一种操作单个细胞及其小团块的方法与仪器的制作方法

专利名称：一种操作单个细胞及其小团块的方法与仪器的制作方法
技术领域：
本发明涉及篩选与修饰如单个细胞、微生物及其小团块这样的颗粒的技术。这种方 法学及其相关仪器的应用领域可以是生物技术领域，例如包括在不同化学物质存在的条
件下，监测细胞间相互作用的产物；可以用在医药领域，如检测对免疫控制细胞进行新 刺激后，免疫系统如何应答；可以用在工业生物领域，本发明的方法和仪器可以修饰细 胞和细菌，并从中进行筛选，从而从庞大样本量中提取出那些具有巨大工业价值的细胞 和细菌。
背景技术：
多孔板是进行微量生物或化学实验所使用的传统支持物，也叫微量滴定板。在这个 平板上的每个孔都能容纳化学和生物材料，但它对其中的整个操作没有任何积极的作 用。目前在一个板上可以同时具有超过一千个的孔。在前述的应用领域中，人们越来越 感觉到需要具有以积极的方式干预生物材料如单个细胞或细胞团块的能力，。目前，只 有少量的方法可以获得这种结果。
在专利US6716629中描述了使用具有大量平行孔的板检测、合成和储存的仪器及 其制造、操作和应用方法。该专利阐述了如何通过选择合适材料和相对表面特征来优化 微孔板设计。由于其中没有整合传感器和操作机构(actuator),使其与本发明的装置 相比没有竟争力。
其中，Caillat等在专利《分离和筛选生物对象的微型装置的应用及所使用的方法》 (EP1390467A1 )中提出创造孔的目的在于检测孔中生物材料的发育。该文件讲述了如 何制作附着支持生物实验材料的孔，这些实验材料可以用测量电极进行分析。该装置有 许多局限性不能控制孔中所含颗粒位移(displacement),也不能控制象细胞这样中 等大小的对象，其测量被限制于肉眼可见的类型。特别是会发生孔中细胞的沉积位于不 能进行分析检测区域的问题。更甚的是，该装置不能让单细胞进入确保它们接触的位置。 不幸的是，具有免疫学重要性的细胞间的相互作用是通过细胞壁之间的接触介导的，这 样使这种研究不可能进行。而且，接近底部的细胞不允许改变细胞生长的上清液 (supernatant),比如去除代谢的残留物。最后该装置不允许施加产生电穿孔和电融合 所需要的电压。专利US6610188《一种用于产生笼形电场的电极排列》提出可以用介电泳来操作流 体中的颗粒。在该专利文件中，提出了具有特殊性质的电极结构，它可以按照产生的电 场形成介电笼(dielectrophoretic cages )。这种排列有多方面的不足1)电极结构 复杂，其生产需要校正程序，因此增加成本，减少产量；2)介电笼被设计为紧密结构， 其会阻碍对发现颗粒的上清液进行改变；或者被设计为流体内形成的电场。在后者这种 情形下，研究相互接触颗粒的相互作用是不可能的；3)检测程序在适当移动这些颗粒 方面没有优势。该文件为检测流体内材料的阻抗性质提出了不同的方案。通过阻抗变化 来检测细胞的性质，可以以《电容细胞计数仪逐个检测生物细胞》(PNAS, vol 97， 10687-10690, 2000 )作为参考文件。这个文件证明由单个细胞引起的电容变化是可 以测量的。但是，将阻抗测量与控制分析实验材料的移动结合起来的要求仍然无法实现。 这个缺陷严重影响了测量的质量。
在专利US6942776《通过介电电泳处理颗粒的方法与仪器》中，G. Medoro提出了 电平台可以制造一个陷阱，该陷阱可以捕获甚至置换其中被捕捉的颗粒，也可以通过嵌 入的传感器检测被捕获颗粒的性质。大体上，这个方法将捕获与随后的对细胞或颗粒的 操作整合在一个单独的平台上了。这个技术的缺点与创造一个封闭腔体的要求有关，捕 获过程就发生在这个腔体中。氧化捕获的细胞变得困难。而且，如果不以腔体作为整体 来改变的话，研究者不能仅改变颗粒所在的流体组分。最后，单个的腔体结构只能提供 有限的进入管道，这不能让足够的装置进入目标化学或生物反应发生的空间。
在《抗癌治疗的多细胞球型传感器》(Thielecke et al， Biosens. Bioelectron.， 2001, 16， 261-9 )中讨论了药物或其他化合物存在下，生物组织的发育。这项工作说 明监视小的有机组织样本是可以的，因此从诊断和治疗的观点看，这个现象是有用的。 但是，所用的微流体系统是相当复杂的，由于对位置的控制不够，不能有目的进行细胞 与细胞相互作用。该方法不能放大到大量样本平行检测所需的水平，但是通过花巨大精 力来优化流体系统，并行;险测几打样品是可以处理的。
并且也希望其具有进行修饰微生物的遗传物质操作的能力，例如，通过在孔中进行 电穿孔，或2个或多个细胞融合来共有遗传物质。单个细胞电穿孔是非常吸引人的方法， 因为需要在其中51入新的遗传物质来修饰细胞的或者细菌的DNA。例如《初级上皮细胞 电穿孔芯片》(Sensors and Actuators, A, Vol 108, 2003 pp 12-19)描述了在真核 细胞中插入DNA的方法。就细胞有效突变率和细胞存活率而言，该方法的效率使得该技 术是非常吸引人的。该专利具有将大量单个细胞定位在可以穿透它们的电极前的能力，从而拓展了细胞电穿孔技术。并且，对更为复杂的方案来说特别重要的是，该专利教我 们如何用一种可控的方法来融合几个微生物细胞。专利申请号为US 7018819 B2的专利 告诉了我们控制单个细胞融合的重要性和其方法。该专利证明仪器可以将接触的单个细 胞配对，并对其施加合适的电压，达到将它们融合的目的。所述技术对应用而言需要特 别复杂的细胞定位，使其不能被放大到细胞群，这也使在本案中描述细胞定位技术成为 可能。

发明内容
上文中所介定的问题在本发明中通过孔，包括多个孔的平台以及本发明的方法得到 解决，特别是所述的微孔适于操作和/或检测的材料尤其是生物材料，如悬浮在孔中液 体中的颗粒(包括细胞、微生物、它们的聚集物、片段，和其他类型的材料，包括脂质 体)。所用孔和平台与所附独立权利要求一致。
所附的从属权利要求内容限定了本发明的详细内容(particular)。 本发明的孔能够容纳生物材料，且能利用合适的管道系统，从一种或多种液提源中 通过抽吸而改变其中浸没颗粒的上清液； 一组电极被定位于孔中，它们具有准确移动个 体或小群颗粒的功能，以使它们互相接触，例如，通过将它们定位在检测电极前以检测 移动到检测电极前的颗粒所产生的阻抗变化。所述电极，特别是检测电极，能够施加相 对较高的电压，来诸导特定的目标现象，如电穿孔和细胞融合。


图la:本发明的一个实施例中的孔，该孔沿A-A'(如图lb和ld所示)的剖面图， 其中安装有3个环形电极；
图lb :图la中电极1的剖面B-B'的俯视图； 图lc:图la中电极2的剖面C-C，的俯^f见图； 图ld:图la中电极3的剖面D-D'的俯视图2:装满液体的孔的排列及疏水处理表面后所形成的新月面的排列图； 图3:充满液体的孔的倒置图(倒置)，细胞在气液界面积累； 图4a:图la:本发明的一个实施例中的孔，该孔沿A-A，(如图4b和4c所示)的 剖面图，其中安装有2个环形电极；
图4b:图4a中电极31的剖面B-B，的俯视图；图4c :图4a中电极32的剖面D-D'的俯视图5:如图4所述具有2个环形电极孔沿A-A'剖面的场强分布图。对电极31和32 所施加的电势是具有相同振幅，相位差18 0度的正弦电。
图6:直径90微米的聚苯乙烯球插入直径300微米具有图4所述结构的孔；施加 15伏峰值的正弦极化电压，可以将聚苯乙烯球保持在图5中所示的电场最弱的地方；极 化电压消失后，由于比水重聚苯乙烯球下沉。
图7:图1所述具有3个环形电极孔沿A-A'剖面的场强分布图。对电极1, 2和3 所施加的电势是具有相同振幅，电极l, 3相位与电极2相差180度的正弦电。
图8a:本发明的又一实施例中的孔，该孔沿A-A，(如下图8b和81c所示)的剖 面图，安装有两个相对的马蹄形电极和一个环形电极；
图8b:图8a中电极33的剖面B-B'的的俯视图8c:图8a中马蹄形电极34和35的剖面D-D'的的俯视图，其中马蹄形电极34, 35彼此分开；此案例中，可以对电极施加不同的电势；
图9:具有图8所述结构的孔，沿该孔A-A'剖面的场强分布图。对电极34, 35施 加的电势是相同振幅，相位差180度的正弦电，电极33接地；
图10a:本发明的又一实施例中的孔，该孔沿A-A，(如下图10b到10d所示)的 剖面图，安装的是马蹄形电极；
图10b:图10a中电极36和37的剖面B-B，的俯视图10 c :图10a中电极38和39的剖面C-C，的俯视图，特别是不排除，图10a 所示的实施例可以采用测量电极。
图10d:图10a中电极40和41剖面D-D，的俯视图11:图10中所示结构的孔沿其剖面A-A'的电场模式图，此案例中对电极36-41所施加的电势分别与对电极37 - 40所施加电势的相位相同，对36-41这对电极和 37-40这对电极所施加电势的相位相差180度；
图12:图IO所示的孔结构施加图11所述极化电压的稳定电场表面。所述表面指的 是电场最弱的地方，并将其称做介电笼；
图13:插入到图10a所述结构孔中的两个颗粒22和23进行负电泳的排列图。
图14:两个直径90微米的聚苯乙烯球插入直径300微米的孔中，在电极38和39 的极化电压作用下径向排列。参照的结构如图10a和10c所示。
图15:根据本发明的一种平台中电极排列的结构图16:才艮据本发明的一种平台，电极排列的结构特别是检测电极(也叫传感器)。 图17:管道10的实施例的俯视图，前述图片中的14孔加入的液体可以按控制方式 流入管道IO中；
图18:上清液置换过程中检测到的阻抗变化图
图19:介电泳(DEP)刺激下钩黄绿素标记的稳定性图，为检测电解质处理不会改 变荧光信号，将负载有钙黄绿素的类原始淋巴细胞系(LCLs )放在前后滑动机构 (SmartSlide)和介电泳排列(DEP-Array )上，并加以100MHz的电流如图所示，随着 时间的延长，荧光强度基本保持恒定。在前后滑动机构平台上每分钟检测的荧光信号来 自12 5个细胞。在介电泳排列平台上每分钟;f全测到的焚光信号来自9 5个细胞。
图20:钩黄绿素标记的类原始淋巴细胞(LCLs)与非洲淋巴细胞瘤病毒(EBV )肽 (左边板)和不加非洲淋巴细胞瘤病毒肽的对照类原始淋巴细胞分别与细胞溶解性t淋 巴细胞(CTL)反应15分钟。分离细胞混合物，将其悬浮在甘露醇緩冲液中，通过介电 泳排列使其分布开接着检测0到12分钟的荧光信号箭头指示的是那些不含类原始 淋巴细胞的细胞混合物。只有在发生类原始淋巴细胞特异性溶解的地方，荧光信号在第 12分钟消失；而对照荧光信号不会消失(右边板)。
图21:图A表示由于LCL溶解引起荧光信号衰减的柱状图，加入EBV肽类原始淋 巴细胞和不加EBV肽的类原始淋巴细胞，与CTL 一起孵育15分钟和30分钟，分别在甘 露醇緩沖液中进行介电泳排列分离。柱状图A以0时为参照，图B中的曲线以时间为X 轴。黑色阳性LCLs (加入EBV肽类原始淋巴细胞)，白色对照(不加EBV肽类原始 淋巴细胞)。
本发明的优选实施方式
细胞功能选择是免疫和生物技术研究的关键点。这个问题的研究源自既可以通过细 胞生物化学性质选择细胞，如存在特殊的细胞膜受体，也可以基于所研究的特殊环境下 的细胞行为进行功能选择。在后一种情况下，细胞功能筛选不需要复杂的预先鉴定，只 需要准确的介定所期望的性质。功能选择的问题也是用定向进化(direct evolution) 技术生产具有人们所期望性质微生物的关键步骤。这种途径是基于用大量随机方法对微 生物遗传材料进行改造的能力，然后从不同样品中筛选，以产生更有前景功能的微生物。 典型的筛选参数包括如在与正常条件不同的PH值环境中生存的能力。这种条件下，可 以通过緩慢改变pH值的方法，看哪些微生物可以存活来进行简单的筛选。更复杂的条件是仅仅通过破坏非存活微生物不能获得筛选的条件。由此举例，微生物产生目标物质 的能力需要一个检测方法。此处推出的仪器能够通过如下方式进行筛选通过检测可测 定的参数如阻抗的变化来进行筛选，或将在并联的孔中通过介电泳，特别是负介电泳 (DEP )移动单个细胞的能力与其他随后将要讨论的已知分析方法整合在一起进行筛选。 根据本发明的装置可以被用于执行不同的功能，这将在下文中进行列举和叙述。
为了便于理解所述的仪器，接下来叙述该仪器的工作原理，它利用介电泳原理使颗 粒移动(也叫激活)。由于该发明可以通过不同的方式实现，因此将从最简单的实施例 到最复杂的实施例进行讨论，从而可以得到在灵活性和易于得到所要产品之间折中的不 同方案。
通常在空间变化的电场能在液体中创造介电泳效应。特别感兴趣的现象是，电泳效 应担任推动颗粒朝低电场强度的区域移动驱动力的角色。这种现象被称作负介电泳，而 且当采用高电导溶液如生理学上的溶液时，这种现象非常重要。总的来说，当目标颗粒 或细胞比水重时，这个力量能抵抗颗粒沉降的趋势。例如，通过平衡介电泳和重力，颗 粒就会^f皮限制在孔中的特定位置。
系统结构与操作
参考图la,根据本发明的孔14沿随后的图中所示的A-A， 的剖面图。首先，可以 看到喷嘴13,用于加入含有目标材料的液滴。这个喷嘴构成能沉积单个细胞或颗粒的仪 器的一个部分。这种仪器为单细胞沉积(single cell exposition)领域所熟知。这样 的商业产品也存在，它可以使液滴沉积，能够确保液滴中存在至少一个所期望类型的细 胞或颗粒。这种针对生物材料的沉积系统市场有售，如DakoCytomation公司和Becton Dickinson公司，它可以沉积从不同容器中取出的实验材料，因此促使不同的细胞和/ 或颗粒出现在相同位点。沉积作用得到几微米等级的几何精度。
该仪器能够沉积孔14中的材料。确定孔12边限的内壁103用合适的材料做成。如 果加入孔中的液体是水溶液，则内壁103优选是亲水性材料，如果加入的液体是含脂的， 则内壁103最好用疏水材料。在孔里面，电极1, 2和3彼此面对面，用绝缘材料8构 成。这些电极能对孔中的液体施加合适的电势，最好是时间变量电势。本发明的具体实 施例中的孔，在下端能与管道10连接，且可以是开放的或半封闭的类型。在后者情况 下，半透膜9使下面的液体与孔分离，通过施加于管道10末端的压力差使液体流出。 如果孔是开放型的，半透膜可以被去掉。根据本发明的一个可能的实施方式，管道10 也可以用生物相容性材料和透明材料制造。如果孔是整个平台或微量滴定板的一部分，且孔与基质有机结合在一起，管道10就可以与一排孔相连，也可以与一组排孔相连。 在管道10种使用的材料应是便于液体通过的亲水或疏水材料，这样优选使壁与孔内壁 103具有相同的性质。如果该结构的基座11是透明的，可以对该装置的基座进行光照， 从而使孔中的内含物被照亮。即使在半透膜存在下，该性质也会被保留。
管道10可以用传入孔和管道10的东西填满孔和管道10 。所述管道的典型实施方 式如图18所示。当需要的时候，可以在管道IO的进口 16和出口 17施加微小的压力差。 这个压力差可以使液体流动，从而可以使材料从入口 16运送到孔14或从孔14运送到 出口17。如图la所示，孔具有合适的亲水或疏水内表面，因此液体在毛细作用推动下 可以达到有效空间的上缘105,可以将整个孔液封。根据一个优选的实施方式，所述孔 可以是圓柱形的，所述孔有一个上部结构，该上部结构具有壁12。优选壁12具有与限 定孔的内壁103 (即限定容纳液体空间的壁)的材料性质相反，也就是说，如果内壁是 亲水性质的材料则壁12就是疏水的，反之亦然。上部结构的壁最好有从孔的内壁开始 逐渐变宽的横切面，而且如果孔中容纳液体的部分具有圓柱形，则上部结构应是圆锥状 的。液面稳定在具有前述的性质的上部结构的壁12的表面处。才艮据可能的实施方式， 即使没有前述逐渐增大的切面部分，只要与孔内壁相连的孔外壁具与后者有相反的性质 也能满足。这种效果如图2所示。图2显示孔排列的图，由于含有水溶液的孔的外部表 面进行疏水处理，且内壁是亲水的，每个孔中装的液体形成一个新月面。完整的描述如 下，简单起见，如果需要，假定所研究的液体是水溶液，其中溶解有适当的化合物。如 果液体是油性的，孔14的内表面和孔外部的12对应的分别是疏水的和亲水的。
当孔满的时候，对位于孔中的电极l， 2和3施加电势，从而获得所需要的现象。
如果需要对多个孔进行多个并行的操作，需要这些孔在普通的平台或微量滴定板上 有序排列。优选的孔排列实施方式是二维排列，其中孔通过横排和竖排排列。下面详细 解释他们被独立激活的方式，设计一对编码给横排和竖排进行编号，再看该孔属于哪一 横排和竖排，就可以明确确定该孔。
本发明的仪器也适合于细胞系在前述的孔中生长。沉积在孔中的细胞生长为细胞 系，并在孔中对其进行处理。长时间将细胞置于电场中经常是不恰当的，因此，本发明 的一个可能的实施方式含有一个半透膜9，当撤去所施加的电压的时候，半透膜9可以 阻止细胞落入管道IO。通过这种方法阻止细胞向下流入管道，并且通过抽吸将细胞移出 孔。颗粒特别是细胞或微生物可能会翁附在半透膜9上。根据本发明的不同实施方式， 不供给半透膜，且孔的底部直接与管道10相通。如果需要，所述溶液也能使细胞通过管道10流出。本发明也涉及利用这些孔或平台的方法，包括我们称做直接和倒置两种 不同配置的系统利用方式。第一种配置方式是上面描述的一种，且只用于在孔中操作， 加样和/或检测这些步骤。第二种配置方式是将整个仪器倒置，孔口向下。在细胞重于 水的情况下，细胞沉积在气液界面上，并且不需要膜支持也能保持在气液界面。这种情 况下，再次翻转整个仪器，使其回到最初的配置状态。这种操作方法如图片3所示，充 满水溶液的孔的倒置图，液体不会掉下来是因为外部表面12的疏水性。肉眼可见的深 色点代表K562细胞位于气-水界面上。
很明显，在倒置的配置方式中，被定义的孔上口位于比较低的位置，但是为了简便 起见，经常仍称之为孔上口。明显也可以叫下口。本发明的这种方法特别适合于在直接 配置方式中操作电极，便于悬浮颗粒；而在倒置配置方式中，产生的电场可以暂停，以 避免应力对他们的潜在危险，尤其是如果处理的是细胞或微生物，在没有半透膜的情况 下不允许颗粒落入管道时，或出现教附的情况，或者翁附在其它地方，这种配置方式更 适合。
可以通过如下的例子来制备孔 一层绝缘材料8，厚度可以从1微米到几百微米不 等，用微系统工业中常用的材料制备，如聚酰亚胺，Kapton或Pyralux;绝缘材料8将 电极隔离开。电极包括优选由生物相容性金属如金或铝制成的导电片1, 2和3,厚度为 几个微米级或等于一定百分比的孔深度。这些金属层依次包裹上其他的材料，使其具有 所要求的疏水性，例如靠上的在电极l上裹上疏水材料，尤其在没有开头所描述的上部 结构时。这种结构整个孔是开放的，意于形成实际的孔，适合接收液体。孔壁可以进行 处理以使其具有所需要的亲水性。
利用普通的钻孔技术例如机械或激光可以给孔14开合适直径的通孔。根据本发明 的可能实施方式，为应用的需要，孔的直径，可以是30到150微米，最好是50到100 微米。上部结构的孔可以是圆锥形或金字塔形，亦或是其他所需要的合适形状的孔，可 以通过已》口的冲支术来帝J造，^口才几才戎4占孑L ( mechanical boring )或喷并分力口工才支术(powder blasting)。上层7采用合适的绝缘实验材料如硅，在合适的条件下进行处理以使网状 壁具有疏水性。如果材料是硅，壁12上的孔可以用各向异性腐蚀技术来开，尤其所需 形状是金字塔形的时候。整个孔也可以用喷粉加工技术获得。上面所述的制造技术特别 适于平台的制造，来减少或消除精度问题。例如，绝缘层8可以通过嵌入导电盘来形成 电极，或连在一起的电极组(它们是包括所有孔或带的连续盘，所述的带涉及基质结构 中的一排或一列的孔，或者所述带相对于连接在一起的一系列电极的高度不同，且是通过垂直接触的方式连在一起的(图15中的108)以避免不同排列之间的接触，以保证必 要的连接，尤其在基质结构中)，然后进行钻孔。根据可能的实施方式，用绝缘材料8 与导电盘以及上层7—起成型，然后用一种或多种不同的恰当的技术进行开孔。否则绝 缘层8和上层7的孔要分别成型，再用合适的方式装配起来，这需要准确的校准。这个 装置产品非常简单，不同位面之间不需要任何校准，尤其电极通过钻孔操作一起制作。 这是其优点，图lb, lc和ld中突出显示，分别显示了图la中所定义的B-B， ， C-C， 和D-D剖面，电极l, 2和3的形成是重点。
本发明孔的不同实施方式是可能的，下文的描迷参考附图。考虑到结构和其他性质， 前述的图la, lb, lc和ld可以作为对照。
更简单的变形如图4a所示，其中只有电+及31和32。
如果对下面的电极32施加正弦电压，而上面的电极31电压为0,或者相对另一个 来说施加反相的正弦电压，就会获得有两个最小固定电场结构，分別位于两个电极的中 央区域。图5用不同颜色说明了场强的分布模式。通过观察图5很容易解释电场的结构 1)电场沿中轴线101对称，且具有与对称轴垂直的0分支(zero components) ; 2) 在两个电极之间都有一个强加电势形成的电场分支；3)两个电极所包含的区域，电场 强的地方具有减小与对称轴垂直电场的重要作用。在这些情况下，两个电极之间的区域， 由于得益于场强的减少和特别是创造了 一个最小的相临空间。这种类型操作的一个案例 如图6所示，其中90微米直径的聚苯乙烯球被保持在加有15伏峰值电压的300微米直 径孔中的上述电场最弱的区域内。如果没有极化电压，由于聚苯乙烯球比水重，它就会 落下。图5中的箭头显示了作用在颗粒上的电场力的方向，它是负电泳与重力的共同作 用的结果。位于上面电极的电场最弱的区域特别适于用作悬浮并捕获颗粒的电势笼，而 下面的电场最弱的地方开向孔底，促使颗粒下沉。
一种稍微复杂的操作机构的结构如图la所示。在此案例中， 一个水平的绝缘金属 被加入到前述结构终。电极l, 2和3的成型不需要考虑其精度。它们的结构如图lb, lc和ld所示，这些图分别代表图la中所定义B-B， ， C-C，和D-D，的剖面图。假定正 弦电压将上面的电极1和下面的电极3极化，而电极2用反相的正弦电压极化，在此情 况下，分析显示在中间电极的中央区域又有一个非常重要的电场最弱区域。在此情况下， 就会产生能够捕获被负介电泳控制颗粒的电场结构。
与前述案例相反，闭合的介电笼封闭在上端和下端分别包住中央电场最弱的区域。 其用数字模拟的电场结构如图7所示。其他驱动电极的方案可以产生相同的结果，例如将中间电极保持在0电压，并给其它电极两倍的电压。
根据可能的操作方法，加入颗粒需要以下步骤1 )上面电极和中央电极加上相同 的电压，且电压相位与下面的电极相反；在此步骤中，如果加入的颗粒比水重，它会下 沉到中间电极附近的电场最弱的地方。2)将施加在上面电极上的电压的相位反转；这个 变化具有两个效果关闭中间电极附近的介电笼，并创造一类此结构的制动器来阻止释 放更多颗粒，如果释放出来将被上面电极制造的电场最弱区域所捕获。
如果半透膜不存在，从孔14中放出颗粒可以通过去除施加在电极上的电压来简单 实现。在此情况下，颗粒通过重力离开孔14，如果有管道IO,则进入管道IO。这种方 法被典型应用在释放孔中所含的所有颗粒。下面介绍基质结构中的目标技术，选择性释 放目标孔中的颗粒。
如果操作的颗粒具有生物相关性，所有施加的电压彼此相位相反，平均值为0以降 低所产生的伤害，从而减小颗粒所在电场的最大值，都是合适的。
前述结构使所产生的电场结构沿孔中轴对称聚集颗粒。这可以避免颗粒勒附在孔壁 上。在一些情况下，可以产生将颗粒捕获在预先定义的电极附近的区域或预想结构的附 近区域的电场结构。
下文所描述的实施方式中的孔，具有使颗粒陷入孔中定义区域的性质，例如对照电 极附近。
在图8a中形成电极的两个金属层中间插入一层绝缘材料所形成的结构作为参照。 电极34和35象共面盘一样形成，对着孔的内壁，每个形成的边缘都是孔横切面周长的 一部分。上述边缘关于孔对称。该结构的形成非常筒单，因为不需要在上电极33，下方 的电极34和35,以及孔14之间进行任何校准，所形成的结构与上述方式一样。只需要 校准孔14和如图8c所示的分隔电极34和35的区域，如图8a定义的D-D'剖面图所示。 上电极33如图8b所示那才羊形成，如图8a定义的B-B'所示。
通过对触点电极34和35施加电压相同，但具有180度相位差的正弦电压，同时将 33接地，所得电场会具有下述得类型的分布
1) 在触点34和35之间的环形区域，场强在触点附近有一个非常高的值，电极间越 远的中央区域场强越低。
2) 在电极33里的环形区域，距离触点越近，场强越小。
3) 在圓柱形区域14，离側面越近场强越大，越向结构中央移动场强越低。 因此产生的场强梯度如图9所示。用这种方法创造的介电场具有从电极34 - 35到电极33的直接电场力，该电场力可以对抗重力。这种力场的性质是促使颗粒进入位于 孔壁的低电场强度的区域。颗粒所在的准确位置由重力与介电力的平衡决定。
能将孔中的颗粒定位于一个非常准确的区域的电极结构可以通过图10a, 10b, 10c 和10d所示的结构制造。这种情况下上面的电一及36和37与下面的电^及40和41以相似 的方式彼此分开，结构象图8a中的下电极34和35 —样，因此可以对两个电极施加不 同的电压。所述电;f及如图10b和10d所示，该图为定义在图10a中的轴B-B，和D - D' 的剖面图。优选结构还具有一对电极38和39,定位于与孔的轴垂直的面上，并平行于 分开电极对36-37和40-41的面。所述电极如图10c所示，该图为图10a中定义的轴C-C' 所在的剖面。
现在，选择对电极36和37施加一对平均值为0，等震幅并相互反相的正弦电压， 施加在电才及36上的电压的相位和震幅与施加在电才及41上的电压相同，且施加在电极37 上的电压的相位和震幅与施加在电极40上的电压相同，审查图ll可使这个装置的操作 方法逐渐清晰。图11所示的剖面沿图10b, 10c和10d中的A-A，。为了适于应用，电 极36和40之间的区域，36和37之间的区域，以及37和41之间的区域，与液体接触 是一样的，即使这样在任何情况下都可以根据需要采用其它可能的实施方式。图中箭头 表示电场的模式。特别是，电极对36， 37和40， 41相对的区域电场高。由于电极36, 40之间的距离和电极37, 41之间的距离与电极36, 37之间的距离和电极40， 41之间 的距离是一样的，因此在这些后两个区域也存在一个重要的电场。距离中央区域越近， 电势线抵消的越多，因此电场自身减少了电场强度，并在孔中央制造了一个场强为0的 点。由于对称的原因，沿图ll所示剖面的水平轴，且通过该结构中心点的场强为0。在 图12中这种效果是明显的，其中具有恒定电场强度(交替的)的面102是前述结构的 物理模拟的结果。结合以上所述，因此这个区域具有可以捕获孔中颗粒的性质。
请注意，通过改变场强，作用于颗粒的介电力强度会发生变化。例如，假如颗粒的 比重大于水，而具有在孔中下沉的趋势，施加在电极40和41的电压可以调节，而施加 在电极36和37上的电压是恒定的，比如O,因此如果在粘滞流体中所述电压变化比颗 粒运动的时间常数慢，颗粒会在孔的垂直方向上进行交替直线运动。这个观察结果对传 感器应用具有非常重要的意义，将在下文阐述。
综上所述，因此通过调节电压可以在装置的中央区域制造一个场强为0的地方，此 时颗粒受介电泳和重力作用来决定它们的位置。这个区域长度等于孔14的内径，且垂 直于孔14中部的A-A，平面。在许多情况下，考虑如何创造闭合的介电笼是有用的，利用此介电笼可以使上述一 维最小电场区域中的颗粒彼此接触。为达到这种结果，可以在孔中开发更复杂的电场模 型，如果保持接地，它可以说明用怎样一种配置电场的方法，来创造两个可以吸引位于 电极38和39附近颗粒的区域。
首先，让我们来看下面的案例，要求颗粒不与电极38和39接触以避免如黏附这样 的现象。为此，我们可以看下图13所示的案例。假定受负介电泳作用的两个颗粒22和 23已经加入到孔中，且被电场的最弱区域捕获，所处位置如图13所示。筒便起见，现 在假定重力不明显降低所述颗粒所在的平面，从而使之保持在与电极38和39垂直的位 置，该装配电极的位置设置成与电场最低线校准并与平面A-A，垂直。有关电极对38 和39使用的操作需要利用所施加的正弦电压。假定，这些选用电压的平均值为0值， 且对照电极36上电压的相位，对电极38和39施加电压的相位分别为90度和270度。 如果电极38和39的峰值电势相差低于36和37,以及40和41之间的电势，例如几十 伏，大体上电场所具有的沿中心轴电场最弱的区域仍存在。电极38和39资导的电场对 细胞22和23具有一个明显的效果，其具有的介电常数和电导比周围的液体低，因此细 胞22和23处在负介电泳状态下。在此情况下，由于大多数悬浮的细胞形状是球形的， 细胞22和23可以象镜片一样分盆电场。这意味着细胞22创造了一个电场，增加了细 胞22和电极38之间区域电场倾度；同样细胞23也创造了一个电场，增加了细胞23和 电极39之间区域的电场强度。这些相对最低和最高的电场强度具有将两个细胞推近， 直至它们互相接触为止。显然达到这个目的所需要的力是非常小的，因此它不需要抵消 其它力，如重力。因此，在此情况下，可以使细胞和/或其它目标彼此接触，并保持互 相接触的状态。同时，.将细胞和测量电极对准，使其位于便于测量的有利位置。
通过只极化电极38和39中的一个而另一个保持接地可以得到前述结构的一个变 型。在此情况下，加入孔中的颗粒到达接地电极，并排列在电场最弱的地方。图14显 示了这种类型的结构，其中两个聚苯乙烯球，排列在靠近接地电极的地方。
可以在2003年由英格兰科学研究出版社出版的H. Morgan和N. Green所著的 书—一 《交流电动学胶体与纳米颗粒》的59 - 62页找到这个问题的详细论述。
现在让我们来看本发明的装置如何被用作传感器。根据图l所示的结构，现有技术 的专家可以看到，通过中间电极2所捕获的颗粒来调节上环形电极1和下面一个环形电 极3的电流。这种情形与库尔特粒度仪用于高精密度计算如细胞这样的颗粒的数量时， 所创造的情形差不多。在这个实施方式中，计数器的目的是测量比如孔中颗粒的数量变化。这种宏观孔的结果可以用与已提到的Thielecke等作品中所描述计数器相似的技术 来实现。在所有这些方案中，将电极2和3用作传感器，将刺激信号与电极1连接，在 孔中加上已知的电压或电流，达到检测联合电量的目的。
可以用两个电极2和3进行测量的能力提供了一个特别的好处，如果与颗粒沿垂直 轴的运动结合，就可以进行颗粒位置的测量。如果通过电极1施加合适的信号，在不同 的频率同时进行测量也是可能的，例如用两个不同的频率。
现在根据图10中的结构，用电极36, 37, 40和41形成的整合调节器安装在电极 38和39所在的平面上。这些电极不止象前面所述的那样让颗粒能够准确定位，也可以 进一步用于检测它们中间存在的阻抗。为此，它们也可以叫做检测电极，即使这样如果 需要它们也可以用于如上所述的细胞定位。由于目标生物材料颗粒与周围的基质相比， 具有很大的电容差异，且在某些情况下是电阻差异，因此颗粒的存在与否可以改变两 个电极之间的总阻抗。通过检测电极之间细胞的类型，检测可以非常准确，例如使Sohn 等的学说(PNAS， 9. 26, 2000， Vol. 97)适应本发明的孔。本发明的一个创新实施方 式是将颗粒在电极38和39前进行排列结合在一起的事实，它是j吏测量中的信噪比达到 最大所必须的。在孔中移动颗粒的能力使其可以放在阻抗变化最大的地方。本发明的另 一个创新实施方式是在运动中多次检测颗粒的能力，被施加在终端的电压变化或受热波 动影响的液体诱导的随机运动所代替。颗粒的位移引起电阻随时间变化。如果所述的值 可以在不同地点采样几次，就可以通过评估关键参数如随时间变化的最大值，就可以确 定电阻值，也就可以准确定位电极38和3 9之间的颗粒。
因此，传感器包括导电电极38和39,优选宽度比用作调节器的电极36， 37, 40和 41窄的电极。电极38和39的有效几何尺寸如下，厚度根据要检测颗粒的直径决定，宽 度是颗粒直径的2到10倍。在这个范围内，很容易想到由调节器(操作电极)产生的 电场可通过传感器进行调节，即给所述的传感器施加的电压小于施加到另 一个电极上的 电压。试想，传感器作为一个模块用作一级近似，接着电场前的区域场强为0。虽然， 这是适度空间延伸的变化，于周围区域相比，它加强了结构中央区域的场强最小区域， 因此有助于提高该结构的捕获能力。电容会影响检测的质量，耦联的电容会将检测电极 和需要极化的东西连接起来。用于极化作用的电极上的随时间变化的电压产生的噪声， 必需在读所需信号之前被消除。可以采用如下技术滤波降噪或当读电阻时关闭极化电 极。
在第一个案例中，对极化作用电极施加不同频率的振荡也可以用于读电阻。这种情况下，现有技术的专家明白通频过滤器对不需要的频率具有足够的排斥值，可以显著减 少偶联。另一个技术是在颗粒运动中用测量的概念。在此情况下，程序如下l)极化 电极36, 37， 40和41施加一个电压让颗粒定位于检测电极38和39之上的位置；2) 固定极化电极的电势或将其接地；3)检测电极38和39根据时间不停的检测它们之间 的电阻。由于通常情况下颗粒比容纳它们的液体重，重力会将颗粒向下移，因此电阻枱二 测可以看到，第一步颗粒会在传感器上面，第二步颗粒会位于传感器前，最后一步，颗 粒越过它们，向下移动。可以利用已知的颗粒移动动力学进行数据釆集。 矩阵组装(matrix organization)
下文中我们介绍该装置如何作为传感器和调节器矩阵进行工作。 由于平台以矩阵的形式制造，其中的所有元件都是如图1所示的环形电极结构的孔， 在此情况下需要从一部分孔中选择性释放其中所含颗粒，程序如下a)电极l可以以 一体结构形成，从而为孔矩阵的所有上层电极提供电连续性；也可以通过一组分开的与 形成电极3平行的金属带形成电极1。电极2和电极3以一组电学上分开的金属带来形 成，使其可以对每个孔施加不同的电压。形成电极2的金属带与形成电极3的金属带垂 直。下面的叙述，假定电极2是竖排连接的，电极3是横排连接的。b)完成上述的在 孔中沉积和捕捉颗粒的步骤后，对电极l和3施加具有相同振幅和相位的正弦电，对电 极2施加振幅相同但相位相反的正弦电。c )用X和Y分别代表横排和竖排，以确定每 个孔在二维排列中的位置，相位反转+ 90度的电压加到X行的电极3上，相位反转- 90 度的电压加到Y列的电极2上，与前述情况相比将正弦电的振幅增加约30%。这个方案 在不同的孔中形成了如下的电场结构a)孑L(X, Y)在电极2和电极3之间具有0电 场；这将介电泳作用降低到最小，使颗粒随重力下降。b) X行的其它孔由于电极2和电 极3的相位有90度的不同，而具有减弱的介电场强度。这种减弱可以通过增加施加在 电极上的电压的振幅得到补偿。c )由于在电极1和2之间和电极2和3之间相差降低 90度，因此沿Y列的孔的介电场强的强度降低。这种降低可以通过增加施加到这些电极 上的电压振幅得到补偿。d)矩阵中的其它孔中没有变化。
技术专家可以处理本发明其它实施方式中所述的孔结构才喿作方案。 图10a所示类型装置的复杂结构是易于实现的，同样图16中的传感器和图15中的 一些调节器也是易于实现的。
关注传感器的结构，如图16表示电极38和39所在的平面，该图所示的矩阵操作 解释如下。电极39和39' , 38和38' 表示具有4个孔的矩阵。它是具有许多孔的矩阵的直接概括。现在想象电极39施加正弦电压，而电极39'仍与对照电压相连，对照 电压等于施加在20上的电压。在此条件下，具有与对照电压相连的非反转输入20的两 个运算放大器与电极38和38，相连。通过阻抗19发挥的发作用，如以电阻的形式，使 电极38和38'与对照电压20相等。流过19的电流保持电压的稳定，如前所述，该电 流引起通过电阻19上的电压下降，因此引起放大器输出端21电压的变化。如果只有一 个电极39被激发，竖行38和38'所需要的电流吸收是由于被流过电极39所激发的孔 的电流所需要的吸收，而所有与等电势的电极对39， -38和39， -38'相交的其它孔没 有任何电势衰减。通过这种方式，用顺序扫描矩阵就可以控制每个孔间产生的阻抗。如 果需要可以进行循环重复扫描。
作为调节器装置的矩阵类型操作更简单，如图15所示，电极所在的一个平面，比 如电极40和41。特别是，向孔中装颗粒和选择性释放颗粒是最重要的步骤。装填步骤 需要在整个颗粒加入过程中，上电极36和37施加的电压为0。这可以避免在电极间产 生高电场的区域，从而妨碍颗粒进入孔中。只有在颗粒加入后，电极36和37上的电压 才被重新激活。
颗粒向下流动进入通道10的出口 ，用下面的方法控制。所述通道10的出口允许液 体进口 16和液体出口 17相连接，从而如前所述那样收集可能从孔中释放的细胞或颗粒。 如果孔中所含的颗粒需要全部回收，所有孔中的电极40和41上所加的电压都接地。重 力使颗粒向下流入收集通道。如果颗粒需要准确分步回收，为方便起见我们认为用两个 数字i和j来定义每个孔释放的内容是必要的，并分别与排和列相对应，这样可以明确 界定所选的孔。回收程序包含一下步骤1)施加在电极36和37, 38和39上的电势都 接地；2)升高加在电极40和41上的电压振幅，所用电压足够阻止颗粒离开孔，甚至 40和41中的一个设为0振幅。3)与i排电极40和与j列电极41相关的电压设为0 振幅；这个选择可以出现下列情况a )孔中电极40和41具有0和180相位的电压， 并具有可以阻止孔中内容物下流的振幅；b) j列和i行上的孔除了孔(i, j)，在此情 况下至少有一个电极40或41具有相关的振幅的电压可以阻止孔中内容物的下流；c) 孔(i, j)是唯一具有输入电极40和41,且其相关电压为0。通过对每个研究的孔重 复此程序，有用孔中需要的部分能够被回收，让内容物落入管道IO,并将其输送向出口 17。
如果不需要释放细胞的位置信息，液体本身的流动也可以运输使材料。在需要释放 材料的孔的准确位置信息的情况下，可以通过利用简单的流体设备通过抽吸使孔中所含的材料移出。
通过介电泳和蒸发的方法控制颗粒位置
介电泳力的强度根据重力施加。具有上开口的孔结构能使协同应用液体的蒸发以减 少所需介电力强度，因此可以减少所需的电场和液体中能量的损耗。许多领域的文献都 报道了颗粒的微流体控制。通过例子出版在2005年Lab on a Chip 1355-1359页的文 章可以作为参考文献，介绍了如何控制用于移动颗粒的液流。进行准确的移动需要复杂 的温度控制结构，这种结构不能简单的推广到本申请中所述的那些阵列。
再比如，疏水或亲水表面形成的微小水珠具有不同的形状。参考图1,证实液体的 存在制造了一个月面30。所述机制通过图2中孔的矩阵被证明了。表面30可以暴露在 气流中，通过合适的机制诱导液体蒸发。蒸发引起孔中的液体向上运动，产生的运动来 对抗重力所诱导的运动。特别是，完全抵消重力需要的液体流速必需等于颗粒下降的速 度。例如，浸在水中的真核细胞，其下降速度是每秒10微米的级别。与流入具有50微 米直径的孔14中电极所在区域的相等流速且方向相反的液体流动速度升高到lnL/min。 如果电极上方区域孔的形状很快增加，在上部结构中直径增加到lmm，且如果只对平台 的外表面进行疏水处理，没有对孔内壁和上部结构7的壁12进行疏水处理，在孔直径 大于或等于lmm的表面会形成新月面。为此，根据本发明的一个可能实施方式，壁12 和孔内壁103具有相同的亲水或疏水性质，且与本发明前述实施方式相反。需要平衡的 液体蒸发所需的流速与温度为7K时用泵强制对流气流所带走的液体相一致。在刚刚所 述的情况下，如果流体流动是控制颗粒的唯一方法，很明显颗粒位置的控制是不精确的。 相反，通过将基于介电流原理的技术和流体蒸发联合起来，就可以在第一种方法提供的 精确和第二种方法减弱电场之间获得有益的协调。这个方法有关的理论模型和试验结 果,见文献 "An Itntegrated Electronic Meniscus Sensor for Measurement of Evaporative Flow"《检测蒸发流的整合电子月面传感器》，该文献将出版在2007年 在法国Grenoble召开的换能器大会上。
所述孔基仪器在生物领域的应用
并联孔中单个细胞的运动，和在单个孔中改变培养条件的能力，在许多应用中是可 以的，下文中将详细讨论其中的一些应用。该仪器潜在的应用通过利用不同的传感器将 介电泳运动和不同生物分析技术整合的可能性而被放大。
该仪器也包括分离和/或筛选颗粒的方法。
在优选的实施方式中，传感器是测量电极，且特别是测量孔和内容物阻抗。由于在电场中不同的细胞行为和相对阻抗测量，已经获得了生物领域的一些重要结果，如从血 液中分离癌细胞(Becker F. PNAS, 1995， 92:86 )。
生物膜电容和电导改变下列细胞行为已经被观测到(Hu等，B i och im, B i ophys. Acta, 1991, 1021:191 ),而且其因细胞类型的不同而不同。这些可以作为利用所述仪器筛选 单个细胞或从个别孔中筛选一些细胞的方案的依据。由于单个细胞中脂类或其它分子的 激活作用(Biotechnology & Bioengineering, 1999, 65: 537-541 )可以改变阻抗，因 此通过检测阻抗性质或变化，可以检测细胞脂类含量，细胞质或培养基，和细胞膜的状 态。
与培养基或细胞脂类含量有关，可以通过阻抗测量得到的生物学性质，是那些在细 胞裂解过程中通过细胞坏死或凋亡引起的细胞膜状态的改变或损坏，比如由于细胞毒性 现象，因此可以在单个孔中进行^r测。
阻抗和/或光度测量使细胞复制后的细胞扩增可以测量，而且可以测量的诱导扩增 作为细胞相应的刺激条件。
根据另 一个优选实施方式，传感器整合在介电泳运动和/或限制系统是光学类型的， 有冷光，荧光或不同波长的光密度。
通过检测焚光作为光信号，可以检测钩流量，例如通过受体激活诱导的钩流量，或 通过与第二细胞信使相互作用诱导的4丐流量，甚至是在生长条件下诱导下列变化时引起 的钙流量。因此这些细胞应答对单个细胞可以检测，且可以并行检测个别孔。在颗粒被 负载上荧光集团或发色团的情况下，在细胞裂解后或细胞通透性改变的时候会释放到培 养基中，细胞裂解现象可以用做焚光信号来检测。
与细胞形态改变有关的光度和/或介电信号，比如下列刺激细胞勒附，细胞移动， 或由于裂解导致的细胞膜性质改变，程序性死亡(凋亡)或细胞毒性可以被鉴别，并且 与培养物中已知的刺激准确的相关起来。
因此适于进行阻抗测量和光度测量的传感器能辨别颗粒或培养基的形态学性质，化 学性质，生物化学性质或代谢性质。
细胞DNA修饰的应用
细胞遗传物质的修饰优选通过电穿孔或细胞融合实现。在此情况下，所述颗粒是生 物学颗粒，如微生物，包括真核细胞，酵母和细菌，及其片段或小的聚集物或其变异体 如原生质体。但是，该方法也用于生物颗粒，主要包括脂类或磷脂如脂质体。
我们现在来看本发明的装置如何发挥细胞电穿仪和修饰器的作用。所述参照结构遵循图10中的结构。赋予影响颗粒运动的能力和颗粒性质的检测能力的孔矩阵的存在， 使能够并行处理大量单个细胞的高效电穿孔仪得以制造。就从前述的操作理解，该装置 使该方案中必需的众多操作受到影响。特别是，将微生物定位在测量电极38和39前是 可以的，并通过测定阻抗来确保这一点。检测的下游，相同的电极可以用于施加需要的 电压强度以获得电穿孔作用，例如如KhineM等所述(Lab Chip, 2005, 5， 38 - 43 )。 电脉冲可以比传统电穿孔中所用的强度低。这是由于电穿孔作用发生在含有一个或几个 细胞的合适大小的腔中。由于空间的减小，即使用中等的电势也能获得显著的电场。这 些所用的电势适于在细胞膜上制造临时的孔，并使比细胞质浓度高的上清液中的物质向 细胞内部迁移。特别的用途是改变微生物所在的上清液。电穿孔需要低电导的上清液， 来避免过度的电流通过生物材料所产生过多的热量。但是这些上清液不适于电穿孔后长 时间容纳微生物。因此正常操作是将微生物从该程序发生的腔室去除，并将其移入一个 更适合它们的环境以克服细胞膜修复过程中的关键阶段。当处理少量细胞的时候这个程 序就难以进行了，同时在这个脆弱的阶段转移微生物也容易破坏这些微生物。本发明提 出的方式能解决这个问题，当微生物处于稳定的位置时即维持在介电笼原位时候，可以 更换上清液。来概括不同的阶段，出发点是含有生理溶液组成的上清阶段将微生物维持 在合适环境下。上述上清液可以被低电导的溶液代替。在这个阶段中，颗粒的位置可以 通过前述调节器的程序控制。接着进行电穿孔，低电导的上清液可以去除或被替代，通 过更换生长培养基将微生物放在适宜的环境中重建被破坏的细胞膜，而不需要移动它。 用所述的机制，通过用电穿孔引入外源DNA或通过两个基因组的融合可以进行遗传修饰。 电穿孔也可以在不是DNA的外源物质存在下进行，例如不能跨过细胞膜的药物或大分子。
另 一个非常重要的修饰微生物遗传材料的方案是电融合，例如用专利 US2003/0104588描述的方法进行。在此情况下，前述的程序不改变，但是利用不同类型 的单个细胞在腔中的沉积，可以同时制造大量的细胞融合。特别是，正如文献中广泛描 述的，施加到大量细胞或细菌，细胞聚集物的电势促进经适当处理的细胞融合以便于DNA 的交换。在细菌的情况下，处理有机体使细胞膜失去保护层。由此得到的原生质体放在 一起彼此接触，用描述调节器部分所用的电势，创造一个介电力，它可以使原生质体保 持在一个相同的空间区域。
本领域技术人员知道在如上所述产生的电势存在下，或即使不存在电势的情况下用 其他简单的方法得到或提高颗粒间或细胞间融合效率的可能性，包括根据已知方法(比 如制备杂交瘤融合或/或原生质体融合)使用便于融合的化学物质(如聚乙二醇，聚凝胺，DEAE-葡聚糖，Fycoll)。在比通常低的渗透压环境中，可以得到细胞间的黏附。 比如，应用环境微生物(2004， 2391-2397 )上描述的方案，所述步骤中被融合的细胞 置于不同的化合物中。特别是，通过重新混合含有细胞的溶液来帮助它们互相接触和翁 附。在本文描述的情况下，l占附通过施加介电泳力来实现。
利用合适的电压进行细胞融合(电融合)的其它方案。本方案通过让存活的微生物 或细胞重建细胞膜，并通过改变电穿孔或细胞融合时细胞的培养条件来恢复在前述步骤 遭到破坏的存活机能。
所述观点通过以下的实验步骤证实a)孔中装满于生理溶液电导相等的液体；b) 安装的传感器检测溶液的电导；c)具有低电导和适于进行电穿孔的溶液加入管道10; d) 测量新溶液的电导。这个实验的结构如图18所示，其中可以看到对照液体的供应使孔 中的上清液准确的改变。特别是，简单测量电极36和37之间的阻抗，可以识别出没有 液体的孔， 一个是加入的低电导的溶液在修饰细胞遗传物质的方案中经常被用作緩冲 液， 一个是具有高电导的溶液即典型的生理溶液。
该程序也可以被用于电穿孔程序。特别是在不同阶段改变上清液的能力使得在原生 质体融合需要的时候可以加入低电导的溶液，能够在制备阶段去掉细胞膜保护层的溶 液，而在最后功能恢复阶段可以加入含有合适营养物质的溶液。由于孔使所有这些步骤 在单个细胞的水平上进行，因此当用在宏观水平得时候，整个程序不需要更改，因此让 包埋法(investments)在现有得方案中被保留下来，而将多种方法结合在一起的新方 案的可能性在于融合步骤的结果被控制，因此优化算法被应用在具有特定效果细胞之间 的准确相互作用知识基础上。
前述方案得到了一定量的细胞，所述细胞是处理后存活下来和b)彼此具有不同功 能性质。
在此阶段中，孔中的传感器是基础，a)可以利用细胞团的生长和由此改变的用于 测量电极间的阻抗来检测存活细胞；2)依靠需要的细胞表型，有时可以选择明显具有 所述表型强表达的克隆。例如细菌产生脂类物质样本容量可以利用脂类的电阻和介电常 数与细胞中其它的材料区别很大的现象来检测。例如，在此情况下，检测到的阻抗由脂 类的浓度决定。
细胞选择的应用
本发明的平台4艮据它们对合适目标细胞裂解性的不同，在筛选克隆细胞方面可以直 接应用。例如， 一些属于CTL和NK家族的免疫系统细胞具有明显的对胂瘤细胞裂解活性，并可以识别健康细胞。为什么这些具有裂解活性的细胞在病人身上的数目逐渐减少 的原因仍不知道，更重要的是怎样才能分离这些具有研究价值的细胞。细胞功能选择的 问题必需解决，即被选择的细胞不是由于已知的表面标记，而是由于具有特定功能性质 的细胞。
上面的解释让在这个平台上进行的选择方案基于得到的仪器能够沉积单个细胞，比 如由DakaCytomation生产的仪器，其具体步骤如下1)目标细胞，比如瘤细胞，以已 知数量沉积在孔中，比如每孔一个细胞；这个结果需要装置捕捉沉积的细胞。2)具有 假定的裂解效果的已知数量细胞，如CTL细胞NK细胞，沉积在孔中，在孔中加入电压 以捕获粒子。3)创造一个电场结构，具有促使孔中细胞间的表面相互作用，裂解效应 的存在通过与前述方法相似的程序，检测阻抗的不同。4)回收具有裂解效果的细胞， 在常规容器中进行单克隆扩增。5 )执行所述方案中的1) -4 )步骤，确证选择的细胞是 否具有不同的效果，如它们不会攻击不希望的目标，如健康细胞。6)如果选择性确定， 再次扩增细胞。在此情况下，本申请的平台对确证和在它其体外扩增期间的细胞选择方 面是有用的。的确，已经知道，CTL细胞的扩增在几个复制周期后一些子细胞的遗传密 码会发生改变。当在方案的起始阶段选择细胞的个数是几打的级别的时候，这就会非常 重要，然而从治疗的观点来讲有用的数量是成百上千万的细胞。所需细胞扩增循环的数 目比保守的原始遗传密码期间的多。这个问题可以通过进行更多选择步骤的方案加以解 决，就象前述的那些方案一样。例如，通过选择的方法提取的细胞第一次扩增，接着合 适扩增数量之后，它们的功能性质通过重复选择程序来确认。用这种方法，减少了达到 治疗水平需要的扩增次数，而且确保了细胞功能性质的重复性。刚刚所述的结构可以用 一系列合适的电压来实现。特别是图10中的结构，在细胞在孔中沉积的阶段，电极40 和41上的电压将被激活，而其它电极上的电压仍将是0。这种选择可以封闭孔的出口， 且向孔中加入细胞也不会被阻碍。相互作用阶段如前述进行，通过对所有电极施加合适 的电压以使它们相互作用。任何细胞裂解都可以通过孔中的传感器检测，或者也可以通 过细胞裂解时释放出来的合适燃料的吸光度观察来检测。这些观测可以决定什么时候在 什么地方回收细胞。
用细胞裂解活性进行细胞功能选择的方案可行性通过实验证明了 ，如图19-21所示， 获得得商品化得平台介电泳阵列由意大利Bologna的Silicon Biosystems S. p. A公司 生产。
图19显示介电泳阵列根据物理原理制造了一个与本发明类似的介电笼，而且电磁效应适于细胞环境的光度^r测，特别是用4丐黄绿素标记后的荧光检测。总共95个孔被 置于介电泳阵列上，并用钙黄绿素标记，并以100MHz振幅在类似于本发明要求的电》兹 场中暴露20分钟以上。可以看到这些细胞具有可检测的荧光信号，并没有因为在电场 中持续暴露而损失强度，证明在这些情况下没有显著的自发溶解现象。这也使细胞的功 能选择方案可应用于特别难分离的细胞或分离效率低的细胞如干细胞，淋巴细胞，特别 的细胞毒素淋巴细胞。
决定效应器CTLs对含有肿瘤细胞抗原的靶细胞的裂解活性的能力显示在图20中。 实验内容如下淋巴细胞系(LCL)来自被EBVB95. 8抹感染的人B淋巴细胞(Salter， R. D.和P. Cresswell， 1986, EMBO J. 5:943-949)。 EBV特异性肽HPVGEADYFEY (对应EBV 中EBNA1的蛋白质的氨基酸残基407-417 )用于刺激。HLA-B35供体的外周血淋巴细胞 (PBL)以3.5 x 106个/孔的浓度铺24孔板，用含有l(WFCS (Hyclone)的RPMI1640培 养基，用lO)oM HPV肽刺激。7天和14天后重新刺激培养物，并补加10 U/ml rlL-2 (Chiron) 。 14天和21天，用典型的细胞毒性(cytotoxicity canonic )试劍51Cr-release ) 分析T细胞培养物的CTL活性(Hill醒GG, Roessler N， Fulbright RS， Pontes JE, Haas GP. 51Cr-release assay adapted to a 96-well format sample reading. Biotechniques. 1993; 15 (4): 744-9)。
实验结果如图20所示，人淋巴细胞系被EBV (LCD感染，进一步加入EBV肽和用钧 黄绿素标记的EBV肽，与来自外周血的CTLs—起温育，单核细胞衰竭，而在体外被EBV 特异性肽(对应EBV中EBNA1的蛋白质的氨基酸残基407-417 )刺激，然后与IL _ 2 — 起温育。图20显示，用特异CTLs测试前的靶淋巴细胞能在介电泳力的作用下移动，且 4-5个细胞排列在一起，于不同电极对应的介电笼中。12分钟后，含有CTLs的细胞复 合物，用荧光信号检测到，荧光信号在有特异性裂解的地方消失(12分钟，左手格子)， 在肿瘤抗原决定簇(EBV肽)的靶细胞存在下可以被CTLs识别。特别裂解的重复性如实 验图21所示，给出了三个不同实验的平均值，实验如图20所述那样进行。荧光信号 的检测每30秒实时检测，结果显示，用介电笼建立的系统可以使待定的包括CTL的复 合体发生特异裂解，并且所述裂解被明显显示，即使在2分钟后与对照("靶，'细胞不 含所述蛋白质)在数值上有显著差异。
根据本发明，已经证明生物活性如识别和CTLs对靶淋巴细胞的特异裂解没有被介 电泳环境所改变，例如用如钙黄绿素这样的荧光燃料的标记活力，根据本发明它可以在 介电泳中作为光信号，且能检测包含一个到一定小数量细胞的细胞复合物中的变化。因此本法名涉及所述仪器的使用，在功能选择上引起细胞退化的功能选择试验条 件，如裂解，凋亡，坏死，且所述的退化可以通过緩冲液中或其它生物相溶基质中光度 或电信号(如阻抗)的变化来检测。所述方法中用的固体载体，优选微量培养板，包括 按系列排列的本发明的孔，使孔中细胞为了细胞相互作用而运动，也可以矩阵排列，可 以检测相同孔中或微室中的阻抗变化。
因此本发明具有如下优势
a) 为了检测细胞裂解反应而放射性标记细胞不是必要的。
b) 可以平行检测在相同条件下孵育的多组细胞，并提供有统计意义的数值。
c) 单个细胞的分析成为可能，这包括能够利用最小数目靶细胞的优势。
d) 程序快，可以在几分钟后拿到结果。
e )可实时检测细胞的变化(如，细胞裂解)。
根据本方法的优选实施方式，该方法目的在于选择和扩增细胞毒素同源或异源淋巴 细胞或NK,能够识别和特异性裂解肿瘤细胞，或被微生物，细菌和/或病毒感染的细胞， 或致病状态的细胞，识别抗原和/或与正常细胞相比的功能性质。
权利要求
1. 一种孔，特别是至少在上端是开口的孔(14)，所述的孔具有垂直轴(101)，所述孔用于容纳液体和液体中含有的颗粒，其特征在于，所述孔包括至少两个操作电极(1，2，3，31，32，36，17，40，41)，所述电极能由电压供电，特别是交流电压，从而能够通过介电泳效应操作所述孔中的颗粒。
2. 根据权利要求l所述的孔，其特征在于，所述孔包括至少三个操作电极。
3. 根据权利要求2所述的孔，其特征在于，所述孔包括至少四个操作电极。
4. 根据前述任一权利要求所述的孔，其特征在于，所述电极含有导电材料板，所 述电极实质上位于不同的平面上，所述平面与所述轴横切。
5. 根据前述任一权利要求所述的孔，其特征在于，所述电极彼此相对穿过限定所 述孔边界的侧壁(103)。
6. 根据权利要求5所述的孔，其特征在于，所述侧壁含有介电材料(8 ),其中在 所述介电材料中嵌有所述电极。
7. 根据前述任一权利要求所述的孔，其特征在于，所述孔的底端开口以便与管道(IO) 相通，从而能够将液体送入孔中或从孔中移出液体。
8. 根据权利要求7所述的孔，其特征在于，用半透膜(11)将孔与所述管道隔离。
9. 根据前述任一权利要求所述的孔，其特征在于，限定孔边界的侧壁具有亲水表面。
10. 根据权利要求1至8中任一权利要求所述的孔，其特征在于，限定孔边界的侧 壁具有疏水表面。
11. 根据前述任一权利要求所述的孔，其特征在于，所述孔包括一个上部结构(12 ), 它从所述侧壁开始向外部逐渐变宽。
12. 根据权利要求11所述的孔，其特征在于，如果所述侧壁具有亲水表面，则所 述上部结构具有疏水表面，反之亦然。
13. 根据权利要求11所述的孔，其特征在于，如果所述侧壁具有亲水表面，则所 述上部结构具有亲水表面，和如果所述侧壁具有疏水表面，则所述上部结构具有疏水表 面。
14. 根据前述任一权利要求所述的孔，其特征在于，至少有一个所述电极沿所述限 定孔的壁形成环形边缘，该边缘实质上位于与所述孔的对称轴橫切的平面上。
15. 根据权利要求14所述的孔，其特征在于，所述孔含有位于平行平面内的两个 电极，并形成如上定义的环形边缘。
16. 根据权利要求15所述的孔，其特征在于，所述孔含有3个位于平行平面内的 电极，并形成如上定义的环形边缘。
17. 根据前述任一权利要求所述的孔，其特征在于，所述孔含有一对位于与所述孔 的垂直对称轴横切的同一平面内的电极，并沿界定所述孔的边界的壁形成两个环形边缘 部分，特别是被平行于所述孔的所述对称轴的表面彼此分开。
18. 根据权利要求14或17所述的孔，其特征在于，所述电极对和所述形成环形边 缘的电极位于不同的横切面上，优选所述形成环形边缘的电极相对所述电极对位于所述 孔的上端。
19. 根据权利要求17所述的孔，其特征在于，所述孔含有前述的两对电极，它们 位于与所述孔的所述轴横切的两个不同的平面上。
20. 根据前述任一权利要求所述的孔，其特征在于，所述孔含有一对测量电极，所 述测量电极能够测量它们之间的阻抗。
21. 根据权利要求19或20所述的孔，其特征在于，所述测量电极彼此相对穿过所 述孔的侧壁，且位于所述两对电极所在平面间的一个中间平面上。
22. 根据权利要求21所述的孔，其特征在于，所述测量电极位于沿与所述孔的轴 横切的线上，其方向实质上平行于所述两个电极对的电极分离表面。
23. 根据权利要求20至22中任一权利要求所述的孔，其特征在于，如果适当加电， 所述测量电极也适于移动孔中的颗粒和/或诱导电穿孔或融合反应。
24. 根据前述任一权利要求所述的孔，其特征在于，所述孔具有一个与所述孔的轴 平行侧壁，且所述侧壁的直径在30到150微米之间变化，优选50到IOO微米之间。
25. 根据前述任一权利要求所述的孔，其特征在于，如果反转，通过毛细作用所述 孔可以在其内存留液体。
26. 根据前述任一权利要求所述的孔，其特征在于，所述孔具有检测孔中内容物的 物理和/或化学性质的传感器，特别是阻抗、光学或电势类型的传感器。
27. 根据前述任一权利要求所述的孔，其特征在于，至少一个所述操作电极也能够 起到传感器的作用。
28. 含有多个前述任一权利要求所述的孔的平台。
29. 根据权利要求28所述的平台，其特征在于，属于同一行的每个孔的至少一个 操作或测量电极与同行内其它孔的相应电极连接。
30. 根据权利要求28或29所述的平台，其特征在于，属于同一列的每个孔的至少一个电极与同列内其它孔的相应电才及连接。
31. 根据权利要求28至30中任一权利要求所述的平台，其特征在于，每个孔的至 少一个操作电极与其它孔的相应电极连接。
32. 根据权利要求28至31中任一权利要求所述的平台，其特征在于，每个孔的至 少一个测量电极与其它孔的相应电极连接。
33. 根据权利要求26到32中任一权利要求所述的平台，其特征在于，所述平台具 有一个将液滴和/或颗粒滴入每一个孔中的系统(13)。
34. —种应用孔或包括多个孔的平台的方法，其中所述的孔特别是指在上端是开口 的孔(14),所述孔具有一个垂直轴(101)，所述孔能够容纳液体和液体中含有的颗 粒，其特征在于，所述方法包括孔的上端朝上的正常配置下的孔的应用，和孔的上端朝 下的倒置状态下通过毛细作用将液体保持在孔中的孔的应用。
35. —种应用权利要求1-27中任一权利要求所述孔的方法，其特征在于，所述方 法包括施加交流，优选正弦电压于至少一个所述电极上来诱导介电泳效应，特别是负介 电泳，所述的介电泳效应作用于所述孔中的至少一个颗粒上。
36. 根据权利要求35所述的方法，其特征在于，在沿所述孔的所述轴的方向上，将 实质上的同相正弦电压施加到权利要求16所述的孔中的距离最远的两个电极上，并且 将实质上的反相电压施加于中间位置的电极上，或施加适于在孔中形成类似电场的电 压。
37. 根据权利要求35所述的方法，其特征在于，在沿所述孔的所述轴的方向上， 将0电压施加于权利要求15所述的孔中的距离上端最近的电极上，且对距离所述端位 置最远的电极施加正弦电压，或施加能够在所述孔中形成类似电场的电压。
38. 根据权利要求35所述的方法，其特征在于，将反相正弦电压施加于权利要求 18所述孔中的所述电极对上，且将0电压施加于其余的电极上，或施加能够在孔中形成 类似电场的电压。
39. 根据权利要求35所述的方法，其特征在于，将实质上是反相的正弦电压施加 于权利要求19所迷的孔中的每对所述电极对的电极上，从而使在所述孔的轴的方向施 加到两个电极上的电压实质上是反相的，或施加能够在所述孔中形成类似电场的电压。
40. 根据权利要求39所述的方法，其特征在于，对权利要求22所述的孔施加电压， 以产生一个最小的电场区域，所述电场区域实质上位于所述检测电极排列的直线上。
41. 根据权利要求35所述的方法，其特征在于，对所述的颗粒进行物理、生物或化学性质的刺激。
42. 根据权利要求41所述的方法，其特征在于，检测对所述刺激的应答。
43. 根据权利要求35至42中任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述方法包 括分离细胞的最后步骤。
44. 根据权利要求35至43中任一权利要求所述的方法，其特征在于，检测传感器 检测与孔中所含颗粒或培养基有关的阻抗、光学或电势信号。
45. 根据权利要求44所述的方法，其特征在于，所述信号是颗粒或培养基性质的 变化。
46. 根据权利要求44或45所述的方法，其特征在于，所述光学信号是荧光、冷光 或光密度信号。
47. 根据权利要求44至46中任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述信号或 所述变化鉴定所述颗粒或培养基的形态、化学、生物化学或代谢性质。
48. 根据权利要求47所述的方法，其特征在于，所述的性质是所述颗粒或培养基 中脂类的含量或浓度。
49. 根据权利要求47所述的方法，其特征在于，所述信号或所述变化鉴定细胞裂解。
50. 根据权利要求41至49中任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述的方法 包括通过介电泳限制颗粒和改变所述孔中的液体。
51. 根据权利要求35所述的方法，其特征在于，对所述颗粒、特别是分离的细胞 施加适于进行电穿孔的电场。
52. 根据权利要求51所述的方法，其特征在于，所述电穿孔在外源性物质存在下 进行。
53. 根据权利要求35所述的方法，其特征在于，所述方法适于促使颗粒相互作用。
54. 根据权利要求53所述的方法，其特征在于，合适的电极能进行颗粒的电融合。
55. 根据权利要求53所述的方法，其特征在于，所述颗粒间的相互作用是在利于 细胞融合的试剂的存在下进行的，优选聚乙二醇，葡聚糖，Fycoll,低渗或高渗环境。
56. 根据权利要求54或55所述的方法，其特征在于，细胞融合导致遗传物质的重组。
57. 根据权利要求51至56中任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述方法包 括一个用阻抗、光学或电势信号进行检测的功能选择步骤。
58. 根据权利要求51至57中任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述方法包 括利用介电作用限制颗粒和改变孔中的液体。
59. 根据权利要求41至58中任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述颗粒是 被分离的细胞或脂嚢泡或脂质体。
60. 根据权利要求59所述的方法，其特征在于，所述的被分离的细胞是真核细胞， 微生物(酵母，细菌)或原生质体。
61. 根据权利要求60所述的方法，其特征在于，所述真核细胞是人的细胞。
62. 根据权利要求61所述的方法，其特征在于，所述的人类细胞是千细胞、淋巴 细胞、肝细胞或上皮细胞。
63. 根据权利要求41至62中任一权利要求所述的方法，其特征在于，由于存在具 有光学或介电性质的标记，所述颗粒被修饰。
全文摘要
本发明公开了一种容纳液体和液体中颗粒的孔，特别是至少在上端是开口且具有垂直轴(101)的孔(14)，其特征是所述孔含有至少两个操作电极(1，2，3，31，32，36，17，40，41)，所述操作电极能被电压驱动，特别是交流电压，从而利用介电泳效应来操纵孔中的颗粒。本发明还公开了一种包含上述多个孔的平台和利用所述孔的方法。
文档编号B03C5/00GK101460253SQ200780020325
公开日2009年6月17日 申请日期2007年5月31日 优先权日2006年5月31日
发明者罗伯特·格列里, 马西莫·伯克齐 申请人:明达西德实验室有限公司