安全无 毒，不会引入任何杂质，同时传统醇沉法避免了乙醇回收存放等繁琐工序，该方法稳定合 理，较醇沉法更利于治疗银肩病的中药制剂大量生产的澄清工艺推广。
[0013] 说明书附图
[0014] 图1是绿原酸、异嗪皮啶、落新妇苷和黄杞苷混合对照品330nm波长下色谱图。
[0015] 图2是芍药苷230nm波长下的色谱图。
[0016] 图3是治疗银肩病的中药制剂330nm波长下HPLC色谱图。
[0017] 图4是治疗银肩病的中药制剂230nm波长下HPLC色谱图。
[0018] 图5是阴性样品330nm波长下的HPLC色谱图。
[0019] 图6是阴性样品230nm波长下的HPLC色谱图。
【具体实施方式】
[0020] 一 ?试剂的配制
[0021] 如图1-6所示，本发明一种治疗银肩病中药制剂的澄清方法，取治疗银肩病的中 药制剂常规煎煮提取，提取液减压浓缩，置于60°C水浴，先加入4%水提液体积的II型 ZTC1+1天然澄清剂B组分，lh后加入2%体积的A组分，期间每半小时搅拌1分钟令杂质成 分凝聚沉淀，然后在离心机中以4000r/min离心10min，取上清液。
[0022] 其中，II型ZTC1+1天然澄清剂：
[0023] A组分，精密量取1. 0g II型ZTC1+1天然澄清剂加入少量在蒸馏水，搅拌成糊状， 再加入蒸馏水配制至l〇〇mL的粘胶液，溶胀24h，用双层纱布过滤。
[0024] B组分，精密量取1. 0g II型ZTC1+1天然澄清剂加入少量体积分数为1 %的醋酸 溶液，搅拌成糊状，再加体积分数为1 %的醋酸溶液配制成lOOmL的粘胶液，溶胀24h，用双 层纱布过滤。
[0025] 治疗银肩病的中药制剂水提液的制备：取治疗银肩病的中药制剂组成1剂，加入 1L去离子水，加热煎煮3次，前2次每次1小时，第3次45分钟，将煎煮液混合，用纱布滤 过，减压回收得粗提液，加去离子水定容至每毫升药液含lg原药。同时，去离子水稀释至料 液比为1 : 5，1 : 10，1 : 15备用。
[0026] 对照品溶液的制备精密称取绿原酸、异嗪皮啶、芍药苷、落新妇苷和黄杞苷五种对 照品各2mg，分别加 lmL甲醇配制质量浓度为2mg/mL的母液，再用甲醇稀释成不同浓度倍数 备用。
[0027] 二.高效液相色谱法测定5种化合物含量
[0028] 标准曲线绘制：分别精密吸取上述不同浓度的五种混合对照品溶液，高效液相色 谱仪进样l〇yL，以测得的响应信号（峰面积）和浓度进行线性回归，得到五种标准品的回 归方程。绿原酸Y = 29901 X+5698. 6(R2= 0. 9992)，进样浓度在1.79~115yg/mL范围 内线性良好；芍药苷Y = 17281 X+117236 (R2= 0. 9997)，进样浓度在5. 84~750 y g/mL范 围内线性良好；异嗪皮啶Y = 25094 X+34497 (R2= 0. 9989)，在0. 54~87. 5 y g/mL浓度范 围内线性良好；落新妇苷Y = 5272. 8 X+60778(R2= 0. 9994)，在7. 81~1000 y g/mL浓度 范围内线性良好；黄杞苷Y = 6986. 4 X+37074 (R2= 0. 9992)，在3. 91~500 y g/mL浓度范 围内线性良好。
[0029] 系统试用性试验：分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性供试样品，照高效液相色 谱条件测定，色谱条件和系统适用性和Inertsil 0DS-3色谱柱，流动相见表1，平衡时间 15min，流速0? 8mL/min，柱温24°C，PDA检测器采集范围：190~400nm ;检测波长330nm和 230nm，进样10 y L，记录色谱图。
[0030] 表1流动相梯度洗脱表
[0032] 对上述确定的测定方法进行系统试用性试验及有效性评价，其中包括精密度、重 复性、稳定性等。
[0033] 三.澄清工艺考察
[0034] 采用正交试验设计：以澄清剂加入量、料液比、温度和时间为考察因素，各选取3 个水平（表2)，以L9 (34)正交表（表3)进行试验，以化合物保留率和固形物去除率计算综 合评分，并进行方差分析。
[0035] 表2 L9 (34)正交试验因素水平表
[0036]
[0038] 澄清剂A、B加入顺序：根据说明书，ZTC天然澄清剂主要是根据溶液的性质选择不 同的添加顺序，一般中药复方相对于蛋白质等电点（pH = 4. 8)为酸性环境，添加顺序为先 B后A，B组分用量为A组分2倍。
[0039] 评价指标：分别选取绿原酸含量保留率（XI)、芍药苷含量保留率（X2)、异嗪皮啶 苷含量保留率（X3)、落新妇苷含量保留率（X4)、黄杞苷含量保留率（X5)和固形物去除率 (X6)作为评价指标进行综合评分，将化合物保留率权重定为0. 7,固形物去除率X6权重定 为0. 3,即
[0040] 0D % =(0? 7X1+0. 7X2+0. 7X3+0. 7X4+0. 7X5)/5+0. 3X6。计算公式如下：化合物保 留率=澄清后提取液化合物的含量/提取液中化合物的含量X100%固形物去除率=(澄 清前固形物含量-澄清后固形物含量）/澄清前固形物含量X100%
[0041] 实验结果：由正交试验结果（见表2)的方差分析可以看出，澄清剂加入量及提取 液料液比对综合评分有显著影响，温度和时间对提取液的澄清效果无统计学意义。实验发 现，澄清剂B成分为4%时的治疗银肩病的中药制剂提取液澄效果好，故确定II型ZTC1+1 天然澄清剂澄清治疗银肩病的中药制剂提取液的最佳工艺条件为澄清剂加入量B组分为 4%4组分为2%，料液比为1:5，温度为60°(：，反应时间为111。
[0042] 表3 L9(34)正交试验结果
[0045] 本发明所述治疗银肩病的中药制剂澄清工艺的液相色谱技术检测的质量控制方 法，该方法供试品溶液的制备：取治疗银肩病的中药制剂组成1剂，常规水煎提取（前2次， 每次lh，第3次45min)将煎煮液混合，用纱布滤过，减压回收得粗提液，加去离子水定容至 每毫升药液含lg原药。
[0046] 本发明所述治疗银肩病的中药制剂的澄清工艺，高效液相色谱条件测定，色谱条 件和系统适用性试验方法：Inert Sil 0DS-3色谱柱，流动相梯度见表1，平衡时间15min，流 速0? 8mL/min，柱温24°C，PDA检测器采集范围：190~400nm ;检测波长330nm和230nm，进 样 10 y L。
[0047] 本发明所述的质量控制方法，由于芍药苷的最大吸收波长为230. 2nm，绿原酸、异 嗪皮啶、落新妇苷与黄杞苷的最大吸收波长分别为327. 4nm，342. 9nm，290. 4nm和292. 8nm， 苟药苷在大于290nm处吸收很少，故选择230nm和330nm双波长分别测定苟药苷与绿原酸、 异嗪皮啶、落新妇苷、黄杞苷的含量。
[0048] 四.与醇沉澄清法比较：本发明将正交试验筛选的天然澄清剂澄清法和醇沉澄清 法进行比较，以绿原酸、芍药苷、异嗪皮啶、落新妇苷、黄杞苷五种化合物成分保留率和固形 物去除率为评价指标（表4)，发现：醇沉法虽然杂质去除率高，但活性成分损失多。本发明 采用的方法不需要任何特殊设备和大量乙醇，只需要加入II型ZTC1+1天然澄清剂，用于澄 清治疗银肩病的中药制剂水提液，简单合理，工艺周期短，提高除杂效率，既去除杂质固形 物，同时又保留了有效成分，且安全无毒，不会引入任何杂质，同时避免水提醇沉法乙醇回 收等繁琐工序，该方法稳定合理，易于治疗银肩病的中药制剂大量生产的澄清方法推广。
[0049] 表4澄清剂法与醇沉法对药物成分及杂质的比较
[0050]
[0051] 五.细胞实验
[0052] 银肩病皮损以角质细胞的角化过度和角化不全，真皮炎症细胞浸润，毛细血管增 生为主要特征。银肩病相关药物主要改变其病理状态而起到治疗疾病的作用。本实验目的 以观察治疗银肩病的中药制剂对角质形成细胞（HaCaT)增殖的影响。
[0053] 1 ?实验材料与仪器
[0054] 材料：HaCaT细胞，上海医药工业研究所；银肩灵方组成土茯苓、赤芍、肿节风、甘 草等药材，购自康美药业股份有限公司，经广东省中医院黄志海主任中药师鉴定均符合《中 华人民共和国药典》（2010版）标准；甲氨蝶吟片（MTX)，上海信谊药厂有限公司；MEM培养 基、胎牛血清（FBS)、磷酸盐缓冲盐（PBS)、脂多糖（LPS)，北京鼎国昌盛生物公司；四甲基偶 氮唑盐（MTT)，广州菲博生物公司；青链霉素，广州威佳生物公司。
[0055] 主要仪器：0LYMPUS(XSZ-H)光学显微镜；LXJ-II型离心机；贺利氏C02培养箱； TS300倒置显微镜。
[0056] 2?实验方法
[0057] 药液制备：银肩灵方与治疗银肩病的中药制剂常规水煎提取（前2次，每次lh，第 3次45min)将煎煮液混合，以本发明方法澄清，干燥，真空干燥后取药粉用无血清MEM培养 液配制母液，除菌过滤后，再稀释为250、125、62. 5、31. 25、15. 6 y g/mL共5个浓度。
[0058] 细胞给药：HaCaT细胞孵育传代，取对数生长期HaCaT细胞以2. 0X 104/mL接种于 96孔培养板中，每孔100 y L，24h后加人LPS，每孔浓度15 y g/mL。阳性对照药物用甲氨蝶 呤片，浓度为1 yg/mL。随后加入各浓度药物，设空白对照组，银肩灵组，治疗银肩病的中药 制剂组，LPS对照组和MTX组。
[0059] MTT检测细胞活力：给药48h后，每孔加入20 y L MTT (5mg/mL)，孵育4h，弃上清， 再加人DMS0,每孔100 y L，震荡摇匀lOmin，用免疫分析仪在570nm波长下检测0D值并计算 生长抑制率[生长抑制率（％ ) = (1-实验组0D值/空白组0D值）X 100% ]。
[0060] 3实验结果
[0061] 浓度为250、125、62. 5 y g/mL银肩灵及治疗银肩病的中药制剂对培养48h的HaCaT 细胞抑制率为-5. 4%~32. 7%，各浓度组内有显著差异（P < 0. 01)，银肩灵组及治疗银肩 病的中药制剂组组间差异无统计学意义。甲氨蝶呤在给药48h后抑制率为63. 0%，同银肩 灵及治疗银肩病的中药制剂比较差异均有统计学意义（P < 0. 01)。本实验中甲氨蝶呤细胞 抑制率高于50%，细胞毒性较大。结论：治疗银肩病的中药制剂同银肩灵均有抑制角质形 成细胞增殖的作用，同甲氨蝶呤相比安全剂量范围广且毒性小。
【主权项】
1. 一种治疗银肩病中药制剂的澄清方法，其特征在于：取治疗银肩病的中药制剂常规 煎煮提取，提取液减压浓缩，置于60°c水浴，先加入4%水提液体积的II型ZTC1+1天然澄 清剂B组分，Ih后加入2%体积的II型ZTC1+1天然澄清剂A组分，期间每半小时搅拌1分 钟令杂质成分凝聚沉淀，然后在离心机中以4000r/min离心10min，取上清液；所述的II型 ZTC1+1天然澄清剂：它是一种以天然多糖为原料制成的天然高分子物质，由A、B两个组分 组成，A组分为黄褐色可溶性固体粉末或浅褐色液体，主要含淀粉酶，配成1 %的水溶液使 用；B组分为浅黄色可溶性固体粉末或浅褐色液体，主要含淀粉酶的复合酶，用1 %醋酸配 成1 %浓度的溶液使用，先加入的B组分起主絮凝作用，另一 A组分带有相反电荷，起辅助絮 凝作用。2. 根据权利要求1所述的一种治疗银肩病中药制剂的澄清方法，其特征在于：煎煮3 次，前2次每次lh，第3次45min，将煎煮液混合，用纱布滤过，加去离子水定容，使治疗银肩 病中药制剂水提液的料液比为1 : 5。3. 根据权利要求1所述的一种治疗银肩病中药制剂的澄清方法，其特征适用于提取方 法相近或相似的治疗银肩病中药制剂的颗粒剂、片剂或口服液的澄清。
【文档编号】B01D21/01GK105879432SQ201510031390
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2015年1月18日
【发明人】卢传坚, 王冬梅, 朱伟
【申请人】广东省中医院