专利名称：一种红球菌sp.D12、培养方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物催化剂，具体的说是红球菌sp．D12(Rhodococcus sp．D12)、它的培养条件及用于氰基水解的用途。
腈化物是用于有机合成的重要物质，但同时也是一些最严重的污染源。因此，腈化物的生物降解显得尤为重要。工业上用微生物催化方法以丙烯腈为原料合成用途广泛的化合物丙烯酰胺是其中最典型，也是最成功的例子。在氰基水解酶催化不对称合成的研究中，α-芳基丙腈的手性拆分倍受关注，因为它们的水解产物α-芳基丙酸是一类非常重要的非甾体抗菌消炎药，某些品种在市场上取得了巨大成功[Faber，K．2000．Biotransformations inorganic chemistrya textbook，4th ed．Spring-Verlag]。这些药绝大多数以消旋体形式上市，但大量研究表明其S异构体效力远远优于R异构体，因而使光学纯产品的需求大增。所以在这方面开发利用氰基水解酶催化的方法具有十分诱人的前景。1964年，氰基水解酶的首次分离来源于大麦叶子[Thimann，K．VMahadevan，SArch．Biochem．Biophys1964，105，133]。之后，几乎所有用于学术研究和工业应用的均来源于微生物，其中绝大多数属于细菌[Ohta，HChimia，1996，50，434]。在生物催化反应的研究中，合适的催化剂的获得是一切工作的前提，这一点对于研究氰基水解酶来说也不例外。遗憾的是，目前市场上没有商业化的氰基水解酶出售。为了满足社会的需要，就需要研制出高活力、高选择性的产氰基水解酶菌株并确定优化的培养条件。
本发明的目的是提供一种新的氰基水解酶菌株，即红球菌sp．D12。
本发明的另一目的是提供上述红球菌sp．D12的培养条件。
本发明的目的还提供红球菌sp．D12的用途，具体来说用于催化降解腈化物转化为光学活性的羧酸、酰胺或其混合物。
本发明所提供的菌株是采用逐级筛选的方法，直接从土壤中筛选含有所需酶的菌种并分离纯化而得，而且提供了该菌种的优化培养条件和用于氰基水解的用途。
本发明提供的红球菌sp．D12已于2000年10月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No．0497，分类命名为红球菌sp．D12(Rhodococcus sp．D12)。
本发明的红球菌sp．D12的培养方法，具体来说是用接种针挑取从土壤中分离筛选纯化得到的红球菌sp．D12菌体或其孢子接到斜面上，在斜面培养基中生长1-3天，PH=3-8，培养温度15-40℃，培养基的成分是碳源0-20g／L、氮源1-15g／L、缓冲溶液0-10g／L、NaCl 0-1g／L、微量元素溶液0-5g／L，琼脂10-40g／L。然后将少量无菌水倒入菌体生长良好的斜面中，用接种环挑散后直接倒入培养液中培养1-3天，PH=3-8，培养温度15-40℃，培养液成分是碳源0-20g／L、氮源1-15g／L、诱导剂0．2-10g／L、缓冲溶液0-10g／L、NaCl 0-1g／L、微量元素溶液0-5g／L，所述的诱导剂是苯甲酰胺、尿素、乙腈、甲基丙烯腈、甲基丙烯酰胺、异丁酸、正丁腈、丙酰胺、甲酰胺或丙酸等。上述培养基和培养液均可先在107-127℃灭菌10-40分钟。上述缓冲溶液是磷酸氢的一价金属盐或其水合物0．5-5g／L、磷酸二氢的一价金属盐或其水合物0．5-5g／L。本发明的培养方法中，推荐在无诱导剂的培养液中菌体培养16-32小时后再加入诱导剂，有利于提高产氰基水解酶的活力。
本发明的培养方法中，经培养液培养后离心分离得到的菌株可用生理盐水洗涤，再离心分离，所得的湿菌能直接用于催化氰基水解反应。
上述碳源是葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖、木糖、可溶性淀粉、乙醇、丁二酸钠、甘露糖醇或可溶性糊精。其中葡萄糖、果糖、蔗糖和丁二酸钠的比活力没有很大差别，底物在所有情况下都能顺利转化，即使不加碳源也是如此。丁二酸钠作碳源时酶比活力最好，但立体选择性稍逊。葡萄糖和蔗糖作碳源时，细胞生长、酶活力和选择性最好，而且葡萄糖作为碳源的立体选择性稍优于蔗糖。
上述氮源是酵母膏、牛肉浸膏、黄豆粉浸液、蛋白胨、L-谷氨酸钠、硫酸铵、氯化铵或硝酸铵。氨谷氨酸钠的含氮量较高，成分稳定，有利于实验的可重复性。蛋白胨是一种两性电解质，具有良好的缓冲作用，易溶于水，便于细菌吸收利用。黄豆粉浸液作氮源时能得到最高的比活力，但立体选择性稍逊。用蛋白胨作氮源时，酶活力低，选择性也不佳。在牛肉浸膏配制的培养液中，无论细胞生长、酶活力和立体选择性三个方面都较理想。上述诱导剂是苯甲酰胺、尿素、乙腈、甲基丙烯腈、甲基丙烯酰胺、异丁酸、正丁腈、丙酰胺、甲酰胺或丙酸。用乙腈、苯甲酰胺或甲基丙烯酰胺作诱导剂时，D12表现出好的氰基水解酶活力。其中用苯甲酰胺作诱导剂时得到的产物酸的构型为R，与用乙腈和甲基丙烯酰胺作诱导剂时相反。使用甲基丙烯酰胺，无论在细胞生长、酶活力还是立体选择性方面，都明显占优。优化的诱导时间是在培养液中培养16-32小时以后再加入诱导剂。当在培养20-28小时后再加入诱导剂时，酶活力大大提高，菌体生长量和立体选择性也小有提高。诱导剂的量的增加对提高酶的比活力很有帮助，但对细胞生长及立体选择性来说则不尽然，推荐每升培养液中加入1-5g诱导剂较优。
上述微量元素是锌、锰、钴、镍、镁、铁、钙、铜或硼。微量元素的溶液如MgCl2、FeSO4·7H2O、CaCl2、ZnSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、CoSO4·7H2O、H3BO3等。
本发明中优选的培养液成分葡萄糖8-15g／L、牛肉浸膏2-8g／L、甲基丙烯酰胺1-5g／L、K2HPO4或K2HPO4·3H2O 0．5-2g／L、KH2PO40．5-3g／L、NaCl 0．1-0．5g／L、微量元素溶液0-2g／L。其中，诱导剂甲基丙烯酰胺在培养20-28小时后加入更佳。
本发明的红球菌sp．D12具有高氰基水解活力，例如苯甲腈，苯乙腈，苯丙腈，卤代、硝基或甲氧基取代的苯甲腈或苯丙腈，甲基丙烯腈，萘甲腈，萘乙腈，卤代、硝基或甲氧基取代的萘丙腈或萘乙腈等都是可以被降解的底物，其中红球菌sp．D12分别将上述外消旋的化合物转化为光学活性的酸或酰胺。具体的方法是取新培养的红球菌sp．D12菌体，悬浮于K2HPO4-KH2PO4缓冲液中，在15-40℃搅拌活化。将底物腈化物溶于或丙酮等溶剂中，慢慢加入(若底物减少，则菌体和缓冲液均按比例减少)。15-40℃下搅拌，TLC跟踪反应进程。反应结束后，反应液离心处理(13000rpm，30min，20℃)，取上层清液，调节PH值至碱性，用乙醚等溶剂萃取，分别得到水相和有机相。有机相经洗涤，干燥，过滤，蒸除溶剂，纯化，得到酰胺及回收的原料。调节水相PH值至酸性，用乙醚等溶剂萃取，合并有机相，同上步骤洗涤、干燥、蒸除溶剂、纯化，得到酸。得到的氰基水解产物产率较高，光学选择性好，如(S)-(+)-α-甲基-2-萘乙酸、(S)-(+)-6-甲氧基-α-甲基-2-萘乙酸等的ee值可高达90％以上。
图1是不同培养时间的红球菌sp．D12菌体生长量及酶活力其中培养条件培养液配方是微量元素溶液1g／L，K2HPO41．03g／L，KH2PO40．75g／L，NaCl 0．1g／L，牛肉浸膏5g／L，葡萄糖10g／L。PH=7．0，30℃，48小时。
反应条件PH=7．0，30℃，向每1g分别培养了不同时间的湿菌／4ml K2HPO4-KH2PO4缓冲液中加入诱导剂甲基丙烯酰胺2．5g／L，底物是10mg苯甲腈，反应时间1小时。产物由HPLC测定后计算酶活力。
符号说明。，以在波长546nm测定的光密度(OD546)表示的菌体生长情况；·，氰基水合酶和酰胺酶的总活力。
本发明提供了一种具有高活性的氰基水解的新酶源红球菌sp．D12，并提供了上述新酶源的最优化培养条件，提供了最佳诱导剂、氮源、碳源、诱导时间、诱导剂的量，从而为氰基水解提供最合适的细胞生长、酶活力和立体选择性。使用上述生物催化剂催化氰基水解，条件温和，产率较高，选择性尤佳，并适于工业化生产。
通过下述实施例将有助于进一步理解本发明，但并不能限制本发明的内容。
实施例1红球菌sp．D12的培养用接种针挑取筛选到的菌体或其孢子接到斜面上，在斜面培养基中生长1-3天，PH=3-8，培养基的成分是葡萄糖8-15g／L、牛肉浸膏2-8g／L、K2HPO4或K2HPO4·3H2O 0-2g／L、KH2PO40-3g／L、NaCl 0-0．5g／L、微量元素溶液0-2g／L、琼脂12-35g／L。将少量无菌水倒入菌体生长良好的斜面中，用接种环挑散后直接倒入无诱导剂的培养液中，PH=3-8，培养液成分是葡萄糖8-15g／L、牛肉浸膏2-8g／L、甲基丙烯酰胺1-5g／L、K2HPO4或K2HPO4·3H2O 0-2g／L、KH2PO40-3g／L、NaCl 0-0．5g／L、微量元素溶液0-2g／L，上述培养基和培养液均经在107-127℃灭菌10-40分钟。30℃往复摇床培养24小时(或32小时)后再加入诱导剂甲基丙烯酰胺1-5g／L，经24小时培养后离心，生理盐水洗涤，离心分离，得到的湿菌用于反应。
实施例2各种诱导剂对酶活力及立体选择性的影响固定培养条件、反应条件、培养液配方中除诱导剂外的其他成分，分别考察了各种腈、酰胺和酸对酶活力的影响。
从斜面上挑取生长良好的红球菌sp．D12接到培养液中，室温下往复摇床培养48小时，培养液配方是微量元素溶液1．0g／L、K2HPO41．03g／L、KH2PO40．75g／L、NaCl 0．1g／L、牛肉浸膏5g／L、葡萄糖10g／L、诱导剂10g／L，PH=7．0，30℃。
取新培养的红球菌sp．D12菌体，悬浮于K2HPO4-KH2PO4缓冲液中，浓度是10g湿菌／40mlK2HPO4-KH2PO4缓冲溶液，加入底物100mg 2-苯基丙腈反应，PH=7．0，30℃。TLC跟踪反应进程。反应结束后，反应液离心处理(13000rpm，30min，20℃)，取上层清液，调节PH值至碱性，用乙醚萃取(50ml×3)，分别得到水相和有机相。有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸除溶剂，残余物柱层析纯化，得到酰胺及回收的原料。调节水相PH值至酸性，用乙醚萃取(50ml×3)，合并有机相，同上步骤洗涤、干燥、蒸除溶剂、纯化，得到酸。
结果如表1所示。表1诱导剂生长情况(干反应时 2-苯基丙酰胺2-苯基丙酸％总活力比活(unit／g重，g／l) 间(h) ％(产量／ee．) (产量／ee．) (unita／l) 干重)4．42 20 0／NDb0／ND00苯甲酰胺c 10．5 110／ND 26／6d13．11．25尿素12．63202／ND 1／ND0．630．05甲基丙烯酰胺 4．84 1064／6930／90 30．86．36正丁腈 3．59 203／ND 1／ND0．360．1苯乙腈 3．37 200／ND 0／ND00乙腈3．78 2262／3935／87 12．43．27甲基丙烯腈 3．16 202／ND 1／ND0．160．05丙酸2．1 201／ND 2／ND0．130．06苯甲酸 3．15 200／ND 0／ND00甲基丙烯酸 3．79 200／ND 0／ND00丙酰胺 3．16 204／ND 6／ND0．630．2a活力单位unit定义为每分钟转化1μmol苯甲腈的氰基水合酶及酰胺酶总活力。
bND，未测。
c底物回收66％产量，4％ee．构型未定。
d产物构型为R．实施例3各种氮源对酶活力及立体选择性的影响固定培养条件、反应条件、培养液配方中除氮源外的其他成分，其他实验条件同实施例2，分别考察了各种氮源对酶活力的影响。结果如表2所示。
表2氮源生长情况 反应时间2-苯基丙酰胺 2-苯基丙酸 ％ 总活力比活(unit／g(干重，g／l)(h) ％(产量／ee．) (产量／ee．) (unit／l)干重)无 0．84 ND酵母膏 5．47 2033／8560／6629．3 5．36牛肉浸膏 5．89 1812／9980／6039．5 6．71硝酸铵 5．65 1944／6350／5928．1 4．98黄豆粉浸液 5．47 1917／5276／11b 34．1 6．23蛋白胨a5．26 1923／40b27／4315．0 2．84L-谷氨酸钠 4．21 1970／6418／8016．5 3．91a底物回收40％产量，2％ee．
b由旋光测定。
实施例4各种碳源对酶活力及立体选择性的影响固定培养条件、反应条件、培养液配方中除碳源外的其他成分，其他实验条件同实施例2，分别考察了各种碳源对酶活力的影响。结果如表3所示。表3碳源生长情况(干 反应时间 2-苯基丙酰胺 2-苯基丙酸％ 总活力比活(unit／g重，g／l) (h) ％(产量／ee．) (产量／ee．) (unit／l)干重)无2．5211 66／19 24／72 13．25．23葡萄糖5．8911 44／94 50／90 39．56．71蔗糖 5．0511 36／98 55／72 34．36．80果糖 3．5811 53／24 36／66 20．95．84丁二酸钠 3．5811 40／66 55／45 25．06．90实施例5不同诱导时间对酶活力及立体选择性的影响固定培养条件、反应条件、培养液配方中除诱导时间外的条件，其他实验条件同实施例2，分别考察了不同诱导时间对酶活力的影响。结果如表4所示。表4诱导 碳源生长情况反应时间 2-苯基丙酰胺 2-苯基丙酸 ％ 总活力比活(unit／g时间a(干重，g／l) (h) ％(产量／ee．)(产量／ee．) (unit／l)干重)A蔗糖 5．471136／9855／72 34．3 6．80A葡萄糖 5．891144／9450／90 39．5 6．71B蔗糖 5．68 636／9854／77 47．9 8．43B葡萄糖 6．31 639／9952／93 52．8 8．37aA，培养开始时加入诱导剂；B，培养一天后加入诱导剂。
实施例6不同数量的甲基丙烯酰胺对酶活力及立体选择性的影响固定培养条件、反应条件、培养液配方中除诱导剂的量外的条件，其他实验条件同实施例2，分别考察了各种氮源对酶活力的影向。结果如表5所示。表5诱导剂的量 生长情况反应时 2-苯基丙酰胺 2-苯基丙酸％ 总活力比活(unit／g(g)a(干重，g／l) 间(h)％ (产量／ee．) (产量／ee．)(unit／l)干重)None 4．42 20 0／ND 0／ND 0 00．855．26 6 40／9750／78 43．1 8．202．5 6．31 6 39／9952／93 52．8 8．373 42／9748／96 52．8 8．375．0 6．11 6 20／9571／33 57．9 9．47a诱导剂加入时间均为培养23小时以后。
实施例7红球菌sp．D12对α-甲基-4-硝基苯乙腈的氰基水解的催化作用取新培养的红球菌sp．D12菌体5-10g，悬浮于20-40ml PH 7的K2HPO4-KH2PO4缓冲液中，在30℃搅拌活化0．5hr。将底物α-甲基-4-硝基苯乙腈80mg溶于0．2mlTHF或丙酮中，慢慢加入(若底物减少，则菌体和缓冲液均按比例减少)。30℃下搅拌，TLC跟踪反应进程。反应结束后，反应液离心处理(13000rpm，30min，20℃)，取上层清液，调节PH值至碱性，用乙醚萃取(50ml×3)，分别得到水相和有机相。有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸除溶剂，残余物柱层析纯化，得到酰胺及回收的原料。
反应式如下所示 反应55小时结束。柱层析纯化石油醚-乙酸乙酯10∶1-乙酸乙酯，得到酰胺43mg(49％)。产物(R)-(-)-α-甲基-4-硝基苯乙酰胺浅黄色固体73％ ee，[α]D25-28．0(c1，CHCl3)．1H NMR(90 MHz，CDCl3)δ7．52，8．32(AB，4H，J=8Hz，Ar-H)，5．83(br s，2H，NH2)，3．72(q，1H，J=8Hz，CH)，1．56(d，3H，J=8Hz，CH3)．IR(KBr)vmax／cm-13455，3283，3202，1675(C=O)，1594，1515(NO2)，1350(NO2)，860．MS m／z (rel．Intensity ％)195(M++1，45．7)，151(85．5)，104(51．7)，103(37．4)，92(32)，91(100)，57(29．4)，44(30．3)．实施例8红球菌sp．D12对α-甲基-4-硝基苯乙腈的氰基水解的催化反应反应式如下所示 其他实验条件如实施例7，调节水相PH值至酸性，用乙醚萃取(50ml×3)，合并有机相，同上步骤洗涤、干燥、蒸除溶剂、纯化，得到酸。柱层析纯化石油醚-乙酸乙酯3∶1，得到酸40mg(45．4％)。产物(S)-(+)-α-甲基-4-硝基苯乙酸浅黄色固体79％ ee， [α]D25+46．3(c1，CHCl3)．1H NMR(90 MHz，CCl4)δ10．59(s，1H，COOH)，7．47，8．27(AB，4H，J=9Hz，Ar-H)，3．83(q，1H，J=8Hz，CH)，1．59(d，3H，J=8Hz，CH3)．IR(KBr)vmax／cm-13455，3283，3202，1675(C=O)，1594，1515(NO2)，1350(NO2)，860．MS m／z (rel．Intensity ％)196(M++1，9．0)，195(M+，23．9)，150(100)，105(25．1)，104(30．6)，103(324)，92(28)，91(31)，77(30．5)．实施例9红球菌sp．D12对α-甲基-4-甲氧基苯乙腈的氰基水解的催化作用反应式如下所示 其他实验条件如实施例7，反应30小时结束。柱层析纯化石油醚-乙酸乙酯3∶1，得到产物58mg(65％)。产物(R)-(-)-α-甲基-4-甲氧基苯乙酰胺白色固体10％ee．1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ7．20，6．85(AB，4H，J=8．5Hz，Ar-H)，6．15(s，1H，NH2)，5．44(s，1H，NH2)，3．79(s，3H，OC3)，3．52(q，1H，J=7．1Hz，CH)，1．48(d，3H，J=7．1Hz，CH3)．IR(KBr)vmax／cm-13347，3170(NH2)，2984，2838，1662(C=O)，1517，1464，1403，1253，1180，1031，832，788．MS m/z (rel．Intensity ％)180(M++1，3．5)，179(M+，9)，135(M+-CONH2，100)，105(20．7)，103(11．4)，91(16)，79(10．6)，77(11．1)，44(9)．实施例10红球菌sp．D12对α-甲基-4-甲氧基苯乙腈的氰基水解的催化作用反应式如下所示 其他实验条件如实施例8，30小时结束。柱层析纯化石油醚-乙酸乙酯3∶1，得到酸21mg(23％)。产物(S)-(+)-α-甲基-4-甲氧基苯乙腈酸白色固体，m．p．70-72℃。93％ ee，[α]D25+65．2(c 0．95，EtOH)．{Lit[10]．87．3％ee，[α]D22-61．5(c1．15，EtOH)，R}1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ7．23，6．84(AB，4H，J=8．7Hz，Ar-H)，3．78(s，3H，OCH3)，3．68(q，1H，J=7．2Hz，CH)，1．48(d，3H，J=7．1Hz，CH3)．IR(KBr)vmax／cm-13500-2800(br，OH)，1723(C=O)，1668，1611，1515，1457，1250，1180，1031，858，790．MS m／z (rel．Intensity ％)180(M++1，3．5)，179(M+，9)，135(M+-CONH2，100)，105(20．7)，103(11．4)，91(16)，79(10．6)，77(11．1)，44(9)．
红球菌sp．D12对α-甲基-2-萘乙腈的氰基水解的催化作用反应式如下所示 其他实验条件如实施例7，反应22小时结束。柱层析纯化石油醚-乙酸乙酯1∶1，得到产物55mg(63％)。产物(R)-(-)-α-甲基-2-萘乙酰胺白色固体3％ee，[α]D25-2．1(c1，CHCl3)．1H NMR(90 MHz，CDCl3)δ7．60-7．98(m，4H，Ar-H)，7．30-7．60(m，3H，Ar-H)，5．60(br s，2H，NH2)，3．80(q，1H，J=8Hz，CH)，1．60(d，3H，J=8Hz，CH3)．IR(KBr)vmax/cm-13349，3192(NH2)，3051，2986，1652(C=O)，1506，1458，1408，1114，891，817，740，672，475．MSm／z (rel．Intensity ％)199(M+，28．2)，156(25．4)，155(M+-CONH2，100)，153(22)，152(11)，141(11．6)，128(10)，127(7．9)．Anal．Calcd．for C13H13NOC，78．36；H，6．58；N，7．03．FoundC，78．18；H，6．61；N，6．55．实施例12红球菌sp．D12对α-甲基-2-萘乙腈的氰基水解的催化作用反应式如下所示 其他实验条件如实施例8，反应22小时结束。柱层析纯化石油醚-乙酸乙酯3∶1，得到产物25mg(28％)。产物(S)-(+)-α-甲基-2-萘乙酸白色固体，m．p．150-152℃98％ee，[α]D26+119．6(c 0．8，Me2CO){Lit[11]．[α]D25-129．38(c2．250，Me2CO)，R}1H NMR(90 MHz，CCl4)δ11．09(s，1H，COOH)，7．54-7．91(m，4H，Ar-H)，7．07-7．54(m，3H，Ar-H)，3．85(q，1H，J=8Hz，CH)，1．59(d，3H，J=8Hz，CH3)．IR(KBr)vmax／cm-12800-3080(br，COOH)，1698(C=O)，1599，1508，1458，1419，1225，900，865，831，803，745，690，481．MS m／z (rel．Intensity ％)200(M+，44．2)，155(M+-COOH，100)，153(21．8)，152(11．3)，129(7．3)，128(10．5)，127(8．1)，115(5．7)．实施例13红球菌sp．D12对6-甲氧基-α-甲基-2-萘乙腈的氰基水解的催化作用反应式如下所示 其他实验条件如实施例8，反应30小时结束。柱层析纯化石油醚-乙酸乙酯3∶1，得到产物24mg(27％)。产物(S)-(+)-6-甲氧基-α-甲基-2-萘乙酸白色固体，m．p．150-152℃98％ee，[α]D26+62．2(c 0．8，CHCl3){Lit[14]．[α]D25+65．5(c1，CHCl3，S}1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ7．72(d，3H，J=8．7Hz，Ar-H)，7．41(d，1H，J=8．8Hz，Ar-H)，7．14-7．10(m，2H，Ar-H)，4．02(s，3H，OMe)，3．87(q，1H，J=7．1Hz，CH)，1．6(d，3H，J=7．1Hz，CH3)．IR(KBr)vmax／cm-13196(br，COOH)，1729(C=O)，1605，1454，1265，1159，856，819，674，483．MS m／z (rel．Intensity ％)230(M+，48．1)，185(M+-COOH，100)，170(20．5)，154(11．7)，153(13．7)，142(9．4)，115(14．6)．实施例14红球菌sp．D12对-α-甲基-2-甲氧基苯乙腈的氰基水解的催化作用反应式如下所示 其他实验条件如实施例7，34小时结束。柱层析纯化石油醚-乙酸乙酯1∶1，得到产物58mg(65％)。产物(R)-(-)α-甲基-2-甲氧基苯乙酰胺白色固体34．2％ee，[α]D22-41．5(c1．23，CHCl3)．1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ7．32-7．23(m，2H，Ar-H)，6．98(t，1H，J=7．5Hz，ArH)，6．90(d，1H，J=8．2Hz，ArH)，5．66(s，2H，NH2)，3．88(s，3H，OCH3)，4．04(q，1H，J=7．1Hz，CH)，1．48(d，3H，J=7．1Hz， CH3)．IR(KBr)vmax／cm-13393，3196(NH2)，2968，1648(C=O)，1619，1494，1459，1245，756．MS m／z(rel．Intensity ％)180(M++1，7．7)，179(M+，22．1)，136(25．7)，135(M+-CONH2，100)，121(19．3)，105(29．9)，103(15．1)，91(23．5)，77(19．7)．Anal．Calcd．for C10H13NO2C，67．02；H，7．31；N，7．81．FoundC，67．15；H，7．28；N，7．81．实施例15红球菌sp．D12对-α-甲基-2-甲氧基苯乙腈的氰基水解的催化作用反应式如下所示 其他实验条件如实施例8，反应34小时结束。柱层析纯化石油醚-乙酸乙酯3∶1，得到酸21mg(28％)。产物(S)-(+)-α-甲基-2-甲氧基苯乙酸白色固体91．4％ee，[α]D22+60．3(c0．9，CHCl3)．{Lit．67％ee，[α]D-46(c，CHCl3)，R}1H NMR(90MHz，CCl4)δ10．73(s，1H，COOH)，7．35-7．0(m，2H，Ar-H)，7．0-6．65(m，2H，ArH)，3．8(s，3H，OCH3)，4．01(q，1H，J=7Hz，CH)，2．43(d，3H，J=7Hz，CH3)．IR(KBr)vmax／cm-13050-2750(br，OH)，1702(C=O)，1602，1588，1495，1459，1282，1243，1025，760．MS m／z(rel．Intensity％)181(M++1，2．6)，180(M+，29)，136(37．3)，135(M+-COOH，100)，121(42．3)，105(36．8)，103(20．8)，91(30．8)，77(23．6)．实施例16红球菌sp．D12对α-甲基-4-溴苯乙腈的氰基水解的催化作用反应式如下所示 其他实验条件如实施例7，反应4小时结束。柱层析纯化石油醚-乙酸乙酯1∶1，得到酰胺46mg(53％)。产物(R)-(-)-α-甲基-4-溴苯乙酰胺白色固体89．3％ee，[α]D22-48．7(c2．0，CHCl3)．1H NMR(90MHz，CDCl3)δ7．16，7．48(AB，4H，J=9Hz，Ar-H)，5．63(br s，2H，NH2)，3．55(q，1H，J=7Hz，CH)，1．47(d，3H，J=7Hz，CH3)．IR(KBr)vmax／cm-13395，3200(NH2)，1657(C=O)，1618，488，1451，1396，1075，1010，827，795．MS m／z(rel．Intensity％)229(M++2，20)，228(M++1，12)，227(M+，20)，185(M++2-CONH2，96)，184(51)，183(M+-CONH2，96)，148(11．4)，105(54．2)，104(100)，103(48)，77(29．7)．实施例17红球菌sp．D12对α-甲基-4-溴苯腈的氰基水解的催化作用反应式如下所示
其他实验条件如实施例8，反应4小时结束。柱层析纯化石油醚-乙酸乙酯3∶1，得到酸37mg(42％)。产物(S)-(+)-α-甲基-4-溴苯乙酸白色固体99．6％ee，[α]D22+48．5(c1．8，MeOH)．{Lit．93．9％ee．+46(MeOH)，S}￡1H NMR(90MHz，CCl4)δ9．7(br，s，1H，COOH)，7．46，7．15(AB，4H，J=9Hz，Ar-H)，3．65(q，1H，J=7Hz，CH)，1．52(d，3H，J=7Hz，CH3)．IR(KBr)vmax／cm-13050-2870(br，OH)，2984，2938，2879，1702(C=O)，1489，1461，1421，1403，1294，1280，827，749．MS m／z(rel．Intensity％)230(M++2，35)，228(M+，34)，185(M++2-COOH，98)，183(M+-COOH，100)，149(M+-Br，4)，104(66)，103(27)，81(24)，77(18)．
权利要求
1．一种红球菌，其特征是由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的编号为CGMCC No．0497的红球菌sp．D12(Rhodococcus sp．D12)。
2．一种如权利要求1所述的红球菌sp．D12的培养条件，其特征是(1)红球菌sp．D12菌体或其孢子接到斜面上，在斜面培养基中生长1-3天，所述的培养基成分是碳源0-20g／L、氮源1-15g／L、缓冲溶液0-10g／L、NaCl 0-1g／L、微量元素溶液0-5g／L，琼脂10-40g／L，PH=3-8，培养温度是15-40℃，其中所述的缓冲溶液是0．5-5g／L磷酸氢的一价金属盐或其水合物、0．5-5g／L磷酸二氢的一价金属盐或其水合物。(2)从斜面上取菌体在培养液中培养1-3天，所述的培养液成分是碳源0-20g／L、氮源1-15g／L、缓冲溶液0-10g／L、NaCl 0-1g／L、微量元素溶液0-5g／L、诱导剂0．2-10g／L，PH值是3-8，培养温度是15-40℃，缓冲溶液如前所述，所述的诱导剂是苯甲酰胺、尿素、乙腈、甲基丙烯腈、甲基丙烯酰胺、异丁酸、正丁腈、丙酰胺、甲酰胺或丙酸。
3．一种如权利要求2所述的红球菌sp．D12的培养条件，其特征是所述的碳源是葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖、木糖、可溶性淀粉、乙醇、丁二酸钠、甘露糖醇或可溶性糊精。
4．一种如权利要求2所述的红球菌sp．D12的培养条件，其特征是所述的氮源是酵母膏、牛肉浸膏、黄豆粉浸液、蛋白胨、L-谷氨酸钠、硫酸铵、氯化铵或硝酸铵。
5．一种如权利要求2所述的红球菌sp．D12的培养条件，其特征是一种如权利要求2所述的红球菌sp．D12的培养条件，其特征是所述的微量元素是锌、锰、钴、镍、镁、铁、钙、铜或硼。
6．一种如权利要求2所述的红球菌sp．D12的培养条件，其特征是诱导剂是菌株在培养液中培养16-32小时以后加入。
7．一种如权利要求2所述的红球菌sp．D12的培养条件，其特征是所述的培养基或培养液在107-127℃灭菌10-40分钟，
8．一种如权利要求2所述的红球菌sp．D12的培养条件，其特征是培养后得到的菌株用生理盐水洗涤，再离心或过滤分离得到菌株。
9．一种如权利要求2或6所述的红球菌sp．D12的培养条件，其特征是培养液成分是葡萄糖1-15g／L、牛肉浸膏2-8g／L、甲基丙烯酰胺1-5g／L、K2HPO4或K2HPO4、3H2O 0．5-2g／L、KH2PO40．5-3g／L、NaCl 0．1-0．5g／L、微量元素溶液0-2g／L。
10．一种如权利要求1所述的红球菌sp．D12的用途，其特征是用作氰基水解的催化剂。
全文摘要
本发明涉及一种红球菌sp.D12(Rhodococcus sp.D12),该菌株系从土壤中逐级筛选出并经分离纯化获得,并且提供了红球菌sp.D12的优化培养条件包括诱导剂的种类、氮源、碳源、诱导时间、诱导剂的量。该菌株在不同条件下将腈化物催化水解为羧酸、酰胺或它们的混合物。
文档编号C12P7/40GK1291648SQ0012745
公开日2001年4月18日 申请日期2000年11月17日 优先权日2000年11月17日
发明者李祖义, 吴中柳 申请人:中国科学院上海有机化学研究所