生产血小板的射流装置的制造方法

生产血小板的射流装置的制造方法
【专利摘要】本发明涉及用于从巨核细胞或其片段的悬液生产血小板的射流装置，其包含生产室，所述生产室包含至少一个通道，其中引导巨核细胞悬液从其进口流至其出口；其中所述通道在其内表面的至少一部分构造成具有多个障碍物。本发明还涉及用如上定义的射流装置从巨核细胞生产血小板的离体方法。
【专利说明】
生产血小板的射流装置
技术领域
[0001] 本发明设及从巨核细胞或其片段生产血小板的改进方法。
【背景技术】
[0002] 血小板是抑制出血关键的小的无核细胞。存在许多血小板生广或功能雙损的临床 疾病，且需要血小板输液的患者越来越多。目前，解决办法是进行从供血者获得的血小板的 输液。用于治疗学应用的离体血小板生产是吸引人的选择，但仍然是主要的技术挑战。
[0003] 血小板来源于巨核细胞。巨核细胞分化是其特征在于顺序步骤的连续过程。尽管 巨核细胞分化发生于骨髓中，血小板生产要求巨核细胞片段通入骨髓血管。已经尝试设计 尤其致力于血小板生产的生物反应器。
[0004] 国际专利申请W0 2010/06382311公开了从成熟巨核细胞通过使成熟巨核细胞悬 液在涂有血管性血友病因子(VWF)的固相上经历剪切率为至少600S-1的流动而生产血小板 的离体方法。剪切率影响在Dunois-Lard自等的科学论文（"Exposure of human megakaryocytes to high shear rates accelerates platelet production''，Blood, vol. 114,n°9,p. 1875-1883,2009)中进一步讨论。然而，产量仍需要改善，W用于可能的治 疗学应用。
[0005] -些出版物提议使用设计为再生天然骨髓环境的3D系统（参见Pallotta等， "Three-Dimensional System for the In Vitro Study of Megakaryocytes and Functional Platelet Production Using Silk-Based Vascular Tubes",Tissue Engineering:化rt C,vol.17,n。12,p.1223-1232,2011,和Sullenbarger等，"Prolonged continuous in vitro human platelet production using three-dimensional scaffolds" .Experimental Hematology ,vol. 37,n° 1 ,p. 101-110,2009)。在运些系统中，细 胞片段从其中植入细胞的支架通过孔隙或管自由迁移进入流动通道。此外，Nakagawa等 ("Two differential flows in a bioreactor promoted platelet generation from human pluripotent stem cell-derived megakaryocytes".Experimental Hematology, 2013vol.41，n°8p742-748,2013)最近公开了两种新的模拟微血管的用于血小板生产的生 物反应器。它们包含能够捕获巨核细胞的多孔结构或狭缝。施加压力流W确保巨核细胞的 固定。此外，将主流垂直施加于压力流或在压流和主流之间具有60°的角度。所述主流将剪 切应力施加于捕获的巨核细胞。然而，主流仍然不含巨核细胞。巨核细胞片段经历主流且释 放的血小板在主流出口处收集。Thon等（《Platelet bioreactor-on-a-chip》，Blood, vol 124，n°12pl857-1867,2014)描述了基于彼此平行、通过用狭缝刺穿的壁分离的进料通道和 主通道流的另一种生物反应器。当进料通道末端关闭时，巨核细胞被推过狭缝。在那里，它 们与主流接触并经历剪切应力。在运种系统中，巨核细胞可获得的位点数是有限的，且许多 细胞停留在储库中，而最初的巨核细胞伸长并释放血小板。运限制了血小板生产过程的速 度。运些系统的几何形状对于快速大规模的生产效率不高。此外，获得的产量仍不够，运是 使得血小板功能性表征变得困难的事实。此外，在几小时或几天内进行的实验具有很少评 估的内在血小板脱落。
[0006] 已经公开了具有具体结构的微射流装置用于不同的生物学应用。例如，Stott等 ("Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chi护，PNAS，vol. 107，n° 43，p. 18392-18397，2010)描述了使用其内表面涂有 抗体的微射流装置来分离循环肿瘤细胞。内表面中形成凹槽，W便破坏通道内的层流流线， 并增加抗体涂层装置中细胞-表面相互作用的数目。类似地，Chang等（"Biomimetic technique for 曰dhesion-b曰sed collection 曰nd sep曰r曰tion of cells in 曰 microfluidic channel" ,Lab 化ip,vol.5,p.64-73,2005)教导了使用包含微柱阵列的微 射流通道来分离和收集细胞。然而，与本发明相反，运种微射流装置的目的不是引发血小板 从巨核细胞脱落。
[0007] 因此本发明的一个目的是提供用于从包含巨核细胞或其片段的细胞悬液生产血 小板的射流装置，尤其适用于高产量生产，同时保持新产生的血小板的功能质量。本发明的 另一个目的是提供适于大规模生产高质量和标准化的血小板的用于生产血小板的方法。 [000引发明简述
[0009] 在一个方面，本发明设及用于从巨核细胞悬液(5)生产血小板的射流装置（1)，包 含：
[0010] -生产室(3)，包含至少一个通道(8)，其中可W引导包含巨核细胞或其片段的细胞 悬液从其进口（ 9)流至其出口（ 10);
[0011 ]-任选的流速控制器(7)，用于控审幡道(8)中所述悬液的流动；
[0012] -任选的巨核细胞分炼器和/或混合器(2)，用于富集含巨核细胞的悬液并均质化 所述巨核细胞悬液的细胞浓度，其位于生产室(3)的上游；
[0013] -生产室（3)下游的任选的血小板分炼器(4)，用于通过从巨核细胞或其他细胞残 余物分炼血小板来纯化流出悬液(6);
[0014] 其中至少一部分(11)所述通道(8)的壁的内表面构造成具有多个障碍物。
[0015] 在相关方面，本发明设及用于从包含巨核细胞或其片段的细胞悬液生产血小板的 射流装置，包含：
[0016] -生产室（3)，包含通过非多孔壁定界的至少一个通道(8)和在通道的一端的至少 一个进口孔(9)和在通道的另一端的至少一个出口孔（10)，其中可W将包含巨核细胞或其 片段的悬液引入进口孔(9)，和其中可W在出口孔(10)收集血小板；
[0017]-任选的流速控制器(7)，用于控审幡道(8)中所述悬液的流动；
[0018] -任选的巨核细胞分炼器和/或混合器(2)，用于富集含巨核细胞的悬液并均质化 所述巨核细胞悬液的细胞浓度，其位于生产室(3)的上游；
[0019] -生产室（3)下游的任选的血小板分炼器(4)，用于通过从巨核细胞或其他细胞残 余物分炼血小板来纯化流出悬液(6);
[0020] 其中至少一部分(11)所述通道(8)的壁的内表面构造成具有多个障碍物。
[0021] 在具体的实施方式中，所述多个障碍物分布在二维空间表面，从而形成障碍物的 Ξ维阵列。
[0022] 另一方面，本发明设及从巨核细胞或其片段生产血小板的离体方法，所述方法包 含：
[0023] -将包含巨核细胞或其片段的细胞悬液引入如上定义的射流装置；
[0024] -在生产室的通道中使所述悬液在适于巨核细胞的延伸、破碎和血小板释放的剪 切率下流动;和
[00巧]-收集通道出口处的血小板。
[00%] 发明详述
[0027] 现在将更详细地描述本发明。在W下描述中，应理解表达是指所确定的值的范 围，包括下限和上限。
[0028] 本发明设及从巨核细胞或其片段的悬液生产血小板的射流装置。
[0029] 如本文所使用，术语"血小板"是指导致血块形成的初期止血的细胞机理中设及的 无核细胞。
[0030] 如本文所使用，术语"前血小板"是指巨核细胞或其片段的任何结构形式，例如可 导致血小板形成的细胞质连接的血小板样颗粒。所述结构形式包括但不限于具有长的细胞 质延伸、突出或伪足的细胞，所述延伸、突出或伪足包含涵盖各形成阶段的血小板体的膨 胀，例如节结、珠子等。
[0031] 如本文所使用，术语"巨核细胞"是指负责生产正常止血所需的血小板的骨髓细 胞。巨核细胞来源于局限于巨核细胞谱系的造血祖细胞。巨核细胞生产的初始信号是促血 小板生成素或TPOdTPO是诱导骨髓中祖细胞分化成最终巨核细胞表型所必需的。巨核细胞 分化的其他分子信号包括例如GM-CSF、比-3、化-6、比-11、Flt-3配体和SCF。巨核细胞祖细 胞可W通过体外培养获得。
[0032] 通常，巨核细胞悬液包含悬浮于适当的细胞培养基中的巨核细胞群。在一个实施 方式中，所述细胞培养基是补充有BIT血清替代物、α-单硫代甘油和脂质体的Iscove's Modified Dulbecco's Medi皿(IMDM)。悬液可W进一步包含巨核细胞片段或前血小板。
[0033] 在一个具体的实施方式中，成熟巨核细胞悬液优选通过W下步骤获得：
[0034] (i)提供巨核细胞祖细胞；
[0035] (ii)培养扩增所述巨核细胞祖细胞；
[0036] (i i i)将所述扩增的细胞分化成巨核细胞。
[0037] 巨核细胞祖细胞例如选自造血干细胞(例如，来自厮带、外周血或骨髓）、或选自胚 胎干细胞和诱导性多能干细胞的干细胞。
[0038] 在一些实施方式中，尽管悬液中的大多数细胞可能是巨核细胞，可W在运种悬液 中发现少量其他细胞或细胞残余物，包括但不限于，巨核细胞祖细胞、细胞质片段和前血小 板。因此，在一个实施方式中，用于根据本发明的装置或方法的包含巨核细胞的细胞悬液进 一步包含巨核细胞片段，尤其是前血小板或血小板。例如，大多数包含巨核细胞的细胞可W 在它们的膜上表达CD41和CD42b抗原。
[0039] 从祖细胞或干细胞生产巨核细胞的细节可见于例如"Balduini A，Pallotta I， Malara A,Lova P,Pecci A,Viarengo G,Balduini CL,Torti M.Adhesive receptors, extracellular proteins and myosin IIA orchestrate proplatelet formation by human megakaryocytes.J Thromb Haemost.2008:6:1900-7."或叮akayama N,Nishimura S,Nakamura S, Shimizu T,Ohnishi R,Endo H,Yamaguchi T,0tsu M,Nishimura K, Nakanishi M,Sawaguchi A,Nagai R,Takahashi K,Yamanaka S,Nakauchi H,Eto Κ.Transient activation of c-MYC expression is critical for efficient platelet generation from human induced pluripotent stem cells .The Journal of Experimental Medicine · 2010; 207:2817-30，' D
[0040] 在一个实施方式中，引入所述装置流动的巨核细胞悬液W103-108个/mL，优选lO 5- 5.106个/mL的细胞浓度存在。
[0041] 根据本发明的射流装置包含至少一个生产室，所述生产室包含至少一个具有至少 两个孔的通道，所述孔可进一步描述为通道的进口和出口。通道使得巨核细胞或其片段的 悬液可W从其进口流到其出口。优选地，通道具有一个进口和一个出口且可将主流施加于 巨核细胞悬液W从所述进口流到所述出口。
[0042] 在具体的实施方式中，可W进一步将生产室分成若干个平行通道，它们中的每一 个通过非多孔壁定界，其中可W在室的一端的至少一个进口孔(9)引入包含巨核细胞的细 胞悬液，和可W在室的另一端的至少一个出口孔（10)收集血小板，所述通道形成从其进口 到其出口的单一流。
[0043] 如本发明所使用，术语"非多孔"是指巨核细胞或其片段(包括血小板或前血小板） 不能跨越壁，因此留在通道进口到出口的主流中。
[0044] 发明人发现，为了 W高产率生产血小板，射流装置的通道必须在其至少一部分的 内表面，即在至少一部分旨在与巨核细胞悬液接触的通道壁的表面上构造纹理。所述纹理 通过多个障碍物产生。优选地，所述障碍物分布于通道的至少一个2维表面上，从而形成障 碍物的3维阵列。由于所述障碍物，通道内表面不光滑。发明人发现，当流过具有纹理的通道 时，巨核细胞在具有纹理的表面上的捕获和其脱落成血小板得到改进。通常，所述通道的至 少一部分内表面构造成具有至少一个障碍物的Ξ维阵列，其中所述障碍物分布在通道的至 少一个表面上W改变相邻流线之间的距离，从而允许在障碍物表面上和/或通道的内表面 上捕获流动的巨核细胞并将它们暴露于剪切，W诱导血小板脱落。将巨核细胞暴露于通过 具有纹理的通道的流而产生的血小板表现出类似于循环血小板的一些功能性的方面。在微 射流装置中产生的血小板可能不同于血小板样颗粒。运些血小板样颗粒可W不通过微射流 忍片形成且不完全是功能性的。尤其是，在具体的实施方式中，在本发明装置中产生的血小 板可W被激活，如天然血小板或循环血小板，运与不能激活的血小板样颗粒相反。
[0045] 根据本发明的优选实施方式，通道内表面具有纹理的部分可进一步涂有对巨核细 胞具有结合亲合力的配体，例如血管性血友病因子(VWF)或其功能性变体。运种配体可对血 小板和/或巨核细胞或其特异性受体具有特异性亲合力，或对血小板和/或巨核细胞具有非 特异性亲合力。运种涂层增加细胞对通道内壁或障碍物的粘附。
[0046] 如本文所使用，术语"血管性血友病因子"或"VWF"是指设及止血的由若干单体组 成的多聚体蛋白。人血管性血友病因子的示例性氨基酸序列可在GenPept数据库W登录号 AAB59458找到。优选地，根据本发明的血管性血友病因子是哺乳动物血管性血友病因子，更 优选是鼠因子或灵长类动物因子，甚至更优选人血管性血友病因子。术语"VWF"涵盖任何哺 乳动物来源的VWF，例如灵长类动物VWF，优选人VWF。根据本发明，VWF因子可W是重组VWF或 天然VWF。在其天然形式，其可W被纯化或可W包含于包含其他组分的组合物中（例如在胞 外基质中）。本领域技术人员也可W根据本领域标准技术容易地生产运种重组VWF，例如利 用能生产所述重组VWF或其功能性变体的转染宿主细胞。
[0047]如本文所使用，术语VWF的"功能性变体"是指VWF因子的天然或重组片段，或保留 结合GP扣，尤其是人GPIb的能力的VWF的同源物或类似物。
[004引 VWF的同源物是具有与人VWF氨基酸序列共有至少50 %同一性，优选至少60 %、 70%、80%、90%和95%同一性的氨基酸序列的多肤。
[0049] 如本文所使用，两个序列之间的百分比同一性是序列共有的相同位置数的函数 (即，％同一性=相同位置#/位置总100)，考虑需要被引入W最佳比对两个序列的空位 数和各空位长度。两个序列之间的序列比较和百分比同一性的测度可W利用如下所述的数 学算法完成。
[0050] 两个氨基酸序列之间的百分比同一性可W利用已并入ALIGN程序的E.Myers和 W.Miller的算法(Comput.Appl .Biosci .4:1 1-17,1988)来测定。此外，两个氨基酸序列之 间的百分比同一性可W利用已并入GCG软件包中的GAP程序的Need 1 eman和WunSch (J.Mol.Biol.48:443-453,1970)算法来测定。测定百分比同一性的又一个程序是化USTAL (Μ.Larkin等，Bioinformatics 23:2947-2948,2007;first described by D.Higgins and P.Sha巧，Gene 73 :237-244,1988)，其可作为单独程序或经由网络服务器获得（参见< http://www.clustal.org/>)〇
[0051] 变体进一步包括包含与异源多肤序列融合的VWF因子的片段的多肤或融合蛋白， 所述异源多肤序列不是天然连接至所述VWF。其他变体包括VWF结构域的多聚体形式，其中 所述VWF结构域是对GPIb具有亲合力的那些VWF片段。
[0052] 如本发明所使用，术语"片段"包括给定多肤的至少5个、优选至少10个或至少20个 连续氨基酸的天然或重组的部分氨基酸序列。
[0053] 可用于涂覆本发明装置的VWF变体的实例包括但不限于，重组VWF-AU氨基酸 Q1238-P1471)多肤，其可在大肠杆菌中表达，或重组VWF-A1A2A3(氨基酸D1261-G1874)多 肤，其可在哺乳动物细胞中表达并如Mart in, C.，Morales，L.D.和Cruz, M.A. (2007)， Journal of Thrombosis and Haemostasis,5:1363-1370.doi:10.1111/j.1538- 7836.2007.02536. X之前所描述的纯化。
[0054] 或者，本领域技术人员可W选择VWF类似物，即不与VWF-级氨基酸序列共有序列 同源性，但表现出与巨核细胞和/或血小板结合亲合力类似性质的蛋白或多肤。运种类似物 可选自但不限于纤维蛋白原、纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白和肌腫蛋白。
[0055] 根据本发明的射流装置的通道可W通过其进口和其出口之间的长度L来限定。通 道横截面(优选在通道的整个长度上相同）可W是圆形、卵形、长方形或正方形。如本文所使 用，通道高度Η是指通道截面中两个相对的壁之间测量的最小距离。例如，在圆形截面中，通 道高度Η是通道圆形截面的直径。根据一个优选的实施方式，所述通道可具有基本上正方形 或长方形截面，其中底壁和顶壁决定通道高度Η，和侧壁决定通道宽度W。通道优选是直的且 直通道的轴限定通道的纵向。
[0056] 根据本发明的优选实施方式，射流装置是微射流装置，即装置的横截面尺寸之一 小于1毫米。通道可W称为微通道。
[0057] 关于通道尺寸，运些可W根据可用于血小板生产的巨核细胞的平均尺寸来优化。 贯穿说明书称为化HS的运种参数定义为用于本发明方法的悬液中巨核细胞的平均直径，且 可W通过不同技术测量，如阻抗细胞计数检测(例如美国专利2,656,508描述的库尔特计数 器)或光学显微术和随后的图像分析。
[005引取决于所使用的前体细胞来源和巨核细胞生产方法，化瞒通常为扣m-150皿，例如7 μπι-100μπι，和例如10-50μπι。在具体的实施方式中，本发明装置的化雕优化的尺寸选自W下尺 寸：15μηι、20μηι、25μηι、30μηι、35μηι、40μηι 和 45μηι。
[0059] 在具体的实施方式中，通道的高度Η可W为路贿-1mm，优选Da?-100ym。通道宽度W可 W为化碰-Im，优选10址§碰-1cm。通道长度L可W为1mm-lOm，优选lOmm-lm，更优选lOcm-lm。
[0060] 本发明射流通道的生产室可W包含不同或相同的单个通道或多个通道。当使用多 个通道时，平行化通道共有相同的流进口（16)和流出口（17)。根据本发明的一个优选的实 施方式，生产室可W包含多个平行化通道。生产室中通道数N可W为2-1，000,000,优选2- 100,000。
[0061 ]当使用平行化通道时，生产室优选进一步包含分配通道，其将进口悬液分配到每 个通道。分配通道可为Ξ角形。有利地，分配通道的形状使得它避免用过高剪切率破坏细 胞，例如通过使其高度高于平行化通道中所使用的高度。
[0062] 通道的内表面在至少一部分具有纹理。所述通道的纹理部分的长度可W为通道长 度L的1 % -通道长度L的100 %，优选为通道长度L的50 % -通道长度L的100 %。
[0063] 纹理通过多个障碍物产生。可W确定所述障碍物的密度、尺寸和形状W便在障碍 物和/或通道内壁的表面上捕获巨核细胞，从而进一步血小板脱落。
[0064] 如本文所使用，术语"捕获"是指巨核细胞接触障碍物和/或内通道的表面并且较 之流动的平均速度大幅减速。接触障碍物表面后，巨核细胞可能停止。
[0065] 障碍物例如可W具有杆形、柱形、束形、月牙形、刺穿的月牙形、星形、空腔形或金 字塔形。优选地，障碍物是杆或束。杆形可优选具有正方形或圆形或Ξ角形横截面，且其可 W通过半径r和高度h定义。如本文所使用，杆的"半径"定义为杆横截面的最大尺寸的一半。 束可W优选具有长方形或正方形横截面，且其可W通过长度1束=W、宽度W束二化和高度h定 义。
[0066] 关于杆的尺寸:杆的高度h可W优选为0-H，更优选为化雕/2至化-D細6/2)。杆的半径 r可W优选为化醜/100至100址细6,更优选为化醜/10至10址细6。化雕通常为5-150μπι，杆的高度h 可W优选为0-lmm。杆的半径Γ可W优选为50nm-15mm，更优选为500nm-l. 5mm。
[0067] 关于束的尺寸:束的高度h可W优选为0-H，更优选为化雕/2至化-D細fi/2)。束的宽度 化可W优选为化醜/10至100址細6,更优选为化雕至10址細6。化雕通常为5-150皿，束的高度h可 W优选为0-lmm。
[006引束的宽度化可W优选为500nm-l 5mm，更优选为如m-1.5mm。
[0069] 障碍物可W随机放置于通道内表面或根据具体的图案放置。因此，纹理可W是不 规则或规则的。规则图案可W通过一些特征来表征，如其周期性结构、晶格间距和相对于通 道纵向的晶格方向的倾斜。如果图案是不规则的，其可通过障碍物的密度或通过障碍物之 间的平均距离来表征。
[0070] 根据本发明的优选实施方式，障碍物可W布置在至少一部分通道的内表面W形成 规则图案。
[0071] 根据另一个实施方式，障碍物密度可W沿着通道改变。
[0072] 根据一个具体的实施方式，障碍物是具有半径为r的基本上圆形截面杆，且所述杆 布置在至少一部分所述通道的内表面上w形成具有六边形的周期性结构的规则图案，例 如：
[0073] (i)两个杆中屯、之间的最近距离P为至少等于2r，优选（2r+D细胞/10)至（2" 100曲纖），更优选（2r+D§碰)至（化+10曲纖）；
[0074] (ii)角度α，其是通过通道纵向和六边形的周期性结构的原始细胞的晶格矢量之 一来定义的最低角度例如是：
[0077] (iii)任选所述杆的高度h为如0<h《H，优选化醜/2<h《化-化醜/2)，其中Η是通道高 度。
[0078] 在一个具体的实施方式中，障碍物是具有半径为r的基本上圆形截面的杆（12)，且 所述杆布置在至少一部分所述通道的内表面上W形成具有六边形的周期性结构的规则图 案，例如：
[0079] (i)杆的半径r优选为50nm-15mm，更优选500nm-l .5mm;
[0080] (ii)两个杆中屯、之间的最近距离p为至少等于lOOnm，优选100nm-50mm，更优选 500nm-10mm，甚至更优选如m-lmm;
[0081] (iii)角度α，其是通过通道(14)纵向和六边形布拉维晶格的晶格矢量之一定义的 最低角度例如α为0-90°，优选0-30%
[0082] (iv)任选所述杆的高度h为如0<h《H，其中Η是指通道截面中两个相对的壁之间测 量的最小距离。
[0083] 射流装置可优选根据微射流系统的已知制造技术来制造，例如通过软光刻技术 (Xia等.1998."Soft lithography".Annual Review of Materials Science.vol.28,n°1, p.153-184)。
[0084] 具有至少部分带纹理的通道的正突起(positive relief)的装置的主体(master) 可通过常规方法制备：一种方法可W从包含通道设计的计算机辅助的设计文件产生透明 片。然后，运些透明片可用作掩模将图案转移入负性光刻胶W形成主体。
[0085] 射流装置可由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成并密封在载玻片上。该材料对于所述装 置的视觉控制是有利的。然而，其他材料如娃、玻璃、聚苯乙締、聚碳酸醋、聚氯乙締、环状締 控共聚物、聚（甲基丙締酸甲醋）、热固性聚醋、聚氨醋甲基丙締酸醋、Norland光学粘合剂、 水凝胶(例如藻酸盐、胶原蛋白、琼胶糖、聚丙締酷胺、多糖)可用于制造射流装置。
[0086] 有利地，射流装置和更具体地生产室允许在无菌条件下工作。在优选的实施方式 中，所述射流装置是无菌的。生产根据本发明射流装置的方法可W包含将装置灭菌的步骤。 灭菌步骤可W发生在密封装置之前或之后。
[0087] 此外，生产方法可W包含用对于巨核细胞具有结合亲合力的配体，例如血管性血 友病因子(VWF)或其功能性变体涂覆通道内表面的至少具有纹理的部分的步骤。在具体的 实施方式中，通道内表面通过用血管性血友病因子或其功能性变体的溶液解育来涂覆。通 常用于涂覆固相的VWF的浓度为5-100yg/mL。在优选的实施方式中，VWF的浓度为20-4化g/ mL。在一个实施方式中，通道内表面涂覆有选自下组的VWF的功能性变体:在大肠杆菌或在 哺乳动物细胞中W单体或二聚多肤表达的重组野生VWF或突变VWF多肤。
[0088] 除生产室之外，根据本发明的射流装置可W包含任选的装置例如：
[0089] -流速控制器，用于控制通道中所述悬液的流动；
[0090] -任选的巨核细胞分炼器和/或混合器，用于富集含巨核细胞的悬液并均质化所述 巨核细胞悬液的细胞浓度，其位于生产室的上游；
[0091] -生产室下游的任选的血小板分炼器，用于通过从巨核细胞或其他细胞残余物分 炼血小板来纯化流出悬液；
[0092] 流速控制器可位于通道上W控制流速，优选在通道进口处或通道出口处。该装置 可任选与累连接，所述累使得巨核细胞悬液流入射流装置。
[0093] 生产室上游使用巨核细胞分炼器可W有利地获得在细胞群方面均匀的悬液和为 血小板的工业生产获得一致的产量和质量。尤其是，巨核细胞分炼器包括将巨核细胞与血 小板和其他细胞残余物分离的装置。可使用如下所述用于血小板细胞分炼器的常规细胞分 炼器。尤其是，使用巨核细胞分炼器允许获得巨核细胞富集的细胞悬液，即，悬液中至少 50%，优选至少70%、80%、95%或约100%的细胞是巨核细胞。
[0094] 使用混合器可W进一步有利地确保进入射流装置的生产室的悬液的良好均匀性， 尤其是如果生产室包含若干个通道。细胞混合器可W例如是Stroock等公开的类型 ("Chaotic Mixer for Microchannels",Science,νο?.295,n°5555,ρ.647-651,2002)。 [OOM]在生产室的出口，流出物包含所生产的血小板，但其可进一步包含裸核和/或完整 的巨核细胞。因此将用于分离所生产的血小板的装置有利地放置在生产室的下游。可W使 用常规的细胞分炼器装置，例如适合于微射流技术或大体积如分离技术的那些。血小板分 炼器可选自交叉流过滤装置、基于层流的细胞分炼器、介电电泳活化的细胞分炼器、基于光 学力的细胞分炼器、基于磁力的细胞分炼器、基于声学力的细胞分炼器和基于惯性力的细 胞分炼器。在基于层流的细胞分炼器中，装置可W是基于压流分馈技术的细胞分炼器，如 Takagi等戶片公开（"Continuous particle separation in a microchannel having 曰symmetric曰lly 曰rr曰nged multiple br曰nches"，L曰b Chip,vol.5,n°7,p.778,2005)，或 基于确定性横向位移的细胞分炼器，如L. R. Huang等所描述（"Continuous Particle Separation through Deterministic Lateral Displacement".Science,304,987,2004)。
[0096] 本发明进一步设及从巨核细胞或其片段生产血小板的离体方法。所述方法通过使 用根据W上公开的本发明射流装置来进行。因此上述公开的射流装置的所有具体特征和实 施方式是方法的特征和实施方式。
[0097] 首先，方法包含将巨核细胞或其片段的悬液引入根据本发明的射流装置的步骤。 所述悬液可产生并通过任选与流速控制器连接的累控制。通常，生产室的各通道定义单一 流，允许巨核细胞或其片段的悬液从其进口流过生产室到其出口。因此，物流方向从通道进 口到通道出口。根据优选的实施方式，将物流引入射流装置是连续的。
[0098] 如上所公开，巨核细胞悬液可W是从供体分离或通过祖细胞分化获得的悬液，所 述祖细胞例如选自造血干细胞、胚胎干细胞和诱导性多能干细胞。
[0099] 在射流装置中，将巨核细胞或其片段的悬液引入生产室。根据优选的实施方式，在 进入生产室之前，将所述悬液用细胞分炼器分炼和/或均质化。均质化可W在生产室上游的 混合器中进行。然后，将巨核细胞或其片段的悬液引至生产室中的一个或多个通道的进口 处。
[0100] 将其引入后，在生产室的通道中使巨核细胞或其片段的悬液在适于巨核细胞的延 伸、破碎和血小板释放的剪切率下流动。
[0101] 如本文所使用，术语"壁剪切率'(ig是指用于表征物流与通道表面、障碍物或巨 核细胞的相互作用的参数
[0102] 壁剪切率iv在任何局部表面元件处定义。具体的表面元件可被定义为法向矢量S 和与表面相切的矢量為拟及局部方向中的流体速度妄，只要是平面直角坐标系。然后 穿9? 通过一定义壁剪切率。剪切率的SI测量单位是S-1。 巧巧
[0103] 壁剪切率的值将由于障碍物的尺寸、形状和位置而局部变化。因此，在根据本发明 的装置的具有纹理部分的通道中，使巨核细胞或其片段的悬液在最小值和最大 之间改变的剪切率下家流动。
[0104] 根据本发明的优选实施方式，流速可W固定在能够将具有纹理部分的通道中的所 述巨核细胞经历0到最大值，优选不超过30,000s^优选ΙΟ,ΟΟΟεΛ更优选8,000s^哺 甚至更优选5, OOOs^的壁剪切率f。、的值的范围内。
[0105] 对于给定的通道几何形态、悬液液相参数和流速，根据本发明的装置的具有纹理 部分的通道中的剪切率可W利用有限元素法通过数字计算。
[0106] 比较起来，在人循环中，壁剪切率从最大静脉中的30-40S-1至微循环中的5000S-1 变化。
[0107] 在通道出口，收集的悬液包含所生产的血小板。根据本发明的一个方面，通道出口 收集的悬液可W进一步包含裸核和/或完整的巨核细胞。因此，方法可进一步包含从所述悬 液纯化、富集或分离血小板的步骤。此外，可W在通道出口处分炼出所述血小板。分炼可W 用上文公开的生产室下游的细胞分炼器进行。例如，分炼可通过选自W下的方法来进行:交 叉流过滤、基于层流的分炼、基于介电电泳的分炼、基于光学力的分炼、基于磁力的分炼、基 于声学力的分炼或基于惯性力的分炼。
[0108] 有利地，本发明射流装置可高产量同时保持新产生血小板的功能质量的方式 从巨核细胞悬液生产血小板。
[0109] 通过所述方法获得的血小板可用于制备药物组合物，例如用于治疗血小板计数减 少病症，尤其是血小板缺乏和血小板病。例如，可向患有血小板生产病症的受试者输注有效 量的通过本发明方法获得的血小板。
[0110] 此外，本发明用于生产血小板的方法适于大规模生产高质量和标准化的血小板。 因此，所生产的血小板可用于诊断目的。它们可用作血小板功能标准化的正常对照。事实 上，血小板功能检测要求来自正常个体和感染个体的天然功能性条件下的新鲜血小板。血 小板功能检测的标准化要求实验室应该对每批所进行的血小板功能检测进行正常对照。然 而通过静脉穿刺术连续定期的采血引起若干健康问题和伦理问题。有利地，通过本发明方 法获得的血小板可用作测量血小板功能的体外诊断测试中的阳性对照。
【附图说明】
[0111] 将根据仅W说明性目的提供的W下非限制性实施例连同附图进一步理解本发明， 其中：
[0112] 图1是根据本发明血小板生产射流装置的一个实施方式的流程图。
[0113] 图2阐明了本发明射流装置的生产室的一个实施方式。
[0114] 图3用示意图表示具有杆形障碍物的具有纹理的表面。图3.a是透视图。图3.b是顶 视图。图3. C是剖视图。
[0115] 图4用示意图表示具有束形障碍物的具有纹理的表面。图4.a是透视图。图4.b是顶 视图。图4. C是剖视图。
[0116] 图5表示实施例中使用的Ξ种不同的通道几何形态：图5.a的"通道几何形态Γ、图 5.b的"通道几何形态2"和图5. C的"通道几何形态3"。
[0117] 图6.a是实施例中所使用的平行化通道上游的细胞分配的顶视图和图6.b是实施 例中所使用的平行化通道上游的细胞分配的剖视图。
[0118] 图7是代表具有纹理的表面对捕获巨核细胞的作用的图。空屯、圆对应于非纹理通 道中粘附的巨核细胞的密度0,而实屯、圆对应于虚线之间具有纹理的通道中粘附的巨核细 胞的密度0。纹理对应于通过r=15μm、p = 85μm、H=34μm和h = 20皿定义的几何形状。X轴表 示从通道进口的距离。该图像在实验开始后50min记录。
[0119] 图8阐明了 VWF对捕获细胞的作用。（a)用VWF(实屯、圆）和BSA(空屯、圆）表面涂覆通 道选择性进行的八个不同实验中粘附的巨核细胞的表面密度OdX轴表示从通道进口的距 离。灌注50min后进行各实验的计数。灰色区域表示微通道的纹理部分。（b)当使用VWF涂覆 的微通道时灌注50min后表面的典型图像。（C)当使用BSA涂覆的微通道时灌注50min后表面 的典型图像。比例尺是80皿。
[0120] 图9是阐明块密度(plot density)在几何形状1中对粘附的巨核细胞的表面密度 的作用的图像，其中r等于15皿。不同的通道分别用P等于120皿、85μηι和60μηι形成图案。最后 的通道是阴性测试。图像在实验50min后拍摄。当将Ρ降低到某一阔值时，我们观察到巨核细 胞明显的聚集，如P = 60]im的本实施例中的情况。比例尺是1 OOjim。
[0121] 图10是阐明巨核细胞对杆阵列的不同性能的图像。（a)在杆的平坦表面上从平流 到移位捕获巨核细胞。顺序显示两种不同的时标和输送性能。从0ms到3ms，巨核细胞通过流 动平流输送，产生几 mm.的速度。从14ms到1431ms，巨核细胞在杆的平坦表面上移位，产生 几皿的速度。（b)在杆的圆形表面上捕获巨核细胞。顺序显示两种不同的输送性能：从 0ms到3ms，巨核细胞平流输送至杆，然后从7ms到1823ms在杆圆形表面上移位，最终从 2111msW平流释放。（C)通过杆的平坦表面捕获巨核细胞，并捕获于其右侧。我们观察到从 4s到978s巨核细胞的延伸，形成像线上的珠的结构。比例尺是30]im。
[0122] 图11是阐明成熟巨核细胞的延伸和破碎的图像。时间蒙太奇显示捕获的正在经历 延伸结构的Ξ次破裂的具有像线上的珠的结构的巨核细胞。各白色箭头显示将W平流释放 的延伸的部分，因为它在下面图像上消失。比例尺是30WI1。
[0123] 图12是阐明血小板释放细节的图像。时间蒙太奇显示捕获的具有延伸的像线上的 珠方面的巨核细胞。破裂发生在8.5ms-9ms。巨核细胞仍然是捕获的（左侧)和释放的前血小 板被流动牵引。比例尺是20]im。
[0124] 图13a和b是阐明从延伸的巨核细胞大规模生产血小板的实施例的图像，所述巨核 细胞同时被捕获于大量杆上。图像阐明使得血小板从成熟巨核细胞脱落过程的二维平行化 的单一通道的细节，所述巨核细胞源自（a)厮带血造血干细胞和(b)外周血造血干细胞。注 意较长的延伸覆盖在后一种情况中的整个观察视野。比例尺是100μπι。图13c和d表示微射流 装置中血小板生产的定量评价。微射流装置VS对照中在2小时期间从源自（C)厮带血造血干 细胞和(d)外周血造血干细胞的成熟巨核细胞生产血小板的比较。在该实验中，巨核细胞悬 液在闭环循环中通过管道循环入五个平行的微射流忍片(微射流装置）。对照巨核细胞在没 有微射流忍片的闭环循环中通过管道循环(对照）。血小板浓度通过在血细胞计数器中计数 而获得。（C)提供微射流装置(黑条)vs对照(淡灰条)在实验开始时(普通条，t = 0min)和在 实验结束时（阴影线条，t=120min)的平均值±SEM(n = 5)。利用Student t检测对微射流装 置VS对照中血小板浓度的成对样品进行统计分析，t = 120min时获得的P值表示显著差异 (***p<0.005)"(d).提供微射流装置(黑条)vs对照(n = l)(淡灰条)在实验开始时(普通条， t = 0min)和在实验结束时（阴影线条，t = 120min)的平均值±561(11 = 3)。
[0125] 图14是微射流装置中生产的血小板与缺少微射流忍片的对照系统中获得的那些 相比的流式细胞仪分析的图像，如图13的图例中详细描写。
[0126] (a)血小板受体的单一颜色流式细胞仪分析，表明微射流装置(黑条)vs对照(淡灰 条）中生产的血小板表面上CD61、CD42b和CD49b受体的数目。提供平均值±SEM(n = 3)，利用 S化dent t检测对微射流装置VS对照中不成对样品进行统计分析比较受体数目。CD4化柱状 图的星号表示显著差异(P<〇.05)。
[0127] (b)血小板受体的两种颜色流式细胞仪分析，表明微射流装置中生产的CD41 + CD42b+血小板群体VS对照中的背景值。
[0128] (C和d)血小板受体的两种颜色流式细胞仪分析，其中用或不用刺激人PAR-1凝血 酶受体(TRAP)的激动剂肤S化LR脚舌化CD41 /CD61受体。在图14. C中，柱状图表明了在血小板 和CD42b+口内，在微射流装置(黑条)和对照（淡灰条）中生产的血小板在TRAP活化之前(普 通条)或之后（阴影线条）的PAC-1阳性单元％。提供平均值±SEM(n = 6)，利用Student t检 测对不成对样品进行统计分析比较非刺激血小板vs TRAP-刺激的血小板。P值的星号表示 在微射流装置中，但并非在对照中生产的血小板在TRAP活化之前或之后PAC-1阳性单元％ 之间的显著差异(P<〇.05)。图14.d显示血小板口内的相应点图，表明在微射流装置（左图） 和对照（右图）中生产的非刺激(上图）和TRAP-刺激样品（下图）中的PACrCD4化+血小板群。 注意在缺少对照的微射流装置中生产的TRAP-刺激的血小板中PACrCD4化+群的移动。
[0129] 图15是显示在微射流装置中生产的血小板与在缺少微射流忍片的对照系统中获 得的那些相比的粘附和聚集的显微图像，如图13.C的图例中详细描写。
[0130] (a)在不存在(顶图）或存在凝血酶(底图）的情况下在通过射流装置(左图）或对照 (右图）生产的样品中用抗微管蛋白抗体间接免疫巧光标记（用第二AlexaFluor488抗小鼠 抗体显影和AlexaFluor546鬼笔环肤进行F-肌动蛋白染色）。用Axio Observer显微镜 (26133)^40^.6-倍放大率用91(：1^4斗-化1?-12数字〇：0照相机(9成像)获取图像。在射流 装置出口处收集的样品中观察到表示未活化的血小板的特征的环状微管蛋白染色(上左）， 而从对照收集的样品中回收不含环状微管蛋白染色的较大片段(上右）。在射流装置出口处 收集的样品中观察到表示活化的血小板的特征的肌动蛋白应力纤维(下左），而从对照收集 的样品中回收不含组织化应力纤维染色的较大元件(下右）。比例尺是如m。
[0131] (b)在不存在(上图）或存在（下图）通过模拟人PAR-1凝血酶受体TRAP-1的激动剂 肤S化LR脚舌化的情况下在射流装置(上左）出口处和从对照（右）收集的样品中回收的血小 板或元件的扫描电子显微图像。各条件包括粘附牛血清白蛋白或纤维蛋白原。比例尺是扣 m"(c)在纤维蛋白原和化C12存在下的聚集。用模拟人PAR-1凝血酶受体TRAP-1的激动剂肤 S化LR脚舌化之前(上图）或之后（下图）观察到血小板聚集。在射流装置出口处收集的样品中 可见大的聚集体(下左图）。在对照样品中回收的片段在激动剂肤的存在下没有聚集(下右 图）。比例尺是10皿。
[0132] 图16包括显示引入微射流混合器的成熟巨核细胞悬液的图像。（a)在微混合器进 口处拍摄的400副图像的重叠。细胞W平流方式从左至右流过X方向且相对于y轴聚焦。（b) 在微混合器出口处拍摄的400副图像的重叠。细胞流在y方向是均质的。（C)混合器中成熟巨 核细胞的轨迹。间隔为1ms的200副连续图像的重叠。比例尺是1 OOwii。
[0133] 图17显示细胞分炼器的两个实施例。图17. a是显示通过压流分馈法分炼血小板的 图像。进口细胞悬液由固定血小板和DAMI细胞组成。将混合物引入通道（1)。将不含细胞的 缓冲液引入通道(2)。从通道(3)中回收血小板和从通道(4)中回收DAMI细胞。图像是间隔为 1ms的30副连续图象的重叠，W显示不同的细胞轨迹。比例尺是200μηι。图17.b是显示通过确 定性横向位移分炼血小板的图像。进口细胞悬液由固定血小板和DAMI细胞组成。将混合物 从进口处引入并在出口处分炼(显示于图像上）：将DAMI细胞偏离并在中央出口巧）中分炼， 而血小板不偏离并在侧向出口（6)上分炼。图像是间隔为0.3ms的485副连续图像的重叠 ，W 显示不同的细胞轨迹。比例尺是lOOwn。
[0134] 在图1中，射流装置1用示意图表示。射流装置1由侧向细胞混合器2、生产室3和细 胞分炼器4串联组成。将巨核细胞悬液5引入射流装置1。收集流出悬液6。在流入悬液5和流 出悬液6之间实施流速控制器7。流速可W通过压差或流速源，例如开放系统中的注射器累、 闭合环路系统中的蠕动累(未显示)来施加。
[0135] 图2更更详细地展示射流装置的生产室3。生产室3包含具有两个孔9、10的一个通 道8:用于引入巨核细胞悬液5的一个进口 9和用于收集流出悬液6的一个出口 10。通道的纵 向用箭头14表示。通道8具有长度L、宽度W和高度H。根据本发明，通道8在其内表面的至少一 部分11处具有纹理。
[0136] 表面的纹理通过多个置于至少一部分通道的内表面的障碍物产生。
[0137] 根据一个优选的实施方式，障碍物是杆且如图3所示安排。杆12位于一个通道壁13 的内表面。各杆12具有半径为r的基本上圆形的截面，和布置所述杆W形成具有六边形的周 期性结构的规则图案。两个杆中屯、之间的最近距离用P表示。角度α是通道的纵向14和六边 形的周期性结构的原始细胞的晶格矢量之一定义的最低角度。杆的高度用h表示，其例如是 0<h《H，其中Η是通道高度。
[0138] 根据另一个优选的实施方式，障碍物是束且如图4所示安排。束15位于一个通道壁 13的内表面。各束15具有高度为h和宽度为化的基本上长方形的截面。束的长度等于通道宽 度W的长度。束放置为垂直于通道的纵向14。两个束中屯、之间的最近距离用P表示。束的高度 用h表示，其例如是0<h《H，其中Η是通道高度。
【具体实施方式】
[0139] 材料和方法
[0140] CD34+细胞的培养和分化
[0141 ] 将CD34+细胞通过之前报告的免疫磁性技术(Miltenyi Biotec，Paris，France)从 人月齐带血（UCB)或外周血分离（参见？0；[則111古-如33 33(3等/前0古(311/061古3431容1131；!_打容 inhibits human megakaryocytic terminal differentiation，'，Blood，vol.116，η°25， p. 5670-5678,2010)。根据Helsinki声明在知情同意和经我们的学会伦理委员会批准后获 得这些血样D将CD34+细胞在37"C下在5%C02中在由Iscove modified Dulbecco medium (IMDM;G;LbcoInvitrogen，Saint-Aubin，France)组成的完全培养基中培养，所述培养基补 充有15%BIT 9500血清替代物（Stem Cells Technologies,Grenoble,化31106)、0-单硫代 甘油（Sigma-Al虹ich，Saint-QuentinFallavier，F'rance)和脂质体（5葬脂醜基-胆碱、胆固 醇和油酸；SigmaAldi'ich)。在第0天将人重组干细胞因子（SCF, lOng/mL;Miltenyi Biotec) 和促血小板生成素版激动剂AF13948(TP0,50nM)(参见Dunois-Lard旨等，"E邱osureof human megakaryocytes to high shear rates accelerates platelet production，，， 6100(1，￥01.114，11°9,9.1875-1883,2009)添加至培养基，然后在第7天添加不含5〔尸的20禮 TPO。将培养12-14天后获得的成熟UCB巨核细胞在完全培养基中稀释至0.7-1.2xl06mL的浓 度，因此比之前报告的实验少浓缩大约10倍。发现测量的平均直径化HS是12.5+/-1.7皿。就 在暴露于剪切之前去除培养期间形成的血小板的通过BSA梯度根据(Robert A，Codin V， Gamier A,Pineault N.Megakaryocyte and platelet production from human cord blood stem cells.Methods Mol Biol.2012;788:219-47)报告的方法来进行。然后将浓度 调节至200 000个巨核细胞/mL。除非另有说明，结果为源自UCB CD34+的巨核细胞。
[01创系统结构
[0143] 将成熟巨核细胞悬液引入固定于W至少3(K)rpm旋转的轨道混合器（IKA MS3基本 型)上的25cm2烧瓶(Corning，USA)中。轨道混合器用于保持悬液中细胞浓度的均匀性。烧瓶 中巨核细胞浓度范围为至少lOOmL-i且不能超过10xl06mL-i。
[0144] 可通过不同组分用许多方法控制物流:例如差压控制器、注射累和蠕动累。当使用 差压控制器时，将气压进口和悬液出口密封插入烧瓶软木塞。通过压力控制器(MFCS-4C, Fluigent S.A. ,France)将气压施加于烧瓶。将烧瓶与具有聚酸酬酸(P邸K)管（Upchurch Scientific，USA)的微射流忍片的进口连接。可使用其他管(Tygon R-1000，Saint-Gobain， France,PT阳 tubing,Saint Gobain,France for instance)。在出口收集悬液。当使用蠕 动累(Reglojsmatec, Switzerland)时，进口和出口管到达同一个旋转的烧瓶。可在微射流 元件的上游或下游塞住蠕动累。还可W通过注射累(P皿2000,化rvard apparatus, US)引 入巨核细胞悬液。
[0145] Ξ个微射流元件串联实施：巨核细胞分炼器和/或上游侧向细胞混合器、血小板生 产通道和下游细胞分炼器，如图1所示。细胞混合器和细胞分炼器是任选的。
[01W 装置制造
[0147]微射流元件根据软光刻技术快速成型制造 (Xia等.1998. "Soft lithography" ? Annual Review of Materials Science.vol.28,n°l,p.153-184)。首先，从包含微通道设 计的计算机辅助设计文件制造透明片。运些透明片用作掩模通过常规的照相平版印刷术将 图案转移入负性光刻胶(SU-8 2000和3000系列，Microchem，US)，产生具有微通道正突起的 主体。两个通道均由模制的聚二甲基硅氧烷(PDMS, Sy 1 gard, Dow Corning, USA)制成，密封 于载玻片上。混合PDMS预聚物和固化剂并脱气。将混合物倒在主体上，在70°C固化化，切成 单个忍片，打进口和出口孔。用异丙醇清洁载玻片并干燥。PDMS单个结构和载玻片均在氧等 离子体烘箱中处理，然后密封。
[014引血小板生产通道
[0149] 具有纹理的表面通过通道壁(玻璃或PDMS)上的3D图案来定义。运里我们提出运些 可能的图案的两个实例：（〇xy)平面上的六角形圆盘阵列和(Ox)方向上的1D束阵列。那些图 案的几何形状描述于图3和图4。杆阵列的设计通过Ξ个参数定义：圆盘半径r、两个圆盘中 屯、之间的距离P W及进口的物流方向和通过两个柱中屯、定义的方向之间的角度α。在本文我 们用于实验的几何形状中，α通过W下标准定义：sina = r/p。该标准几何上暗示着，一旦投 影在垂直于初始物流方向的轴上，两个相邻的圆盘中屯、通过一个半径分离。用实验方法，r 为15皿-20皿和P为60μηι-120皿。图3. C和图4. C显示(0巧)平面上的障碍物(束或杆）。通道的 高度和障碍物的高度分别通过Η和h来定义。用实验方法，参数h/H为0.22(小杆)和1(完整的 柱)。
[0150] Ξ种不同的通道几何形态用于该实施例，阐明于图5. a、图5. b和图5. C:
[0151] -第一个，所谓的"通道几何形态Γ，用于测量通道纹理对于巨核细胞捕获的影响。 它由8个平行通道组成：6个具有纹理的通道和两个光滑通道。从x = 0mm(进口）到x = 20mm (部分1)所有通道是光滑的。图案遵循参数r = 15皿、H= 36皿、h/H = 0.55。口对于不同的具有 纹理的通道是变化的：ρ = 60μπι(2个通道）、ρ = 85μπι(2个通道)和ρ = 120μπι(2个通道）。通过 改变不同Ρ参数的具有纹理的长度使得所有的流体阻力相等。对于ρ = 8扣m，在通道的20- 22mm之间构造纹理且在22-40mm之间保持光滑。
[0152] -第二个，所谓的"通道几何形态2"，用于测量蛋白质表面涂层效应和纹理效应。它 由8个平行通道组成。所有通道的长度均为四厘米且仅在第一和第Ξ厘米之间构造纹理。通 道几何形态2用参数r = 15皿、H=36皿、h/H=0.55和p = 85皿组成图案。
[0153] -第Ξ个，所谓的"通道几何形态3"，用于利用障碍物效果使血小板生产过程平行 化。它由8个蛇形平行通道组成（显示为图5.C中的块状物）。所有通道的长度均为17.3cm且 在通道的直线部分(代表77%的总长度)上构造纹理。通道几何形态3用参数r=15ym、H=52 4111、11/^=巧化=8541]1组成图案。
[0154] 剪切率
[0155] 我们在通道壁上定义了表面元件，不管在玻璃或PDMS(包括PDMS障碍物)上。在该 表面元件上，我们通过垂直于它的矢量寇定义平面的单位矢量。测定与表面相切且在流体 速度V的局部方向的单位矢量品W使得(某滞)是平面直角坐标系。然后通过^定义壁 涅巧. 剪切率(S-1)。壁剪切率通过装置中的流速和装置的几何形状来控制。整个射流系统的水动 阻力通过在进口和出口之间施加压差、借助于压力控制器和通过测量由此产生的流速来表 征（Flowell,Fluigent,France)。 邮]影像显微镜系统
[0157] 将微射流忍片设置在倒置显微镜（DMI6000B，Leica Microsystems GmbH, Germany)平台上。用计算机辅助的机动化平台控制器记录沿着通道长度的位置。我们记录 了观测视野位置和随着实验时间它们之间的交替录像。用微分干设差镜头记录10X-40X之 间的影片和图像。用CMOS高速照相机(化steam SA3,陆otron,USA)W〇.5到1500化的频率记 录图像。
[0158] 从记录的通道图像人工计数表面粘附细胞，当样品成块时，用血细胞计数器和库 尔特计数器(Scepter II，Mi 11 ipore，US)计数悬液中的细胞。
[0159] 蛋白质表面处理
[0160] 血管性血友病因子（VWF)是Laboratoirel·化n^aisdu fractionnement et des Biotechnologies的礼物。将它W40yg.mL-i稀释于不含巧离子和儀离子的憐酸盐缓冲盐水 (PBSKLonza，Belgium)，并灌注于密封的微通道中。我们仅在血小板生产通道中使用该表 面涂层。
[0161] 将牛血清白蛋白（Sigma-Al化ich La ￥6巧;[116'63,化曰]1。6)^4〇4邑.111[1稀释于憐 酸盐缓冲盐水(PBS)中并灌注于微通道中。
[0162] 对于两种蛋白质处理，忍片的进口和出口通过盖玻片覆盖。将忍片在4°C解育过夜 并在实验前用PBS洗涂。玻璃和PDMS上的VWF吸附通过巧光标记来证实，所述巧光标记使用 第一多克隆兔抗VWF抗体(Dako，10yg.mL-i)和第二Alexa fluor 546多克隆山羊抗兔抗体。 [01创细胞混合器
[0164] 混合器的设计直接产生自Stroock等公开的微通道的无序混合器的人字形结构 ("Chaotic Mixer for Microchannels",Science,νο?.295,n°5555,ρ.647-651,2002)。考 虑到Stroock等的参数，细胞混合器设计Wh = 50ym、w = 300ym、a = 1、p = 2/3或1/3和q = 0.63μηι制备。
[01化]血小板生产通道的平行化
[0166] 期望流入装置的巨核细胞流速高W增加血小板生产数。对于给定的障碍物图案和 通道高度，可通过增加通道宽度来增加细胞流速。PDMS通道的机械限制利用最大的宽度与 高度之比W避免通道塌陷，我们平行化通道W增加有效宽度。
[0167] 通过管将巨核细胞引入血小板生产通道。将细胞通过Ξ角形进口分配到平行通道 中，所述进口使细胞到达每个通道（图6)。对于给定的通道高度，壁剪切率与通道宽度成反 比。因此，壁剪切率在靠近进口壁处比在平行化通道进口之前高得多。
[0168] 为避免施加可能破坏细胞的壁剪切率，用高于平行化剪切通道中使用的高度制造 分配通道。运两个高度之比通常为2-20。
[01~]血小板分炼
[0170]可W通过从血小板生产通道中串联分炼流出悬液来将裸核和完整的巨核细胞从 血小板中去除，如图1所示。运可W用微射流技术进行。大体积也可考虑析离技术。我们提供 使用压流分馈技术（Τ曰k曰邑i等，（'Continuous p曰rticle sep曰ration in曰microch曰nnel having asymmetrically arranged multiple branches"，Lab Chip,vol.5,n°7,p.778, 2005)和确定性横向位移化.R.Huang等."Continuous Particle Separation through Deterministic Lateral Displacement" ,Science,304,987,2004)分炼血小板的两个实施 例。对于压流分馈技术，用宽度为50μπι的压段来制造装置(图17)。细胞悬液由多聚甲醒固定 的血小板（来自全血）和DAMI细胞（巨核细胞细胞系，Greenberg等.1988. ('Characterization of a new megakaryocytic cell line: the Dami cell，'.Blood.72: 1968-1977)组成。图17.a显示可利用该技术将DAMI细胞和血小板在不同的出口分支中分 馈。确定性横向位移(DLD)是基于通过微米级障碍物的周期阵列的层流的被动的结构依赖 性粒径分离方法。DAMI细胞和固定的血小板的混合物基于最初由L.R.化ang等.（Science, 304,987(2004))描述和由K丄outherback等.（AIP Advances 2,042107(2012))开发的装置 来分炼。该装置由一个进口、球形的杆阵列和两个出口（中央和侧向的）组成。在图17.b上， 装置长度为5cm，宽度为3mm和高度为40皿。杆直径为85皿且杆之间的距离为15皿。杆行移位 形成0.05弧度的角度。表面涂覆有BSA涂层。将DAMI细胞偏离并在中央出口（6)中分炼，而血 小板不偏离并在侧向出口（5)上分炼。装置提供100%的血小板纯度和80%的血小板回收 率。图像是通过0.3ms分离的485副连续图像的重叠，W显示不同的细胞轨迹。比例尺是10化 ΓΠ 〇
[0171] 收集的血小板的表征
[0172] 将几何形状3的微射流装置中的血小板生产与由不存在微射流忍片的管道组成的 对照样品相比。用流式细胞仪抓巧光激活的细胞分炼器(FACS)Calibur(BD Biosciences， Le化nt de Claix，France)表征CD41和CD42抗原的表达。用异硫氯酸巧光素(FITC)-结合 的抗人CD41(aIIb)和R-藻红蛋白（PE)-结合的抗人CD42b(GPIba)(两者均来自Beckman Coulter, Villepinte ,France)和FITC-结合的抗人活化的日1化63(808;[03。16]1。6 3)在22"€ 解育血小板 15分钟。用FITC小鼠 IgGi(Beckman Coulter)、阳小鼠 IgGi(Beckman Coulter)进 行对照。用GP筛选分析(Bio巧tex,Marseille ,France)进行血小板受体的单色流式细胞仪 分析。基于校准的珠标准曲线，通过将巧光强度转换为每个血小板结合的单克隆抗体的相 应数目来测定抗原性位点数。如在上文引用的Dunois-Lard自的出版物中之前报告的进行纤 维蛋白原粘附分析和外巧光表征，除了活化是在凝血酶或PAR-1凝血酶受体的激动剂肤存 在的情况下获得。用高分辨率生物成像平台化MCCD MGi Plus Qimaging Rolera camera, Roper Scientific,Ενιτ,France)分析在494nm和522nm(分别为吸收和发射）的外巧光。通 过在涂有2%BSA或纤维蛋白原(0.2mg/ml)的载玻片上添加血小板来进行30min的扫描电子 显微术。之后，将一滴包含肥阳8 5〇1111化(：1、135111]\1化2+、2111]\1?。42%和戊二醒4%的溶液添 加到载玻片上用于血小板固定，然后将载玻片在包含相同溶液的浴中解育过夜。次日，将样 品洗涂并用25%、50%、75%、95%和最后是100%的乙醇脱水，然后通过真空干燥机干燥。 用双重通道全血/光学Lumi-聚集度计(Model 700化ronolog Co巧oration)进行聚集。 陶]巨核细胞混合
[0174]人字形凹槽在通道的(Oyz)平面产生无序微縱满，导致细胞的横向位移（图16)。它 们还使得细胞打破其轨迹，进入相对于物流轨迹旋转45Γ的小道，然后退出小道并在主通 道中继续。那些无序的位移导致均质的侧向细胞流速，如图16b.所描述。
[01巧]巨核细胞捕获
[0176]我们通过独立于其移位速度(包括非移动细胞）的表面粘附的巨核细胞定义捕获 的巨核细胞。我们根据束或杆（图3和图4定义）的不同几何形状评估了巨核细胞捕获。结果 显示于图7。沿着非纹理的第一部分通道，粘附的巨核细胞的密度非常低(cKlOOmnf2)。相反， 沿着具有纹理的一部分通道，密度高得多(〇〉750mnf2)。作为对照，光滑通道显示巨核细胞的 表面密度不可检测。也证实了杆间距离p = 60μηι、ρ = 85μηι和p = 120]im的捕获增强。
[0177]沿着接着纹理部分且缺乏障碍物的最后部分，我们观察到具有纹理的通道（ο~ 250mm-2)和不具有纹理的通道(曰<10mm-2)之间的明显密度差。运是与巨核细胞的移位速度 联合的部分2中发生的捕获的直接后果(移位速度的分布从Ομπι. S-1扩大至200μπι. S-1)。
[017引蛋白质表面涂层的影响
[0179] 在血管内皮细胞上，当通过结合其GPIb受体经受高剪切率(〉1000s^)时，VWF允许 循环血小板的移位化 uizinga 等，Shuctures of Glycoprotein ]；baand Its complex with von Willebrand Factor AlDomain", Science ,vol.297,n°5584,p.1176-1179, 2002)。在体外，VWF的吸附允许巨核细胞、血小板和前血小板移位到PDMS和玻璃表面上 (Dunois-Lard有等，"Exposure of human megakaryocytes to high shear rates accelerates platelet production" ,Blood,vol. 114,n° 9 ,p. 1875-1883,2009)。我们比较 了 VWF和BSA涂层对通道壁上巨核细胞的粘附的影响。
[0180] 我们用涂有VWF的通道几何形态2进行四次实验，用涂有BSA的通道几何形态2进行 四次实验。我们比较了 t = 50min时巨核细胞的表面密度。
[0181] 结果显示于图8。当涂有VW即寸，通道光滑部分的平均巨核细胞密度为54mnf2,通道 纹理部分的平均巨核细胞密度为275mm 2。当涂有BSA时，通道光滑部分的平均巨核细胞密度 为4mnf2,通道纹理部分的平均巨核细胞密度为39mnf2。运证实了两种涂层均发生了之前段 落中描述的捕获效应。此外，VWF明显增加了通道中粘附细胞的密度。
[0182] 用纤维蛋白原涂层进行第Ξ组实验。尽管已知纤维蛋白原W低剪切率结合巨核细 胞，但是在用于促进巨核细胞延伸的高剪切率下不可能观察到巨核细胞捕获。
[0183] 那些结果没有详细描述表面上细胞的性能。我们定性地观察到不具有纹理的通道 内沿着X轴的距离，0明显降低。在具有纹理的通道中，我们观察到沿着纹理长度，〇先略微增 加，随后降低。运些结果是瞬时的，并由巨核细胞的不同输送机制产生。
[0184] 巨核细胞和血小板输送
[0185] 细胞具有两种不同的输送方式:平流，产生几 mm. 的速度，和移位，产生几 μπι. 的速度。图10提出了细胞和壁之间不同的可能相互作用。使用杆阵列，可W通过Dunois- Lardg等（ibid.)描述的通道壁捕获细胞，也可W通过在杆的顶部或在杆的垂直侧上移位来 捕获细胞。当通过杆捕获时，细胞在通道壁上跟随其移位，或W平流释放（图10.b)，否则停 止移位（图10.C)并在杆后被捕获。那些单细胞事件阐明了之前两段中描述的较大规模的性 能。
[01化]巨核细胞破裂和血小板释放
[0187] 我们观察到血小板从表面粘附的巨核细胞脱落。当巨核细胞移位到通道壁上时， 它们与壁表面上的VWF建立了瞬时相互作用，其逐渐导致形态变化直到血小板从巨核细胞 脱落。当延伸体和细胞体均移位时发生脱落。该过程描述于上文引用的Dunois-Lard6的出 版物中和国际专利申请W0 2010/06382311中。破裂后，两种实体继续移位到壁表面上。
[0188] 当细胞体移位直到在杆周围或杆后被捕获时，也发生脱落（图10. C)。在几分钟的 时间范围内，巨核细胞经历形态变异，导致形成采用线上的珠的结构的延伸体，如之前上文 引用的Dunois-Lard6的出版物中所报告。此外，与整个细胞与涂层表面接触相反，一些延伸 体似乎与物流一起自由移动(摇摆），尽管细胞通过至少一个接触点保持在相同位置。随着 线上的珠的延伸体的尺寸增长，一些发生破裂，释放血小板和/或前血小板。图11报告了十 种巨核细胞延伸的Ξ种不同的破裂(数据未显示）。摇摆释放详细描述于图12的短时标中。 破裂后，释放的前血小板的速度测量为4cm每秒，其对应于物流的速度。我们假定破裂后释 放的元件平流输送。
[0189] 各巨核细胞释放的血小板的量可通过单个细胞的长时间成像来估计。我们的观察 结果显示捕获于杆上且经历剪切的巨核细胞可W释放11个片段/小时。运些片段具有线上 的珠的形状。我们测量了释放珠的尺寸分布，将它们中每一个固定为影像框架上的楠圆。假 定旋转对称，我们估计了释放珠的总体积并用它除W我们假定为血小板的最小的观察到的 珠子体积。用该方法，我们发现血小板产量高达350个血小板/巨核细胞。通过比较，预期人 巨核细胞体内转化为1〇2-1〇3个血小板（Thon et al,"Cytoskeletal mechanics of proplatelet maturation and platelet release"，J Cell Biol,vol.191,n°4,p.961- 874,2010,and Thon et al.,"Platelet Formation",Seminars in Hematology,vol.47, n°3,p.220-226,2010)〇
[0190] 从巨核细胞生产血小板的平行化
[0191] 我们通过制造用柱阵列组成图案的平行化通道来扩大血小板生产的过程。所有W 下实验使用上述几何形状3。几何形状3具有总共168770个柱。图13. a和13. b是显示总共66 个柱的柱阵列的细节，其中48个柱设及巨核细胞捕获或伸长过程。单独地，我们注意到单个 柱能够捕获几个巨核细胞。该过程是瞬时的，且在物流方向上与距离相关。图13.a描绘了厮 带血巨核细胞的捕获和延伸，图13.b描绘了外周血巨核细胞的捕获和延伸。
[0192] 在"微射流装置"结构中，将20mL经揽拌的巨核细胞悬液(200000个巨核细胞/mU 在闭环中通过5个根据几何形状3制造的平行装置循环2小时。在"对照"结构中，将20mL经揽 拌的巨核细胞悬液在不具有任何微射流装置的闭环中在单管(Tygon，0.57mm I. D.，Saint- Gobain,France)中循环。为量化血小板生产，在血细胞计数器中计数在开始时和120min灌 注后通过微射流装置或通过对照系统收集的细胞悬液。认为直径为lym-4wii的双重折射细 胞是血小板。图13. C和13. d显示分别从厮带血巨核细胞和从外周血巨核细胞生产血小板的 血细胞计数器计数的结果。图13. C显示在t = 0min时，在微射流装置和在对照中回收的血小 板浓度没有显著差异(273 800和301 000个血小板/mL)。在t = 120min，浓度分别为486 000 ±69 400个血小板/mL和1 360 000± 159 000个血小板/mL，显示显著差异（Student t检 验，成对样品，P<〇. 005)。我们假定运种浓度增加是通过微射流装置的结果。图13. d显示了 类似的趋势，但没有对在微射流装置和对照中回收的血小板浓度进行统计分析。
[OW] 射流装置中生产的血小板的表征
[0194]灌注两小时后，装置中循环的细胞悬液包含的血小板的含量大于在对照系统中循 环的细胞悬液。因此可W通过上述的不同方法分炼运些血小板。在射流装置中生产的血小 板显示出与天然血小板（即从血分离的血小板或循环血小板)相当的若干特征。我们发现从 对照系统中获得的样品不具有运些特征，所述对照系统由除了射流通道之外的所有元件组 成。如图14.a所示，射流装置生产的血小板中CD42b受体的表达明显高于对照样品中回收的 血小板样颗粒(P<〇.05)。如使用血小板所观察到的，在微射流装置中生产的血小板中鉴定 了CD41+CD42b+元件的清晰群体，而在对照样品中回收的血小板样颗粒中没有发现（图 14.b)。有趣的是，TRAP刺激后，血小板能够经历类似于已知的表征血小板的活化特征，例如 增加其与特异于anb盼受体的活性构象的PACl单克隆抗体的结合水平，而在对照样品中回 收的血小板样颗粒中没有运个发现（图14.C和14.d)。图15.a显示表示血小板特征的微管蛋 白环存在于从射流装置收集的样品中，但不存在于从对照样品收集的样品中。一旦它们被 凝血酶活化，通过射流装置生产的血小板显示出线状伪足、板状伪足和肌动蛋白应力纤维， 表明肌动蛋白微丝如在从血分离的凝血酶激活的血小板中一样重组。对照样品缺少血小板 功能的两种标志。扫描电子显微镜（图15.b)显示了通过射流装置生产的TRAP激活的血小板 中线状伪足和板状伪足的存在，而运些形式在对照样品中没有检测到。图15 . C显示从通过 射流装置的通路中回收的样品中的血小板聚集。再一次，在对照中回收的血小板中没有运 种大的聚集。因此该报告首次表明，从通过平行化微射流装置的巨核细胞暴露中收集的样 品中观察到清楚的血小板特征，运是在缺少微射流忍片的对照中回收的血小板样颗粒所缺 少的。
【主权项】
1. 用于从巨核细胞悬液巧)生产血小板的射流装置（1)，包含： -生产室(3)，包含通过非多孔壁定界的至少一个通道(8)，和在一端的其中能引入包含 巨核细胞或其片段的悬液的至少一个进口孔(9)，和在另一端的其中可W收集血小板的至 少一个出口孔(10); 其中所述通道(8)的壁的内表面的至少一部分(11)构造成具有多个障碍物。2. 根据权利要求1所述的射流装置，其中所述通道(8)的内表面的纹理部分（11)进一步 涂有对巨核细胞具有结合亲合力的配体，例如血管性血友病因子(VWF)、其功能性变体或包 含血管性血友病因子的片段的重组多肤、或纤维蛋白原或纤连蛋白。3. 根据权利要求1或2所述的射流装置，其中确定所述障碍物的密度、尺寸和形状W便 将巨核细胞捕获于通道内表面的所述纹理部分上，从而血小板脱落。4. 根据权利要求1-3任一项所述的射流装置，其中所述障碍物是杆(12)或束（15)。5. 根据权利要求1-4任一项所述的射流装置，其中所述通道(8)具有基本上正方形或长 方形的截面。6. 根据权利要求1-5任一项所述的射流装置，其中所述障碍物是具有半径为r的基本上 圆形截面的杆（12)，且所述杆布置在至少一部分所述通道的内表面上W形成具有六边形的 周期性结构的规则图案，例如： (i) 杆的半径r优选为50nm-15mm，更优选500nm-l .5mm; (ii) 两个杆中屯、之间的最近距离p为至少等于10化m，优选100nm-50mm，更优选500nm- 10mm，甚至更优选如m-lmm; (iii) 角度α，其是通过通道纵向（14)和六边形布拉维晶格的晶格矢量之一定义的最低 角度，例如α为0-90°，优选0-30% (iv) 任选所述杆的高度h为如0<h《H，其中Η是指通道截面中两个相对的壁之间测量的 最小距离。7. 根据权利要求6所述的射流装置，其中所述通道的高度Η为扣m-lmm。8. 根据权利要求1-7任一项所述的射流装置，其中所述生产室(3)包含至少一个或多个 在其内表面上具有纹理部分的平行通道，例如2个通道-106个通道。9. 从巨核细胞或其片段生产血小板的离体方法，所述方法包含： -将包含巨核细胞或其片段的细胞悬液引入根据权利要求1-8任一项所述的射流装置； -在生产室的通道中，使所述悬液在适于巨核细胞的延伸、破碎和血小板释放的剪切率 下流动;和 -收集通道出口处的血小板。10. 根据权利要求9所述的方法，其中将流速固定在能够将具有纹理部分的通道中的所 述巨核细胞经历最小值到最大壁剪切率?&,χ的范围内，所述最大壁剪切率不超过30，〇〇〇s -1、优选10，OOOs-i、更优选8，OOOs-i和甚至更优选5，OOOs-i。11. 根据权利要求9或10所述的方法，其中所述通道出口处收集的血小板进一步包含裸 核和/或完整的巨核细胞，所述方法进一步包含从所述悬液纯化、富集或分离血小板的步 骤。12. 根据权利要求9-11任一项所述的方法，其中所述悬液是通过W下步骤获得的悬液： (i)提供巨核细胞祖细胞和/或干细胞； (i i)扩增所述巨核细胞祖细胞和/或干细胞； (i i i)将所述扩增的细胞分化成巨核细胞。13. 根据权利要求12所述的方法，其中所述巨核细胞祖细胞和/或干细胞选自造血干细 胞、胚胎干细胞和诱导性多能干细胞。14. 根据权利要求9-13任一项所述的方法，其中将所述巨核细胞悬液在进入生产室之 前均质化和/或纯化。15. 根据权利要求9-14任一项所述的方法，其中所述血小板在通道出口通过选自下组 的方法分炼:交叉流过滤、层流、介电电泳、光学力、磁力、声学力或惯性力。16. 根据权利要求9-15任一项所述的方法，其中所述血小板是可W如循环血小板一样 被激活的功能性血小板。
【文档编号】B01L3/00GK105980057SQ201480062983
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2014年11月18日
【发明人】D·巴吕什, A·P·M·布林, A·马涅, S·沙萨克, A·勒格夫, M·雷萨特
【申请人】普拉托德公司, 巴黎市工业物理化学学校