琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质及制备方法与应用

琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质及制备方法与应用
【专利摘要】本发明涉及一种琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质及制备方法与应用。琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质；其色谱介质是平均粒径50?170μm的琼脂糖凝胶颗粒，表面通过环氧基间隔臂引入聚乙烯亚胺接枝链，然后通过聚乙烯亚胺接枝链上的氨基与琥珀酸酐相结合，得到羧基离子交换容量为150?970mmol/L的琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质。本发明的琥珀酸酐修饰量的聚乙烯亚胺接枝介质或对蛋白质具有较高的吸附速率或对蛋白质具有很强的吸附特性，表现出了较高的静态吸附容量，且对盐浓度有较好的耐受性。介质清洗、除菌方便，易于再生，生物相容性好，制备方法简单、价格低廉，在蛋白质的分离纯化中将有广阔的应用前景。
【专利说明】
琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质及制备方法与应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质及制备方法与应用，属于生物
技术领域中的蛋白质色谱分离技术。
【背景技术】
[0002] 基因工程和重组DNA技术的发展促进了对重组或天然蛋白以及生物大分子如质粒 DNA和病毒样颗粒的需求。对于生物制药行业来说，核心问题就是向一个高要求和规范化的 市场提供这些新的治疗产品。虽然这些生物大分子的上游加工过程在产品产量方面取得了 明显的进步，但下游的生物加工和纯化过程依然制约着生物大分子的生产，需要加以简化 并降低生产成本。色谱技术尤其是离子交换色谱，因其分离精度高，设备简单，操作方便，广 泛用于生物大分子下游加工过程中。
[0003] 目前接枝型介质以其在高流速下仍具有高动态结合容量的特性而受到广泛关注， 成为近年来研究的热点。相较于传统的非接枝介质，接枝层的存在，能够使蛋白的吸附从二 维表面扩展到三维空间，提升了介质的静态吸附容量。同时接枝层内部存在的静电耦合，链 传递等传质机理能够极大的提尚蛋白质的吸附速率。
[0004] 聚乙烯亚胺是一种具有良好生物相容性的线性分支聚合物，其分支中伯仲叔胺的 比例为1:2: ULin-Ling Yu等人将适量的聚乙稀亚胺作为接枝链接枝到传统的色谱介质 上，获得了一种性质优良的具有高静态吸附容量和吸附速率的阴离子交换色谱介质 (Protein adsorption to poly(ethylenimine)-modified Sepharose FF:I.A critical ionic capacity for drastically enhanced capacity and uptake kinetics[J] ? Journal of Chromatography A，2013，1305(l):76-84),同时此介质在高盐条件下也有良 好的表现（Protein adsorption to poly (ethyl enimine )-modif ied Sepharose FF: II.Effect of ionic strength[J].Journal of Chromatography A,2013,1305(1):85-93)。为进一步扩展聚乙烯亚胺接枝介质在阳离子交换色谱中的应用，本发明利用琥珀酸酐 进一步修饰聚乙烯亚胺，使聚乙烯亚胺接枝介质转化为表面带有羧基基团的阳离子交换色 谱介质。通过调节琥珀酸酐的修饰量得到具有不同羧基离子交换容量的介质，该介质具有 高蛋白吸附速率或高静态吸附容量。制备工艺简单，生物相容性好，成本低廉，非常适用于 蛋白质的分离纯化过程中。

【发明内容】

[0005] 本发明的目的在于在聚乙烯亚胺接枝介质的基础上，进一步开发一种具有羧基离 子交换基团的琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝阳离子交换色谱介质。所述介质或能明显提 高蛋白的吸附速率，或能大幅提高蛋白的静态吸附容量，且可在较宽的盐浓度范围内使用。 介质制备方法过程简单，羧基离子交换容量可调节。
[0006] 本发明的技术方案概述如下：
[0007] 一种琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质；其色谱介质是平均粒径50-170WI1的琼脂 糖凝胶颗粒，表面通过环氧基间隔臂引入聚乙烯亚胺接枝链，然后通过聚乙烯亚胺接枝链 上的氨基与琥珀酸酐相结合，得到具有羧基离子交换基团的琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝 介质。
[0008] 本发明的琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质的制备方法;步骤如下：
[0009] 1)通过环氧基间隔臂在琼脂糖凝胶表面引入聚乙烯亚胺接枝链，然后将离子交换 容量为740mmol/L的聚乙烯亚胺接枝介质利用N，N-二甲基甲酰胺浸泡，直至将孔内溶剂完 全替换为N，N-二甲基甲酰胺；
[0010] 2)将步骤1)得到的介质加入到N，N-二甲基甲酰胺中，制备介质悬浮液，N，N-二甲 基甲酰胺体积用量为介质体积量的4倍；
[0011] 3)向步骤2)得到的介质悬浮液中加入琥珀酸酐，琥珀酸酐用量为0.0222-0.74g/g 介质；混合均匀后置于室温水浴过夜;然后依次用N，N-二甲基甲酰胺，乙醇和水冲洗介质， 制得琥泊酸酐修饰聚乙稀亚胺接枝介质。
[0012] 所述室温过夜条件优选为:25°C的恒温水浴，170rpm反应24h。
[0013]制得的琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质的羧基离子交换容量为150-970mmol/ L〇
[0014]本发明的琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质应用于蛋白质分离纯化。
[0015]本发明的琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质，结构示意表达式如下，但不代表真 实的配基比例及分布：
[0017]其中黑色树枝状接枝层为简化聚乙烯亚胺结构式，聚乙烯亚胺分子量（MW)为 1200-750000Da，结构式如下，
[0019]琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质应用于蛋白质分离纯化中，合适的羧基离子交 换容量能够提升蛋白质的吸附速率或宽盐浓度范围（20-150mol/L)内蛋白质的静态吸附容 量。
[0020]离子交换容量为740mmol/L的聚乙烯亚胺接枝介质已经证实具有良好的蛋白吸附 性會泛（Protein adsorption to poly(ethylenimine)-modified Sepharose FF:I.A critical ionic capacity for drastically enhanced capacity and uptake kinetics [J].Journal of Chromatography A，2013，1305(l):76_84)〇
[0021]本发明主要是琥珀酸酐用量的选择，合适的琥珀酸酐量有利于获得具有不同羧基 离子交换容量的琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质。
[0022]经实验证明，本发明的琥珀酸酐修饰量的聚乙烯亚胺接枝介质或对蛋白质具有较 高的吸附速率或对蛋白质具有很强的吸附特性，表现出了较高的静态吸附容量，且对盐浓 度有较好的耐受性。介质清洗、除菌方便，易于再生，生物相容性好，制备方法简单、价格低 廉，在蛋白质的分离纯化中将有广阔的应用前景。
【附图说明】
[0023]图1 :溶菌酶在实施例4中琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质和商品化SP Sepherose FF介质中的溶液溶度随时间的变化曲线；
[0024]图2:实施例5和实施例6所制备的琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质与商品化SP Sepharose FF介质在不同氯化钠浓度下(0、20、50、100、150mmol/L)对溶菌酶的静态吸附容 量。
【具体实施方式】
[0025] 下面的实例将对本发明的方法予以进一步的说明。
[0026] 实施例1
[0027] 1)通过环氧基间隔臂在琼脂糖凝胶表面引入聚乙烯亚胺接枝链，然后取5g离子交 换容量为740mmol/L的聚乙烯亚胺接枝介质利用N，N-二甲基甲酰胺浸泡，直至将孔内溶剂 完全替换为N，N-二甲基甲酰胺；
[0028] 2)将步骤1)得到的介质利用G3漏斗抽干后置于50mL锥形瓶中，然后向锥形瓶中继 续加入20mL N，N-二甲基甲酰胺，混合均匀，制备介质悬浮液；
[0029] 3)向步骤2)得到的介质悬浮液中加入0. lllg琥珀酸酐，混合均匀后置于25°C的恒 温水浴，170rpm反应24h，之后依次用N，N-二甲基甲酰胺，乙醇和水冲洗介质，获得羧基离子 交换容量为150mmol/L的琥泊酸酐修饰聚乙稀亚胺接枝介质。
[0030] 实施例2
[0031]将实施例1中琥珀酸酐的加入量变为〇.2294g，其他条件不变的情况下，获得羧基 离子交换容量为240mmol/L的琥泊酸酐修饰聚乙稀亚胺接枝介质。
[0032] 实施例3
[0033]将实施例1中琥珀酸酐的加入量变为0.296g，其他条件不变的情况下，获得羧基离 子交换容量为270mmol/L的琥泊酸酐修饰聚乙稀亚胺接枝介质。
[0034] 实施例4
[0035] 将实施例1中琥珀酸酐的加入量变为0.37g，其他条件不变的情况下，获得羧基离 子交换容量为350mmol/L的琥泊酸酐修饰聚乙稀亚胺接枝介质。
[0036] 实施例5
[0037]将实施例1中琥珀酸酐的加入量变为0.555g，其他条件不变的情况下，获得羧基离 子交换容量为570mmol/L的琥泊酸酐修饰聚乙稀亚胺接枝介质。
[0038] 实施例6
[0039] 将实施例1中琥珀酸酐的加入量变为3.7g，其他条件不变的情况下，获得羧基离子 交换容量为970mmol/L的琥泊酸酐修饰聚乙稀亚胺接枝介质。
[0040] 实施例7
[00411 将实施例4中介质用20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8)平衡后，经G3漏斗抽干后称 取0.3g加入100mL含有lmg/mL的溶菌酶的相应平衡缓冲液中，上述介质悬浮液置于25 °C恒 温水浴，搅拌速度为280rpm，通过实时在线检测蛋白质溶液在280nm下的吸光值，从而确定 蛋白质溶液浓度随时间变化的曲线，求得蛋白质在介质中的传质速率，用有效孔扩散系数 与溶菌酶在自由溶液中扩散系数的比值(D e/D0)来代表。在实验条件下下，介质的De/D0值为 0.64±0.03。
[0042]将商品化介质SP Sepharose FF用20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8)平衡后，经G3 漏斗抽干后称取〇.3g加入100mL含有lmg/mL的溶菌酶的相应的平衡缓冲液中，上述介质悬 浮液置于25 °C恒温水浴，搅拌速度为280rpm，通过实时在线检测蛋白质溶液在280nm下的吸 光值，从而确定蛋白质溶液浓度随时间变化的曲线，求得蛋白质在介质中的传质速率，用有 效孔扩散系数与溶菌酶在自由溶液中扩散系数的比值(D e/D〇)来代表。在实验条件下下，介
[0043]溶菌酶在琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质（实施例4)和商品化SP Sepharose FF介质中的溶液溶度随时间变化的曲线如图1所示。
[0044]由结果可知，在上述实验条件下，琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质(实施例4)对 溶菌酶的吸附速率是商品化介质SP Sepharose FF的5.33倍。这说明合适的琥珀酸酐修饰 密度的聚乙烯亚胺接枝介质能够显著提升蛋白质的吸附速率。
[0045] 实施例8
[0046]将实施例5中琥珀酸酐修饰的聚乙烯亚胺接枝介质分别用含有不同浓度（0、20、 50、100、150謹〇1/1)的氯化钠的20111111〇1/11^8-11(：1缓冲液化118)平衡后，再将63漏斗抽干 的〇.〇5g平衡后介质分别加入到5mL用平衡缓冲液配制的含有不同浓度的溶菌酶溶液中，上 述介质悬浮液置于25°C，170rpm恒温水浴震荡24h后，离心收集上清液在280nm下测吸光值， 通过物料衡算确定蛋白质在介质上的吸附量。在0_150mmol/L氯化钠浓度下，介质的静态吸 附容量为101_307mg/mL。
[0047]将实施例6中琥珀酸酐修饰的聚乙烯亚胺接枝介质分别用含有不同浓度（0、20、 50、100、150謹〇1/1)的氯化钠的20111111〇1/11^8-11(：1缓冲液化118)平衡后，再将63漏斗抽干 的〇.〇5g平衡后介质分别加入到5mL用平衡缓冲液配制的含有不同浓度的溶菌酶溶液中，上 述介质悬浮液置于25°C，170rpm恒温水浴震荡24h后，离心收集上清液在280nm下测吸光值， 通过物料衡算确定蛋白质在介质上的吸附量。在0_150mmol/L氯化钠浓度下，介质的静态吸 附容量为 217-280mg/mL。
[0048] 比较：将商品化介质SP Sepharose FF分别用含有不同浓度（0、20、50、100、 150mmol/L)的氯化钠的20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8)平衡后，再将G3漏斗抽干的0.05g 平衡后介质分别加入到5mL用平衡缓冲液配制的含有不同浓度的溶菌酶溶液中，上述介质 悬浮液置于25°C，170rpm恒温水浴震荡24h后，离心收集上清液在280nm下测吸光值，通过物 料衡算确定蛋白质在介质上的吸附量。在〇-150mmol/L氯化钠浓度下，介质的静态吸附容量 为64_216mg/mL。
[0049] 琥泊酸酐修饰聚乙稀亚胺接枝介质（实施例5和实施例6 )与商品化介质SP Sepharose FF在不同氯化钠浓度下对溶菌酶的静态吸附容量如表1所示，相应的静态吸附 容量随盐浓度的变化曲线如图2所示。
[0050] 表1介质在不同氯化钠浓度下对溶菌酶的静态吸附容量(mg/mL)。
[0052]由结果可知，在上述实验中的氯化钠浓度下，琥珀酸酐修饰的聚乙烯亚胺接枝介 质（实施例5和实施例6中介质)对溶菌酶的静态吸附容量及其对盐浓度的耐受程度均高于 商品化介质SP Sepharose FF。这说明合适的琥泊酸酐修饰密度的聚乙稀亚胺接枝介质明 显提高了蛋白质的静态吸附容量。
[0053]本发明提出的琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质在提高蛋白质的吸附速率或静 态吸附容量中的应用，已通过现场较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱 离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现本发 明技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见 的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。
【主权项】
1. 一种琥泊酸酐修饰聚乙稀亚胺接枝介质;其特征是色谱介质是平均粒径50-170μηι的 琼脂糖凝胶颗粒，表面通过环氧基间隔臂引入聚乙烯亚胺接枝链，然后通过聚乙烯亚胺接 枝链上的氨基与琥珀酸酐相结合，得到具有羧基离子交换基团的琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺 接枝介质。2. 权利要求1的琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质，其特征是琥珀酸酐修饰聚乙烯亚 胺接枝介质的羧基离子交换容量为150-970mmol/L。3. 权利要求1或2的琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质的制备方法;其特征是： 1) 通过环氧基间隔臂在琼脂糖凝胶表面引入聚乙烯亚胺接枝链，然后将离子交换容量 为740mmol/L的聚乙烯亚胺接枝介质利用N，N-二甲基甲酰胺浸泡，直至将孔内溶剂完全替 换为N，N-二甲基甲酰胺； 2) 将步骤1)得到的介质加入到N，N-二甲基甲酰胺中，制备介质悬浮液，N，N-二甲基甲 酰胺体积用量为介质体积量的4倍； 3) 向步骤2)得到的介质悬浮液中加入琥珀酸酐，琥珀酸酐用量为0.0222-0.74g/g介 质；混合均匀后置于室温水浴过夜;然后依次用N，N-二甲基甲酰胺，乙醇和水冲洗介质，制 得琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质。4. 如权利要求3所述方法，其特征是所述室温过夜条件为:25 °C的恒温水浴，170rpm反 应 24h。5. 琥珀酸酐修饰聚乙烯亚胺接枝介质应用于蛋白质分离纯化。
【文档编号】B01D15/32GK106000364SQ201610348043
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月24日
【发明人】孙彦, 赵洋洋, 余林玲, 董晓燕
【申请人】天津大学