专利名称：从二氧化碳和水光生物生产丁醇的设计者生物体的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及生物安全防护型生物燃料能源生产技术。更具体地说，本发明 提供一种基于设计者转基因(designer transgenic)植物如转基因藻类、蓝绿藻(蓝藻 (cyanobacteria)和原绿球藻(oxychlorcAacteria))或植物细胞的光生物丁醇生产方法， 所述设计者转基因植物被产生来利用从光合过程获得的还原力(NADPH)和能量(ATP)直接 从二氧化碳(CO2)和水(H2O)立即合成丁醇(CH3CH2CH2CH2OH)。
背景技术：
丁醇(CH3CH2CH2CH2OH)是一种四碳醇，可用作液体燃料以驱动发动机，例如 汽车。丁醇可代替汽油，并且这两种燃料的能含量几乎相同(每加仑丁醇的能含量为 110，OOOBtu ；每加仑汽油的能含量为115，OOOBtu)。与乙醇相比，丁醇作为替代燃料也有很 多优越的性质。这些性质包括1) 丁醇的能含量(每加仑丁醇的能含量为110，OOOBtu)高 于乙醇(每加仑乙醇的能含量为84，OOOBtu) ；2) 丁醇的“蒸发性”比乙醇小6倍，比汽油小 13. 5倍，使得其作为氧合物使用时更加安全，从而消除在夏季和冬季对非常特殊的掺合物 的需求；幻丁醇可通过现有的燃料基础设施(包括汽油管道)运输，而乙醇必须通过铁路、 驳船或卡车运送；和4) 丁醇可以加仑对加仑地用作汽油的替代品，例如100%或任何其它 百分比，而乙醇只能用作汽油的添加剂，最高为约85% (E-85)，并且只有在对发动机显著 改进后才能使用(而丁醇可作为100%替代燃料工作，无需改进现有汽车发动机)。丁醇作为液体燃料在当前的运输和能源系统中已有巨大的潜在市场。丁醇也用作 工业溶剂。在美国，丁醇目前主要是由石油制造。历史上(20世纪初到20世纪50年代)， 人们通过典型地利用特定产丁醇菌(例如丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) 和拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii))的发酵方法从玉米和糖蜜制造生物丁醇，所述 发酵过程也产生丙酮和乙醇并且被称为ABE(丙酮、丁醇、乙醇)发酵。然而，当大约1卯4 年美国失去从古巴的低价糖供应时，利用发酵的丁醇生产就开始下滑，主要是因为石油价 格降到比糖价还低的水平。最近，对于使用梭菌和/或酵母发酵方法，从例如玉米淀粉等 生物质生产丁醇和/或乙醇重新给予了 R&D关注。然而，与“玉米淀粉乙醇生产”的情形类 似，“玉米淀粉丁醇生产”方法也需要很多的耗能步骤，包括农业玉米作物培育、玉米谷物收 获、玉米谷物淀粉加工和淀粉制糖制丁醇发酵。“玉米淀粉丁醇生产”方法也可能消耗与其 丁醇产物的能量值几乎一样多的能量。这并不令人吃惊，可以理解的原因是当前技术可以 利用的玉米淀粉只占包括玉米杆、叶子和根的玉米作物生物质的一小部分。玉米秸通常被 丢弃在农田里，缓慢分解成CO2，因为其在很大程度上代表了无法由当前的生物精炼工业有 效用于生产乙醇或丁醇的木质纤维素生物质材料。人们已经进行研究试图从木质纤维素植物生物质材料制造乙醇或丁醇，即称作“纤维素乙醇”或“纤维素丁醇”的概念。然而，植物 生物质已经进化出了有效机制以用于抵御微生物和动物界对其细胞壁结构糖的攻击。这种 性质构成天然顽抗性(natural recalcitrance)的基础，从而为节省成本地将木质纤维素 生物质转换为可发酵糖设置了障碍。因此，一个被称作“木质纤维素顽抗性”的难题在节省 成本地将植物生物质转换为可发酵糖这一方面构成了难以逾越的技术屏障。也就是说，因 为顽抗性问题，木质纤维素生物质(例如玉米秸、柳枝稷和木本植物材料)无法容易地转换 为可发酵糖，从而无法在没有特定预处理的情况下制造乙醇或丁醇，预处理通常与高昂的 加工成本有关。虽然在木质纤维素生物质预处理和发酵型丁醇生产加工方面的R&D工作已 有50多年之久，但是顽抗性木质纤维素的问题仍然是至今也无法消除的难以逾越的技术 屏障。此外，木质纤维素生物质培育、收获、预处理加工和纤维素制糖制丁醇发酵等步骤都 消耗能量。因此，任何可规避生物质技术中的这些瓶颈问题的新技术都是有用的。生氧光细菌(oxyphotobacteria)(也称作蓝绿藻，包括蓝藻和原绿 球藻)和藻类(例如莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、亚心形扁藻 (Platymonassubcordiformis) > /J、 求 (Chlorella fusca) > 1 it (Dunaliella salina)、布朗纤维藻(Ankistrodesmus braunii)禾口斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)) 可在液体培养基中利用从水形成的A来执行ω2的光合同化，其太阳能转换为生物质能的 最大理论转换率为约 ο %，并且在作为清洁再生能源方面具有巨大的潜力。然而，野生型产 氧光合绿色植物，例如蓝绿藻和真核藻类，并不具有从(X)2和H2O直接生产丁醇的能力。野 生型光合作用利用从光合水裂解和穿过藻类类囊体膜系统的与质子梯度偶联的电子传递 过程产生的还原力(NADPH)和能量(ATP)，在藻类或绿色植物叶绿体的基质区域，用统称为 “卡尔文循环(Calvincycle) ”的一系列酶将CO2还原为碳水化合物(CH2O)n，例如淀粉。野 生型光合过程的最终结果是根据以下过程反应利用太阳光能将(X)2和H2O转化为碳水化合 物(CH2O) n 和 O2 n(X)2+nH20— (CH2O) η+η02[1]碳水化合物(CH2O)n然后在细胞代谢和生长期间进一步转换为各种各样的复杂细 胞(生物质)材料，包括蛋白质、脂质和纤维素，以及其它细胞壁材料。在某些藻类如莱茵衣藻中，一些有机储备物如淀粉可通过二级发酵代谢途径缓慢 代谢成乙醇(而不是丁醇)。藻类发酵代谢途径与酵母发酵过程类似，淀粉借此被分解成较 小的糖，例如葡萄糖，其接着通过糖酵解过程转换为丙酮酸。丙酮酸然后可通过许多其它代 谢步骤转换为甲酸、乙酸和乙醇(G feller 和 Gibbs (1984)“Fermentative metabolism of Chlamydomonas reinhardtii, "PlantPhysiol. 75 :212-218)。此二级代谢过程的效率非常 有限，可能是因为其只能利用藻类细胞中有限的有机储备物如淀粉中的一小部分。此外，天 然藻类二级代谢过程不能产生任何丁醇。如上所述，丁醇具有许多优越的物理性质，使得其 可代替汽油用作燃料。因此，需要具有高的太阳能至丁醇能源转换效率的新颖光生物丁醇 生产机制。本发明提供革命性的设计者光合生物体，其能够利用太阳光直接从CO2和H2O合成 丁醇。本发明提供的光生物丁醇生产系统可避免上述生物质技术的所有瓶颈问题。
发明内容
本发明提供基于设计者转基因植物(例如藻类和生氧光细菌)或植物细胞的光 生物丁醇生产方法。设计者光合生物体是通过基因工程来产生，使得内源光合调控机制被 驯化，并且从光合水裂解和与质子梯度偶联的电子传递过程获得的还原力(NADPH)和能量 (ATP)可用于从二氧化碳(CO2)和水(H2O)直接合成丁醇(CH3CH2CH2CH2OH)。本发明的光生 物丁醇生产方法通过避免生物质技术的瓶颈问题完全消除了顽抗性木质纤维素的问题。预 期本发明的光合丁醇生产技术的太阳能至丁醇能源转换效率显著高于当前技术。本发明的光合丁醇生产方法的基础特征是产生设计者植物(例如藻类)或植物细 胞，其含有编码一组酶的转基因，所述酶可作用于卡尔文循环的中间产物并将中间产物直 接转化为丁醇，而不是制造淀粉和其它复杂生物质材料。因此，本发明尤其提供基于设计者 植物或植物细胞生产丁醇的方法，编码设计者丁醇生产途径的基因的DNA构建体，以及产 生的设计者植物和设计者植物细胞。一方面，本发明提供一种通过使设计者植物(例如设计者藻类或设计者蓝绿藻) 或植物细胞在液体培养基中生长来光合生产丁醇的方法，其中所述植物或植物细胞经基因 工程改造以表达一组酶，所述酶可作用于卡尔文循环的中间产物并将中间产物转化为丁醇。根据本发明，用于光合生产丁醇的设计者植物(例如设计者藻类)或设计者植 物细胞可利用基本上任何植物、植物组织或植物细胞作为宿主来产生，只要这类植物、植 物组织和细胞具有光合能力并且能在液体培养基中培养即可。在一优选实施方案中，利 用水生植物来产生设计者植物，包括(但不限于)水下水草(submersed aquatic herbs) (例如黑藻(Hydrilla verticillata)、/K 蕴草(Elodea densa)、气泡草(Aponogeton boivinanus)、7jC罗兰(Hygrophiladifformmis))、浮萍(duckweeds)(例如紫萍(Spirodela polyrrhiza)、无根萍(WolfTiaglobosa)、紫萍(Landoltia punctata) )、/K 芙蓉(water cabbage/Pistia stratiotes)、毛茛(buttercups/Ranunculus)、菱角(water caltrop) (四角菱(Trapa natans)和乌菱(Trapa bicornis))、睡莲(water lily)(例如齿叶 睡莲(Nymphaea lotus))、 /K 葫声(water hyacinth)(Eichhornia crassipes)、海藻 (seagrasses)(例如小竹叶(Heteranthera Zosterifolia))禾口藻类。在一特别优选的实施方案中，使用藻类作为宿主来产生用于光合生产丁醇的设计 者藻类。适用于本发明的藻类可为单细胞或多细胞藻类(后者包括(但不限于)海藻， 例如青海苔(Ulva latissima)(海白菜(sea lettuce))、褐藻(AscophylIum nodosum) 和紫菜(Porphyra tenera))，并且包括绿藻(绿藻门(Chlorophyta))、红藻(红藻门 (Rhodophyta))、褐藻(褐藻门(Phaeophyta))、硅藻(硅藻门(Bacillariophyta))和蓝绿 藻(生氧光细菌，包括蓝藻(Cyanophyta (cyanobacteria))和原绿球藻(Prochlorophyte ( oxychlorobacteria)))。原核蓝绿藻(生氧光细菌)和真核藻类都非常适用于本发明。用 于本发明的尤其优选的藻类物种是绿藻物种莱茵衣藻，其基因组最近已被测序。适合用于在宿主中产生设计者丁醇生产途径的酶的选择取决于设计者途径在卡 尔文循环的何种中间产物处开始从卡尔文循环分叉。在一个实施方案中，设计者途径从甘 油醛-3-磷酸点分叉，并通过使用例如由甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘 油酸变位酶、烯醇化酶、丙酮酸激酶、丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶(或丙酮酸-NADP+ 氧化还原酶)、硫解酶、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶、巴豆酸酶、丁酰辅酶A脱氢酶、丁醛脱氢酶和丁醇脱氢酶组成的一组酶将其转化为丁醇。在此设计者途径中，为了将两分子的甘油 醛-3-磷酸转化为丁醇，在由甘油醛-3-磷酸脱氢酶催化的从甘油醛-3-磷酸至1，3- 二磷 酸甘油酸的步骤中从NAD+产生两个NADH分子；同时两个NADH分子转化为NAD+ —个是在 由3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶催化的将乙酰乙酰辅酶A还原为3-羟基丁酰辅酶A的步骤 中，另一个是在由丁酰辅酶A脱氢酶催化的将巴豆酰辅酶A还原为丁酰辅酶A的步骤中。 因此，在此设计者途径中，所消耗NADH分子的数量与所产生NADH分子的数量保持平衡。此 外，由丁醛脱氢酶催化的将丁酰辅酶A还原为丁醛的步骤和由丁醇脱氢酶催化的将丁醛还 原为丁醇的最终步骤皆可使用NADPH，其可通过光合水裂解和与质子梯度偶联的电子传递 过程再生。因此，此设计者丁醇生产途径可连续工作。在另一个实例中，产生设计者途径，其采用中间产物3-磷酸甘油酸，并通过使用 例如由磷酸甘油酸变位酶、烯醇化酶、丙酮酸激酶、丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶、硫解 酶、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶、巴豆酸酶、丁酰辅酶A脱氢酶、丁醛脱氢酶和丁醇脱氢酶组成 的一组酶将其转化为丁醇。为了此3-磷酸甘油酸分叉的丁醇生产途径能够工作，使用可利 用NADPH的3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶和丁酰辅酶A脱氢酶非常重要，NADPH可由光驱动的 电子传递过程供应。可选地，当使用只能利用NADH的3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶和丁酰辅酶 A脱氢酶时，此处优选使用另一种实施方案，其可赋予NADPH/NADH转化机制，通过将NADPH 转化为NADH来供应NADH，以便于经由3-磷酸甘油酸分叉的设计者途径光合生产丁醇。在另一个实例中，产生设计者途径，其采用果糖-1，6-二磷酸，并通过使用例如由 醛缩酶、磷酸丙糖异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、烯 醇化酶、丙酮酸激酶、丙酮酸-NADP+氧化还原酶(或丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶)、硫 解酶、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶、巴豆酸酶、丁酰辅酶A脱氢酶、丁醛脱氢酶和丁醇脱氢酶组 成的一组酶将其转化为丁醇。在设计者生物体中添加另一种酶——即磷酸果糖激酶——可 允许产生另一种设计者途径，其从果糖-6-磷酸点分叉以便生产丁醇。类似于甘油醛-3-磷 酸分叉的丁醇生产途径，果糖-1，6- 二磷酸分叉的途径和果糖-6-磷酸分叉的途径自身皆 可产生NADH以用于途径中的以下步骤由3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶催化的将乙酰乙酰辅 酶A还原为3-羟基丁酰辅酶A的步骤，和由丁酰辅酶A脱氢酶催化的将巴豆酰辅酶A还原 为丁酰辅酶A的步骤。在这些设计者丁醇生产途径的每一种中，所消耗NADH分子的数量与 所产生NADH分子的数量保持平衡；并且丁醛脱氢酶(催化将丁酰辅酶A还原为丁醛的步 骤)和丁醇脱氢酶(催化将丁醛还原为丁醇的最终步骤)皆可利用NADPH，其可通过光合 水裂解和与质子梯度偶联的电子传递过程再生。因此，这些设计者丁醇生产途径可连续工 作。应注意，某些组的设计者酶可允许两种或两种以上的设计者途径、即从卡尔文循环的两 个或两个以上点分叉的用于生产丁醇的途径。根据本发明，对编码这些酶的核酸进行基因工程改造，使得所表达的酶插入宿主 叶绿体中以实现靶向细胞定位。设计者丁醇生产途径酶的靶向插入可经由使用编码基质 “信号”肽的核苷酸序列来实现，所述核苷酸序列被放置成与编码设计者酶的核苷酸序列可 操作地连接。许多转运肽序列都适合用于设计者丁醇生产酶靶向插入叶绿体中，包括(但 不限于)氢化酶载脂蛋白(例如Hydl)、铁氧还蛋白载脂蛋白(Frxl)、硫氧还蛋白m载脂 蛋白(Trx2)、谷氨酰胺合成酶载脂蛋白((^2)、LhcII载脂蛋白、PSII-T载脂蛋白(PsbT)、 PSII-S 载脂蛋白 O3SbShPSn-W载脂蛋白(PsbW)、CFtlCF1 亚基 ι 载脂蛋白(AtpC) XF0CF1亚基-δ载脂蛋白(AtpDhCFciCF1亚基-II载脂蛋白(AtpG)、光系统I (PSI)载脂蛋白(例 如基因 PsaD、PsaE, PsaF, PsaG, PsaH 和 PsaK 的 PSI 载脂蛋白)和 Rubisco 小亚基(SSU) 载脂蛋白(例如RbcS^的转运肽序列。优选的转运肽序列包括Hydl转运肽、Frxl转运肽 和Rubisco SSU转运肽(例如RbcS2)。另外根据本发明，设计者丁醇生产途径的表达是经由使用外部诱导型启动子来控 制，使得设计者转基因在某些特定条件下诱导性地表达。在一个实施方案中，用于控制设计 者基因表达的诱导型启动子是可由厌氧生活诱导的启动子，包括例如氢化酶基因(Hydl)、 编码细胞色素C6的载脂蛋白的Cyc6基因和编码粪生素(coprogen)氧化酶的Cpxl基因的 启动子。适合用于本发明的其它诱导型启动子包括硝酸还原酶(Nial)启动子、热休克蛋白 启动子HSP70A、CabII-I启动子、Cal启动子、Ca2启动子、亚硝酸还原酶基因(nirA)启动 子、双向氢化酶基因hox启动子、光反应性和热反应性groE启动子、Rubisco操纵子rbcL启 动子、金属(锌)诱导型smt启动子、铁反应性idiA启动子、氧化还原反应性crhR启动子、 热休克基因hspl6. 6启动子、小分子热休克蛋白(Hsp)启动子、CO2反应性碳酸酐酶基因启 动子、绿光/红光反应性cpcB2A2启动子、UV光反应性lexA、recA和ruvB启动子、硝酸还 原酶基因(narB)启动子和其组合。在本发明的另一方面，提供设计者DNA构建体，其含有编码一种或一种以上设计 者丁醇生产途径酶的一种或一种以上核苷酸序列，所述核苷酸序列各自被放置成与诱导型 启动子和编码适当叶绿体靶向转运肽的核苷酸序列可操作地连接。构建体可含有其它适当 序列，例如选择标记基因，以便于筛选和鉴别转化体。携带设计者基因的核酸构建体可使用 可用的基因转化技术递送到宿主藻类、植物生物体或植物组织或细胞中，例如电穿孔、天然 转化、接合、PEG诱导的摄入、DNA的基因枪递送和农杆菌介导的转化。已经产生的含有一种或一种以上设计者构建体的设计者植物(例如设计者藻 类)、植物组织和植物细胞形成本发明的另一个实施方案。在进一步的方面，本发明提供用 于增强光合丁醇生产的其它方法，相关设计者构建体，和设计者植物、植物组织和细胞。在一具体实施方案中，如上所述的光合产丁醇设计者植物(例如设计者藻类)、植 物组织或细胞已被进一步修饰成含有其它设计者转基因，以便诱导性地表达一种或一种以 上促进NADPH/NADH转化的酶，例如NAD+依赖性甘油醛_3_磷酸脱氢酶、NADPH磷酸酶和NAD 激酶。可选地，设计者植物、植物组织或细胞的3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶、丁酰辅酶A脱氢 酶、丁醛脱氢酶和丁醇脱氢酶可被选择和修饰，使得其也可利用NADPH。在另一个实施方案中，光合产丁醇设计者植物或植物组织或细胞已被进一步修饰 成使淀粉合成活性失活。在一具体实施方案中，所述进一步修饰包括引入编码和诱导性地 表达干扰RNA (iRNA)分子的设计者DNA构建体，所述iRNA分子特异性地抑制淀粉合成途径 酶(例如淀粉合成酶、葡萄糖-ι-磷酸腺苷酰转移酶、磷酸葡萄糖异构酶和/或磷酸葡萄糖 变位酶)的合成，以便增强丁醇光生物生产。在另一个实施方案中，光合产丁醇设计者植物或植物组织或细胞已被进一步修饰 成含有另外一组促进基质中的淀粉降解和糖酵解的设计者基因。此类其它设计者基因包 括例如编码淀粉酶、淀粉磷酸化酶、己糖激酶、磷酸葡萄糖变位酶和磷酸葡萄糖异构酶的基 因。在另一个实施方案中，光生物丁醇生产途径是分成几部分分布在叶绿体和细胞质中。设计者丁醇生产途径酶在叶绿体与细胞质之间的分布是通过在设计者DNA构建体中使 用和/或缺失转运肽序列来控制。在另一个实施方案中，光生物丁醇生产途径是全部分布在细胞质中，如在包括设 计者蓝藻和设计者原绿球藻的设计者生氧光细菌(蓝绿藻)的情况下。本发明还提供一种生物安全防护型光生物生物燃料生产技术，其是基于细胞分裂 可控型设计者转基因植物、藻类、蓝绿藻(蓝藻和原绿球藻)或植物细胞。细胞分裂可控型 设计者光合生物体含有两种关键功能设计者生物安全机制和设计者生物燃料生产途径。 设计者生物安全特征是由包括以下的许多机制赋予(1)设计者质子通道可诱导性地插入 细胞质膜以使任何细胞分裂和/或杂交能力永久丧失，( 选择性地应用设计者细胞分裂 周期调控蛋白或干扰RNA(iRNA)，以永久抑制细胞分裂周期且优选使细胞保持在G1期或 状态，和C3)创新使用高(X)2需求的宿主光合生物体以用于表达设计者生物燃料生产途径。 设计者细胞分裂控制技术可帮助确保使用设计者生物体来光合生产生物燃料中的生物安 全。本发明进一步提供一种使用设计者光合生物体(例如设计者蓝藻或藻类)结合光 生物反应器系统和丁醇分离/收集方法，利用太阳光从(X)2和H2O直接光生物生产丁醇和A 的方法。工业CO2来源和/或来自环境的大气(X)2皆可用于光生物丁醇生产方法中。
图1展现从卡尔文循环分叉的设计者丁醇生产途径，其使用来自光合水裂解和与 质子梯度偶联的电子传递过程的还原力(NADPH)和能量(ATP)，通过一系列酶促反应将二 氧化碳(CO2)还原为丁醇CH3CH2CH2CH2OtL图2A展现设计者丁醇生产途径基因的DNA构建体。图2B展现用于NADPH/NADH相互转化的NADPH/NADH转化设计者基因的DNA构建体。图2C展现设计者iRNA淀粉/糖原合成抑制剂基因的DNA构建体。图2D展现设计者淀粉降解-糖酵解基因的DNA构建体。图2E展现用于细胞溶质表达的设计者丁醇生产途径基因的DNA构建体。图2F展现用于在生氧光细菌中整合式基因转化的具有两个重组位点的设计者丁 醇生产途径基因的DNA构建体。图2G展现设计者生物安全控制基因的DNA构建体。图2H展现设计者质子通道基因的DNA构建体。图3A说明含有两种关键功能的细胞分裂可控型设计者生物体设计者生物安全 机制和设计者生物燃料生产途径。图;3B说明利用设计者生物安全机制从二氧化碳(CO2)和水(H2O)光生物生产丁醇 (CH3CH2CH2CH2OH)的细胞分裂可控型设计者生物体。图3C说明用于从二氧化碳(CO2)和水(H2O)生物安全守护性地光生物生产其它生 物燃料如乙醇(CH3CH2OH)的细胞分裂可控型设计者生物体。设计者光合生物体，例如设计者转基因植物(例如藻类和生氧光细菌)或植物细 胞。设计者植物和植物细胞是使用基因工程技术来产生，使得内源光合调控机制被驯化，并且从光合水裂解和与质子梯度偶联的电子传递过程获得的还原力(NADPH)和能量(ATP)可 立即用于根据以下过程反应从二氧化碳(CO2)和水(H2O)直接合成丁醇(CH3CH2CH2CH2OH)4C02+5H20 — CH3CH2CH2CH20H+602[2]本发明的光生物丁醇生产方法通过避免生物质技术的瓶颈问题完全消除了顽抗 性木质纤维素的问题。如图1所示，设计者生物体中的光合过程有效地利用来自光合水 裂解和与质子梯度偶联的电子传递过程的还原力(NADPH)和能量(ATP)，以便立即从二氧 化碳(CO2)和水(H2O)直接合成丁醇(CH3CH2CH2CH2OH),而不会排入用于合成非常难以且通 常不能用于生物精炼工业的不合需要的木质纤维素材料的其它途径中。这种方法与现有 的“玉米淀粉丁醇生产”方法也有所不同。根据本发明，丁醇可直接从二氧化碳(CO2)和水 (H2O)生产，而无需经历玉米淀粉丁醇生产方法必须经历的许多耗能步骤，包括玉米作物培 育、玉米谷物收获、玉米谷物玉米淀粉加工和淀粉制糖制丁醇发酵。因此，预期本发明的光 合丁醇生产技术具有显著高于(超过10倍)当前技术的太阳能至丁醇能源转化效率。假 定所提议的光合丁醇生产方法的太阳能转化效率为10%，那么最大理论生产力(产量)可 为每年每英亩约72，700kg 丁醇，这可维持约70辆汽车(每年每英亩)。因此，本发明可为 社会带来重要的能力以帮助确保能源安全。本发明也可帮助保护地球环境，避免大气中CO2 的危险积聚，因为本发明方法将(X)2直接转化为清洁的丁醇能源。本发明方法的基本特征是利用植物(例如藻类或生氧光细菌)或植物细胞，将编 码一组酶的核酸分子引入植物或植物细胞中，所述酶可作用于卡尔文循环的中间产物并将 中间产物转化为丁醇，如图1所示，而不是通过野生型光合途径制造淀粉和其它复杂细胞 (生物质)材料作为终产物。因此，本发明尤其提供生产丁醇的方法，其是基于设计者植物 (例如设计者藻类和设计者生氧光细菌)、设计者植物组织或设计者植物细胞、编码设计者 丁醇生产途径的基因的DNA构建体，以及所产生的设计者藻类、设计者生氧光细菌(包括设 计者蓝藻)、设计者植物、设计者植物组织和设计者植物细胞。本发明的各个方面在下文得 到更详细的描述。宿主光合生物体根据本发明，本发明的用于光合生产丁醇的设计者生物体或细胞可利用任何具有 光合能力(即通过光合作用捕获光能，使用所述能量将无机物转化为有机物的活性光合装 置和酶促途径)的植物(包括藻类和生氧光细菌)、植物组织或植物细胞作为宿主来产生。 优选地，宿主生物体应具有足够的光合ω2固定率，例如以支持从(X)2和H2O光合生产丁醇， 产率为每年每英亩至少约1，450kg 丁醇，更优选为每年每英亩7，270kg 丁醇，或甚至更优选 为每年每英亩72，700kg 丁醇。在一优选实施方案中，利用水生植物来产生设计者植物。水生植物，也称为水 栖植物，是生活在水生环境中或水生环境上的植物，例如水中(包括水面上或水面下) 或永久饱和土壤中。如本文所用，水生植物包括例如藻类、蓝绿藻(蓝藻和原绿球藻)、 水下水草(黑藻、水蕴草、杉叶藻(Hippuris vulgaris)、气泡草、硬叶浪草(Aponogeton Rigidifolius)、大卷浪草(AponogetonLongiplumulosus)、牛顿草(Didiplis Diandra)、 新加坡莫丝(Vesicularia Dubyana)、小柳(Hygrophilia Augustifolia)、珍珠金线 (Micranthemum Umbrosum)、大艾克草(Eichhornia Azurea)、美洲三白草(Saururus Cernuus)、舌头椒草(CryptocoryneLingua)、北极杉百叶草(Hydrotriche Hottoniiflora
19Eustralis Stellata)、红苦草(Vallisneria Rubra)、柳叶水蓑衣(Hygrophila Salicifolia)、泰国水剑(CyperusHelferi)、培茜椒草(Cryptocoryne Petchii)、美洲 苦草(Vallisneria americana)、托塔苦草(Vallisneria Torta)、北极杉(Hydrotriche Hottoniiflora)、黑乐草(CrassulaHelmsii)、石龙尾(Limnophila Sessiliflora)、穿叶目艮 子菜(PotamogetonPerfoliatus)、红松尾(Rotala Wallichii)、贝克椒草(Cryptocoryne Becketii)、无尾水筛(Blyxa Aubertii)、水罗兰)、浮萍(紫萍、无根萍、品藻(Lemna trisulca)、卵叶青萍(Lemna gibba)、青萍(Lemna minor)、紫萍(Landoltia punctata))、 水芙蓉、毛茛、菱角(四角菱和乌菱)、睡莲(齿叶睡莲、睡莲科(Nymphaeaceae)和莲科 (Nelumbonaceae))、7_K葫声(Eichhornia crassipes)、黑木藏(Bolbitisheudelotii)、7_K盾 草(Cabomba sp.)、海藻(小竹叶、波喜荡草科(Posidoniaceae)、大叶藻科(Zosteraceae)、 水鳖科(Hydrocharitaceae)和丝粉藻科(Cymodoceaceae))。从水生植物产生的丁醇可扩 散到水里，从而允许植物的正常生长和植物更稳定地产生丁醇。水生植物组织(包括(但 不限于)多细胞藻类)或细胞(包括(但不限于)单细胞藻类)的液体培养物也非常适合 使用，因为从设计者丁醇生产途径生产的丁醇分子可容易地从细胞或组织扩散到液体水介 质中，其可充当储存产物丁醇的巨大的池，产物丁醇随后可通过过滤和/或蒸馏/蒸发技术 收集。虽然水生植物或细胞是用于本发明方法的优选宿主生物体，但是具有光合能力且 可在液体培养基中培养的非水生植物的组织和细胞也可用于产生设计者组织或细胞以供 光合生产丁醇。举例来说，也可选择以下非水生植物组织或细胞用作本发明的宿主生物体 木苹果(Feronia limonia)的光自养幼苗组织培养物、玉米植物(Zea mays)的叶绿素愈伤 组织培养物、菊科(Asteraceae)和茄科(Solanaceae)物种的绿色根培养物、甘蔗茎杆薄壁 组织的组织培养物、小立碗藓(Physcomitrella patens)的组织培养物、大豆植物(Glycme max)的光合细胞悬浮培养物、绿色普通烟草(Nicotiana tabacum L.)细胞的光自养和光混 合营养培养物、针晶粟草(Gisekia pharnaceoides) (C4植物)的细胞悬浮培养物，和鲍威尔 览(Amaranthus powellii Wats.)、毛曼陀罗(Datura innoxia Mill.)、陆地棉(Gossypium hirsutum L.)禾口普通烟草(Nicotiana tabacum) χ 心叶烟(Nicotianaglutinosa L.)融合 杂交体的光合悬浮培养细胞系。“液体培养基”意谓液态水加上相对少量的无机营养物(例如N、P、K等，通常呈盐 形式)，用于光自养培养物；有时候也包括某些有机底物(例如蔗糖、葡萄糖或乙酸盐)，用 于光混合营养和/或光异养培养物。在一特别优选的实施方案中，本发明的丁醇生产方法所用的植物是藻类或蓝绿 藻。藻类和/或蓝绿藻的使用具有一些优势。其可在开放池塘中大量且低成本地生长。丁 醇从水相中的收集和纯化也可通过蒸馏/蒸发或膜分离容易地实现。适用于本发明的藻类包括单细胞藻类和多细胞藻类。可被选择用于本发明的多细 胞藻类包括(但不限于)海藻，例如青海苔(海白菜)、褐藻、刺松藻(Codiumfragile)、墨 角藻(Fucus vesiculosus)、细齿麒麟菜(Eucheuma denticulatum)、细江蓠(Gracilaria gracilis)、/K 网藻(Hydrodictyon reticulatum)、海带(Laminariajaponica)、裙带菜 (Undaria pinntifida)、昆布(Saccharina japonica)、条斑紫菜(Porphyra yezoensis)禾口 紫菜。合适的藻类也可选自以下藻类门绿藻(绿藻门)、红藻(红藻门)、褐藻(褐藻门)、硅藻(硅藻门)和蓝绿藻(生氧光细菌，包括蓝藻和原绿球藻)。合适的绿藻目包括石莼 目(Ulvales)、丝藻目(Ulotrichales)、团藻目(Volvocales)、小球藻目(Chlorellales)、 裂体藻目 Gchizogoniales)、鞘藻目(Oedogoniales)、双星藻目(Zygnematales)、刚毛 藻目(Cladophorales)、管藻目(Siphonales)和绒枝藻目(Dasycladales)。合适的红 藻属是紫菜属(Porphyra)、角叉菜属(Chondrus)、红藻属(Cyanidioschyzon)、紫球藻属 (Porphyridium)、江萬属(Gracilaria)、卡中白藻属(Kappaphycus)、石花菜属(Gelidium) 和Agardhiella。合适的褐藻属有昆布属(Laminaria)、裙带菜属(Undaria)、巨藻属 (Macrocystis)、马尾藻属(Sargassum)和网管藻属(Dictyosiphon)。合适的蓝藻属 (也称为蓝细菌)包括(但不限于)席藻属(Phoridium)、集胞藻属(Synechocystis)、 (Syncechococcus) > 1 ig M (Oscillatoria)禾口 fe 月星■ M (Anabaena) 。 & 适的原绿球藻属(也称为原绿球藻)包括(但不限于)原绿藻属(Prochloron)、原 绿毛菌属(Prochlorothrix)和原核绿藻属(Prochlorococcus)。合适的硅藻属有小 环藻属(Cyclotella)、筒柱藻属(Cylindrotheca)、舟形藻属(Navicula)、海链藻属 (Thalassiosira)和褐指藻属(Phaeodactylum)。用于本发明的优选藻类物种包括莱茵衣 藻、亚心形扁藻、小球藻、耐热性小球藻(Chlorella sorokiniana)、寻常小球藻(Chlorella vulgaris)、椭圆小球藻(‘Chlorella ‘ ellipsoidea)、小球藻(Chlorella spp.)、杜 氏盐藻、韦氏杜氏藻(Dunaliella viridis)、巴氏杜氏藻(Dunaliella bardowil)、雨 生血球藻(Haematococcus pluvialis) ；Parachlorella kessleri、琼枝(Betaphycus gelatinum)、敏波角叉菜(Chonrus crispus)、原始红藻(Cyanidioschyzon merolae)、 Cyanidiumcaldarium、Galdieria sulphuraria、匍枝凝花菜(Gelidiella acerosa)、张氏 江萬(Gracilaria changii)、长心卡中白藻(Kappaphycus alvarezii) > Porphyra miniata、 Ostreococcus tauri、条斑紫菜(Porphyra yezoensis)、紫球藻(Porphyridium sp·)、掌状 红皮藻(Palmaria palmata)、江蓠(Gracilaria spp.)、球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)、 + 中白■ (Kappaphycus spp.) > ! ! (Laminaria japanica) > ! ! (Laminariaspp.) >-RlIM (Monostroma spp.)、微拟球藻(Nannochloropsis oculata)、紫菜(Porphyra spp.)、紫 球藻(Porphyridium spp.)、裙带菜(Undaria pinnatifida)、石药(Ulva lactuca)、石药 (Ulva spp.)、裙带菜(Undaria spp.)、三角褐指藻(Phaeodactylum Tricorntum)、舟形藻 (Navicula saprophila)、^急甲藻(Crypthecodinium cohnii)、筒tt藻(Cylindrotheca fusiformis)、隐秘小环藻(Cyclotella cryptica)、纤细眼虫(Euglena gracilis)、前 沟藻(Amphidinium sp.)、单细胞双鞭毛藻(Symbiodinium microadriaticum) > 巨藻 (Macrocystis pyrifera)、布朗纤维藻和斜生栅藻。 用于本发明的优选蓝绿藻(生氧光细菌，包括蓝藻和原绿球藻)物种包括细长 嗜热聚球藻(Thermosynechococcus elongatus)BP-1、发菜(Nostoc sp. )PCC 7120、细 长聚球藻(Synechococcus elongatus) PCC 6301、聚球藻 PCC 7942 株、聚球藻 PCC 7002 株、集胞藻PCC 6803株、海洋原绿球藻(Prochlorococcus marinus)MED4、海洋原绿球藻 MIT 9313、海洋原绿球藻NATL1A、原绿球藻SS120、钝顶螺旋藻(Spirulina platensis) (钝顶节旋藻(Arthrospira platensis))、太平洋螺旋藻(Spirulina pacifica)、巨大 鞘丝藻(Lyngbya majuscule)、鱼月星藻(Anabaenasp.)、集胞藻(Synechocystis sp.)、 细长聚球藻(Synechococcus elongates)、聚球藻(Synechococcus) (MC-A)、束毛藻(Trichodesmium sp.)、胞内植生藻(Richeliaintracellularis)、聚球藻 WH7803、聚球 藻 WH8102、念珠藻(Nostoc punctiforme)、聚球藻 PCC 7943 株、集胞藻(Synechocyitis) PCC 6714藻蓝蛋白缺陷型突变株PD-1、蓝杆菌(Cyanothece) 51142株、蓝杆菌CCY0110、 丰裕颤藻(Oscillatoria limosa)、巨大鞘丝藻(Lyngbya majuscula)、藓生束藻 (Symploca muscorum)、无类囊体蓝藻(Gloeobacter violaceus)、原绿藻(Prochloron didemni)、荷兰原绿丝蓝细菌(Prochlorothrix hoi landica)、聚球藻(MC-A)、束毛 藻、胞内植生藻、海洋原绿球藻、原绿球藻SS120、聚球藻WH8102、巨大鞘丝藻、藓生束 藻、Synechococcusbigranulatus> 口誉冷賓员藻(cryophilic Oscillatoria sp.)、席藻 (Phormidium sp.)、发菜 _1、墙壁眉藻(Calothrix parietina)、口誉热 Synechococcus bigranulatus、灰蓝聚 求藻(Synechococcus lividus)、口誉热层理！!更枝藻(Mastigocladus laminosus)、佛氏拟绿胶蓝细菌(Chlorogloeopsis fritschii)PCC 6912、瓦氏聚球藻 (Synechococcus vulcanus)、聚球藻MA4株、聚球藻MA19株和细长嗜热聚球藻。适当选择宿主光合生物体的遗传背景和某些特殊特征也是有利的。举例来 说，从可在雪和冰中生长的嗜冷藻类(嗜冷生物)和/或从耐冷宿主菌株(例如衣藻 (Chlamydomonas)冷菌株CCMG1619——其已被表征为能在低达4°C执行光合水裂解(Lee， Blankinship 禾口 Greenbaum(1995)， “ Temperature effect onproduction of hydrogen and oxygen by Chlamydomonas cold strain CCMP1619 andwild type 137c, " Applied
Biochemistry and Biotechnology 51/52 :379-386))-产生的光合产丁醇设计者藻类
即使在寒冷季节或区域如加拿大也可允许光生物丁醇生产。同时，从嗜热/耐热光合生物 体(例如嗜热藻类如Cyanidium caldarium禾口 Galdieria sulphuraria,禾口 /或嗜热蓝藻 (蓝绿藻)如细长嗜热聚球藻BP-I和Synechococcus bigranulatus)产生的设计者藻类 可允许本发明在天气通常炎热的炎热季节或区域(例如墨西哥和美国西南地区，包括内华 达、加利福尼亚、亚利桑那、新墨西哥和德克萨斯)良好实施。此外，从海洋藻如亚心形扁藻 产生的光合产丁醇设计者藻类允许使用海水实施本发明，而从淡水藻如莱茵衣藻产生的设 计者藻类则可使用淡水。光合产丁醇设计者藻类的其它可选特征包括减小的叶绿素天线 尺寸，其已被证实可提供较高的光合生产率(Lee，Mets和Greenbaum(2002). “Improvement of photosynthetic efficiency at high lightintensity through reduction of chlorophyll antenna size,，，Applied Biochemistry andBiotechnology,98-100 : 37-48)；和丁醇耐受性，其允许从CO2和H2O更耐久且更有效地光合生产丁醇。通过使用 集胞藻PCC 6714的藻蓝蛋白缺陷型突变株，已在实验上证明了光抑制也可通过降低捕光 色素的含量来减轻(Nakajima，Tsuzuki 和 Ueda(1999) "Reduced photoinhibition of a phycocyanin-deficient mutant ofSynechocystis PCC 6714", Journal of Applied Phycology 10:447-452)。这些可选特征可例如通过使用丁醇耐受性和/或叶绿素天线缺 陷型突变株(例如莱茵衣藻DS521株)作为用设计者丁醇生产途径基因进行基因转化的宿 主生物体而并入设计者藻类中。因此，在各种实施方案之一中，宿主藻类选自绿藻、红藻、 褐藻、蓝绿藻(生氧光细菌，包括蓝藻和原绿球藻)、硅藻、海洋藻、淡水藻、单细胞藻类、多 细胞藻类、海藻、耐冷藻株、耐热藻株、捕光天线色素缺陷型突变株、耐丁醇藻株和其组合。在宿主中产生设计者丁醇生产途径选择适当的设计者酶
本发明的关键特征之一是产生设计者丁醇生产途径，以便驯化天然光合机制并与 其合作，从而符合需要地直接从CO2和H2O合成丁醇。天然光合机制包括(1)光合水裂解和 穿过类囊体膜的与质子梯度偶联的电子传递过程，其产生还原力(NADPH)和能量(ATP)，和 ⑵卡尔文循环，其通过消耗还原力(NADPH)和能量(ATP)来还原CO2。根据本发明，使用一系列酶来产生设计者丁醇生产途径，其采用卡尔文循环的中 间产物并将中间产物转化为丁醇，如图1所示。“设计者丁醇生产途径酶”在此处是定义为 用作设计者丁醇生产途径的至少一个步骤的催化剂的酶。根据本发明，可利用卡尔文循环 的许多中间产物来产生设计者丁醇生产途径；且设计者丁醇生产途径所需的酶的选择是取 决于设计者丁醇生产途径在卡尔文循环的何种中间产物处开始从卡尔文循环分叉。在一个实例中，产生设计者途径，其采用甘油醛-3-磷酸，并通过使用例如由甘油 醛-3-磷酸脱氢酶01、磷酸甘油酸激酶02、磷酸甘油酸变位酶03、烯醇化酶04、丙酮酸激酶
05、丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶06、硫解酶07、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶08、巴豆酸酶 09、丁酰辅酶A脱氢酶10、丁醛脱氢酶11和丁醇脱氢酶12组成的一组酶(如图1中的数 字标识01-12所示)，将其转化为丁醇。在此甘油醛-3-磷酸分叉的设计者途径中，为了将 两分子的甘油醛-3-磷酸转化为丁醇，在由甘油醛-3-磷酸脱氢酶01催化的甘油醛-3-磷 酸生成1，3-二磷酸甘油酸的步骤从NAD+产生两个NADH分子；同时两分子的NADH转化为 NAD+ 一个是在由3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶08催化的将乙酰乙酰辅酶A还原为3-羟基丁 酰辅酶A的步骤中，另一个是在由丁酰辅酶A脱氢酶10催化的将巴豆酰辅酶A还原为丁酰 辅酶A的步骤中。因此，在此甘油醛-3-磷酸分叉的设计者途径(01-12)中，所消耗NADH 分子的数量与所产生NADH分子的数量保持平衡。此外，由丁醛脱氢酶11催化的途径步骤 (将丁酰辅酶A还原为丁醛)和由丁醇脱氢酶12催化的最终步骤(将丁醛还原为丁醇)皆 可使用NADPH，所述NADPH可通过光合水裂解和与质子梯度偶联的电子传递过程再生。因 此，此甘油醛-3-磷酸分叉的设计者丁醇生产途径可连续工作。在另一实例中，产生设计者途径，其采用中间产物3-磷酸甘油酸，并通过使用例 如由磷酸甘油酸变位酶03、烯醇化酶04、丙酮酸激酶05、丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶
06、硫解酶07、3_羟基丁酰辅酶A脱氢酶08、巴豆酸酶09、丁酰辅酶A脱氢酶10、丁醛脱氢 酶11和丁醇脱氢酶12组成的一组酶(如图1中的数字标识03-12所示)将其转化为丁 醇。值得注意的是，甘油醛-3-磷酸分叉的设计者丁醇生产途径(01-12)中的最后10种 酶(03-12)与3-磷酸甘油酸分叉的设计者途径(03-1 所用的酶相同。换句话说，甘油 醛-3-磷酸分叉的途径的设计者酶(01-1 允许从卡尔文循环的3-磷酸甘油酸点和甘油 醛-3-磷酸点生产丁醇。然而，这两种途径具有不同的特征。与甘油醛-3-磷酸分叉的丁醇 生产途径不同，仅由10种酶(03-12)的活性组成的3-磷酸甘油酸分叉的途径自身无法产 生在以下两个位置使用所必需的任何NADH —个是在由3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶08催化 的将乙酰乙酰辅酶A还原为3-羟基丁酰辅酶A的步骤中，另一个是在由丁酰辅酶A脱氢酶 10催化的将巴豆酰辅酶A还原为丁酰辅酶A的步骤中。也就是说，如果(或当)使用只能 严格利用NADH而不能利用NADPH的3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶和/或丁酰辅酶A脱氢酶， 那么3-磷酸甘油酸分叉的途径(03-12)的工作将需要NADH供应。因此，为了 3-磷酸甘油 酸分叉的丁醇生产途径能够工作，使用可利用NADPH的3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶08和丁 酰辅酶A脱氢酶10非常重要，NADPH可由光驱动的电子传递过程供应。因此，对于此3-磷酸甘油酸分叉的设计者丁醇生产途径(图1中的03-12)，优选使用可利用NADPH或NADPH 与NADH两者(即NAD (P) H)的3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶和丁酰辅酶A脱氢酶。可选地，当 使用只能利用NADH的3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶和丁酰辅酶A脱氢酶时，此处优选使用另 一种实施方案，其可在设计者生物体中赋予NADPH/NADH转化机制(以通过将NADPH转化为 NADH来供应NADH，更多细节参看下文)，以便于通过3-磷酸甘油酸分叉的设计者途径光合 生产丁醇。在另一个实例中，产生设计者途径，其采用果糖-1，6-二磷酸，并通过使用由醛缩 酶20、磷酸丙糖异构酶21、甘油醛-3-磷酸脱氢酶22、磷酸甘油酸激酶23、磷酸甘油酸变位 酶对、烯醇化酶25、丙酮酸激酶沈、丙酮酸-NADP+氧化还原酶(或丙酮酸-铁氧还蛋白氧 化还原酶)27、硫解酶观、3_羟基丁酰辅酶A脱氢酶四、巴豆酸酶30、丁酰辅酶A脱氢酶31、 丁醛脱氢酶32和丁醇脱氢酶33组成的一组酶(如图1中的数字标识20-33所示)将其转 化为丁醇，其中仅有醛缩酶20和磷酸丙糖异构酶21相对于甘油醛-3-磷酸分叉的设计者 途径是额外的酶。使用丙酮酸-NADP+氧化还原酶27 (而不是丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还 原酶)催化丙酮酸分子转化为乙酰辅酶A可产生NADPH，其可用于丁醇生产途径的一些其它 步骤。在设计者生物体中添加另一种酶——即磷酸果糖激酶19可允许产生另一种设计者 途径，其从卡尔文循环的果糖-6-磷酸点分叉以生产丁醇。与甘油醛-3-磷酸分叉的丁醇 生产途径类似，果糖-1，6-二磷酸分叉的途径(20-3 和果糖-6-磷酸分叉的途径(19-33) 自身皆可产生NADH，以用于所述途径中由3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶四催化的将乙酰乙酰 辅酶A还原为3-羟基丁酰辅酶A的步骤和由丁酰辅酶A脱氢酶31催化的将巴豆酰辅酶A 还原为丁酰辅酶A的步骤。在这些设计者丁醇生产途径的每一种中，所消耗NADH分子的数 量与所产生NADH分子的数量保持平衡；并且丁醛脱氢酶32 (催化将丁酰辅酶A还原为丁醛 的步骤)和丁醇脱氢酶33 (催化将丁醛还原为丁醇的最终步骤)皆可利用NADPH，其可通过 光合水裂解和与质子梯度偶联的电子传递过程再生。因此，这些设计者丁醇生产途径可连 续工作。表1列举包括上文所鉴别的用于构建设计者丁醇生产途径的酶的实例。在本说明 书中，当提及酶时，例如表1所列举的任何酶，其包括其同工酶、功能类似物和经修饰的设 计者酶和其组合。这些酶可被选择用于构建设计者丁醇生产途径(例如图1所示的那些途 径)。“同工酶或功能类似物”是指具有相同催化功能，但可能具有或可能不具有完全相同的 蛋白质结构的某些酶。酶最基本的特征在于其催化酶促反应的活性位点。因此，也可选择 含有此类活性催化位点的某些酶-蛋白质片段或亚基用于本发明。出于各种原因，一些天 然酶不仅含有必需催化结构，而且还含有对于指定应用可能需要或可能不需要的其它结构 组分。使用生物信息学辅助的分子设计技术，可以选择用于构建编码期望设计者酶的设计 者DNA构建体的必需催化结构。因此，在各种实施方案之一中，通过根据生物信息学辅助的 分子序列设计而人工合成DNA构建体来产生设计者酶基因。使用计算机辅助的合成生物方 法，可选择性地修饰设计者酶的任何DNA序列(因此可选择性地修饰其蛋白质结构)以通 过设计获得更期望的结果。因此，术语“经修饰的设计者序列”和“经修饰的设计者酶”在本 文中被定义为用生物信息学辅助的分子设计修饰的DNA序列和酶蛋白。举例来说，当从线 粒体酶的序列设计叶绿体靶向的设计者酶的DNA构建体时，优选例如通过选择性地切除掉 不适用于指定应用的某些结构组分(例如其线粒体转运肽序列)，和/或通过添加为了赋予设计者蛋白质的叶绿体靶向插入能力所需的某些肽结构(例如外源叶绿体转运肽序列(例 如135-bp Rubisco小亚基转运肽(RbcS2)))，修饰一些蛋白质结构。因此，各种实施方案之 一灵活使用所述酶、其同工酶、功能类似物、经修饰的设计者酶和/或其组合构建设计者丁 醇生产途径。如表1所示，上文鉴别的酶的许多基因已经从各种生物体克隆和/或测序。可使用 基因组DNA和/或mRNA序列数据设计和合成设计者DNA构建体，以用于转化宿主藻类、生氧 光细菌、植物、植物组织或细胞，从而产生用于光生物丁醇生产的设计者生物体(图1)。然 而，因为各种来源生物体和细胞区室相对于特定宿主生物体和其叶绿体/类囊体环境(其 中丁醇生产途径被设计成与卡尔文循环一起工作)通常存在可能的变化，所以在DNA构建 体设计中的某些分子工程技术，包括密码子使用优化和序列修饰，通常是设计者DNA构建 体(图幻良好工作所必需的。举例来说，在产生产丁醇设计者真核藻类中，如果源序列是 来自细胞溶质酶(序列)，那么可添加功能叶绿体靶向序列，以便使由未知基因编码的设计 者酶能够插入宿主叶绿体中，从而将其功能赋予设计者丁醇生产途径。此外，为了对设计者 丁醇生产途径提供切换能力，如图2A所示在某些设计者DNA构建体中包含功能诱导型启动 子序列，例如氢化酶(Hydl)或硝酸还原酶(Nial)基因或亚硝酸还原酶(nirA)基因的启动 子，以控制设计者基因的表达，这也是重要的。此外，如先前所述，这些酶(序列)、叶绿体靶 向转运肽序列和诱导型启动子序列的某些功能衍生物或片段也可被选择使用，以全部、部 分或组合形式用于产生根据本发明的各种实施方案的设计者生物体。产生和使用设计者生 物体的技术在下文进一步描述。表1列举用于构建设计者丁醇生产途径的酶的实例。
权利要求
1.一种光合生产丁醇的方法，其包括使转基因设计者植物或植物细胞在液体培养基 中生长，其中所述植物或植物细胞是经基因工程改造以表达一组酶，所述酶作用于卡尔文 循环的中间产物并将所述中间产物转化为丁醇；和从所述液体培养基回收丁醇。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物是水生植物。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述水生植物选自由以下组成的组水 下水草(submersed aquatic herbs)(黑藻(Hydrilla verticillata)、 /K 蕴草 (Elodeadensa)、杉叶藻(Hippuris vulgaris)、气泡草(Aponogeton Boivinianus)、硬 口十夕良 ^ft (Aponogeton Rigidifolius) > ；^ ·夕良胃(Aponogeton Longiplumulosus) > 41 顿草(Didiplis Diandra)、新加坡莫丝(Vesicularia Dubyana)、小柳(Hygrophilia Augustifolia)、珍珠金线(Micranthemum Umbrosum)、大艾克草(Eichhornia Azurea)、 美洲三白草(Saururus Cernuus)、舌头椒草(Cryptocoryne Lingua)、北极杉百叶草 (Hydrotriche Hottoniiflora EustralisStellata)、红苦草(Vallisneria Rubra)、 柳叶水蓑衣(Hygrophila Salicifolia)、泰国水剑(Cyperus Helferi)、培茜椒草 (Cryptocoryne Petchii)、美洲苦草(Vallisneria americana)、托塔苦草(Vallisneria Torta)、北极杉(HydrotricheHottoniiflora)、黑乐草(Crassula Helmsii)、石龙尾 (Limnophila Sessiliflora)、穿叶目艮子菜(Potamogeton Perfoliatus)、红松尾(Rotala Wallichii)、贝克椒草(Cryptocoryne Becketii)、无尾水筛(Blyxa Aubertii)、水罗兰 (HygrophilaDifformmis))、浮萍(duckweeds)(紫萍(Spirodela polyrrhiza)、无 f艮萍 (Wolffiaglobosa)、品藻(Lemna trisulca)、卵叶青萍(Lemna gibba)、青萍(Lemnaminor)、, (Landoltia punctata))> ^R 胃 _ (water cabbage/Pistia stratiotes)> (buttercups/Ranunculus)、菱角(water caltrop)(四角菱(Trapa natans)禾口乌菱(Trapa bicornis))、睡莲(water lily)(齿叶睡莲(Nymphaea lotus)、睡莲禾斗(Nymphaeaceae) 禾口 莲禾斗(Nelumbonaceae))、 /K 葫声(waterhyacinth/Eichhornia crassipe)、黑 木蕨(Bolbitis heudelotii)、/K 盾草(Cabombasp.)、海藻(seagrasses)(小竹叶 (Heteranthera Zosterifolia)、波喜荡草禾斗(Posidoniaceae)、大叶藻禾斗(Zosteraceae)、 水鳖科(Hydrocharitaceae)和丝粉藻科(Cymodoceaceae))和藻类。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述藻类选自由以下组成的组绿藻、红藻、褐 藻、蓝绿藻(生氧光细菌(oxyphotobacteria)，包括蓝藻(cyanobacteria)和原绿球藻 (oxychlorobacteria))、硅藻、海洋藻、淡水藻、耐冷藻株、耐热藻株、天线色素缺陷型突变 株、耐丁醇藻株和其组合。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述藻类选自由以下组成的组莱茵衣藻 (Chlamydomonas reinhardtii)、亚心形扁藻(Platymonas subcordiformis)、小球藻 (Chlorella fusca)、耐热性小球藻(Chlorella sorokinima)、寻常小球藻(Chlorella vulgaris)、椭圆小球藻(‘Chlorella' ellipsoidea)、小球藻(Chlorellaspp.)、杜氏盐 藻(Dunaliella salina) λ^ ^:(Dunaliella viridis)、巴氏_土 氏―(Dunaliella bardowil)、雨生血球藻(Haematococcus pluvialis)、Parachlorella kessleri、琼枝 (Betaphycus gelatinum)、敏波角叉菜(Chondruscrispus)、原始红藻(Cyanidioschyzon merolae)、Cyanidium caldarium、Galdieriasulphuraria、匍枝凝花菜(Gelidiella acerosa)、张氏江蓠(Gracilaria changii)、长心卡巾白藻(Kappaphycus alvarezii)、Porphyra miniata、Ostreococcus tauri、条斑紫菜(Porphyra yezoensis)、紫 求藻 (Porphyridium sp·)、掌状红皮藻(Palmaria palmata)、江蓠(Gracilaria spp·)、球等鞭 金藻(Isochrysisgalbana)、卡巾白藻(Kappaphycus spp·)、海带(Laminaria japonica)、海 带(Laminaria spp·)、礁膜(Monostroma spp·)、微拟球藻(Nannochloropsisoculata)、紫 菜(Porphyra spp·)、紫球藻(Porphyridium spp·)、裙带菜(Undariapinnatifida)、石药 (Ulva lactuca)、石药(Ulva spp.)、裙带菜(Undaria spp·)、三角褐指藻(Phaeodactylum Tricornutum)、舟形藻(Navicula saprophila)、寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)、 筒柱藻(Cylindrotheca fusiformis)、隐秘小环藻(Cyclotella cryptica)、纤细眼 虫(Euglena gracilis)、前沟藻(Amphidinium sp·)、单细胞双鞭毛藻(Symbiodinium microadriaticum)、巨藻(Macrocystis pyrifera)、布朗纤维藻(Ankistrodesmus braunii)、斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)禾口其组合。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述藻类是莱茵衣藻。
7.根据权利要求4所述的方法，其中所述藻类选自由单细胞藻类、多细胞藻类和海藻 组成的组。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述海藻选自由以下组成的组青海苔(Ulva latissima)(海白菜(sea lettuce))、褐藻(Ascophyllum nodosum)、剌松藻(Codium fragile)、墨角藻(Fucus vesiculosus)、细齿麒麟菜(Eucheumadenticulatum)、细江 蓠(Gracilaria gracilis)、水网藻(Hydrodictyonreticulatum)、海带(Laminaria japonica)、裙带菜(Undaria pinntifida)、昆布(Saccharina japonica)、条斑紫菜 (Porphyra yezoensis)禾口紫菜(Porphyratenera) 0
9.根据权利要求4所述的方法，其中所述蓝绿藻(生氧光细菌，包括蓝藻和原绿球 藻)选自由以下组成的组细长嗜热聚球藻(Thermosynechococcuselongatus)BP-I、发 菜(Nostoc sp.)PCC 7120、细长聚球藻(Synechococcuselongatus)PCC 6301、聚球藻 (Syncechococcus sp.)PCC 7942 株、聚球藻 PCC7002 株、集胞藻(Syncechocystis sp.)PCC 6803株、海洋原绿球藻(Prochlorococcus marinus)MED4、海洋原绿球藻MIT 9313、海洋原 绿球藻 NATL1A、原绿球藻(Prochlorococcus) SS120、钝顶螺旋藻(Spirulina platensis) (钝顶节旋藻(Arthrospira platensis))、太平洋螺旋藻(Spirulina pacifica)、巨大 鞘丝藻(Lyngbya majuscule)、鱼月星藻(Anabaena sp·)、集胞藻(Synechocystis sp.)、 细长聚球藻(Synechococcus elongates)、聚球藻(MC-A)、束毛藻(Trichodesmium sp.)、胞内植生藻(Richelia intracellularis)、聚球藻 WH7803、聚球藻 WH8102、念珠 藻(Nostoc punctiforme)、聚球藻 PCC 7943 株、集胞藻(Synechocyitis)PCC 6714 藻 蓝蛋白缺陷型突变株PD-I、蓝杆菌(Cyanothece) 51142株、蓝杆菌CCYOl 10、丰裕颤 藻(Oscillatoria limosa)、巨大鞘丝藻(Lyngbya majuscula)、藓生束藻(Symploca muscorum)、无类囊体蓝藻(Gloeobacter violaceus)、原绿藻(Prochloron didemni)、荷 兰原绿丝蓝细菌(Prochlorothrix hollandica)、聚球藻(MC-A)、束毛藻、胞内植生藻、 海洋原绿球藻、原绿球藻SS120、聚球藻WH8102、巨大鞘丝藻、藓生束藻、Synechococcus bigranulatus、口誉冷賓员藻(cryophilic Oscillatoria sp·)、席藻(Phormidium sp.)、发 5 (Calothrix parietina)Synechococcus bigranulatus>^cMIK5l<iS (Synechococcus lividus)、嗜热层理鞭枝藻(Mastigocladus laminosus)、佛氏拟绿胶蓝细菌(Chlorogloeopsisfritschii)PCC 6912、瓦氏聚球藻(Synechococcus vulcanus)、聚 球藻MA4株、聚球藻MA19株和细长嗜热聚球藻。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物细胞是水生植物组织或细胞培养物。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物细胞是非水生植物组织或细胞培养物。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述非水生植物组织或细胞培养物选自由以 下组成的组木苹果(Feronia limonia)的幼苗组织培养物、玉米植物(Zeamays)的叶绿 素愈伤组织培养物、菊科(Asteraceae)和茄科(Solanaceae)物种的绿色根培养物、甘蔗 茎杆薄壁组织的组织培养物、小立碗藓(Physcomitrella patens)的组织培养物、大豆植 物(Glycine max)的光合细胞悬浮培养物、绿色普通烟草(Nicotiana tabacum L.)细胞 的光自养和光混合营养培养物、针晶粟草(Gisekia pharnaceoides) (C4植物)的细胞悬浮 培养物，和鲍威尔苋(Amaranthus powellii Wats·)、毛曼陀罗(Datura innoxiaMill.)、 陆地棉(Gossypium hirsutum L.)和普通烟草(Nicotiana tabacum) χ 心叶烟(Nicotiana glutinosa L.)融合杂交体的光合悬浮培养细胞系。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述一组酶是由磷酸甘油酸变位酶、烯醇化酶、 丙酮酸激酶、丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶(或丙酮酸-NADP+氧化还原酶)、硫解酶、 3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶、巴豆酸酶、丁酰辅酶A脱氢酶、丁醛脱氢酶、丁醇脱氢酶和其组合 组成。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述丁醛脱氢酶和丁醇脱氢酶可利用NADPH，或 NADPH 禾口 NADH0
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述一组酶是由甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸甘 油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇化酶、丙酮酸激酶、丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶(或 丙酮酸-NADP+氧化还原酶)、硫解酶、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶、巴豆酸酶、丁酰辅酶A脱 氢酶、丁醛脱氢酶、丁醇脱氢酶和其组合组成。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述一组酶是由醛缩酶、磷酸丙糖异构酶、甘 油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇化酶、丙酮酸激酶、丙酮 酸-NADP+氧化还原酶(或丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶)、硫解酶、3-羟基丁酰辅酶A脱 氢酶、巴豆酸酶、丁酰辅酶A脱氢酶、丁醛脱氢酶、丁醇脱氢酶和其组合组成。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述一组酶是由磷酸果糖激酶、醛缩酶、磷酸丙 糖异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇化酶、丙酮酸 激酶、丙酮酸-NADP+氧化还原酶(或丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶)、硫解酶、3-羟基丁 酰辅酶A脱氢酶、巴豆酸酶、丁酰辅酶A脱氢酶、丁醛脱氢酶、丁醇脱氢酶和其组合组成。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述一组酶是由淀粉酶、淀粉磷酸化酶、己糖 激酶、磷酸葡萄糖变位酶、磷酸葡萄糖异构酶、磷酸果糖激酶、醛缩酶、磷酸丙糖异构酶、甘 油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇化酶、丙酮酸激酶、丙酮 酸-NADP+氧化还原酶(或丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶)、硫解酶、3-羟基丁酰辅酶A脱 氢酶、巴豆酸酶、丁酰辅酶A脱氢酶、丁醛脱氢酶、丁醇脱氢酶和其组合组成。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述一组酶是经基因工程改造以插入宿主光合 生物体的叶绿体中。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述一组酶插入所述叶绿体中是由基质信号肽引导。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述信号肽选自由以下组成的组氢化酶转 运肽序列(HydAl和HydA^、铁氧还蛋白转运肽序列(Frxl)、硫氧还蛋白m转运肽序列 (Trx2)、谷氨酰胺合成酶转运肽序列(Gs2)、LhcII转运肽序列、PSII-T转运肽序列(I^bT)、 PSII-S转运肽序列(PsbS)、PSII-W转运肽序列(PsbWhCFtlCF1亚基-γ转运肽序列(AtpC)、 CF0CF1亚基-δ转运肽序列(AtpD)^CF0CF1亚基-II转运肽序列(AtpG)、光系统I (PSI)转 运肽序列、Rubisco SSU转运肽序列和其组合。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述信号肽是选自由以下组成的组的蛋白 MW^fisliii^ll :Hydl( i^^ll :msalvlkpca avsirgsscr arqvapraplaastvrvala tleaparrIg nvacaa, SEQ ID NO 54)、RbcS2(maaviakssvsaavarpars svrpmaalkp avkaapvaap aqanq, SEQ ID NO :55)、铁氧还蛋白转运肽(mamamrs，SEQ ID NO :56)、和 CF0CfI 亚基一δ 转运月太(mlaaksiagp rafkasavraapkagrrtvv vma, SEQ ID NO :57)禾口其组合。
23.根据权利要求1所述的方法，其中所述酶的表达由诱导型启动子控制。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述启动子可由厌氧生活诱导。
25.根据权利要求M所述的方法，其中所述启动子是氢化酶启动子。
26.根据权利要求23所述的方法，其中所述启动子可通过操纵设计者生物体培养基中 的硝酸盐相对于铵的浓度来诱导。
27.根据权利要求沈所述的方法，其中所述启动子是硝酸还原酶启动子。
28.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物或植物细胞是经基因工程改造以便还 含有编码至少一种促进NADPH/NADH转化以增强丁醇光生物生产的酶的DNA构建体。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述酶是NADPH磷酸酶或NAD激酶或其组合。
30.根据权利要求四所述的方法，其中所述酶的表达是由诱导型启动子控制，且在表 达后，所述酶插入叶绿体的基质区域。
31.根据权利要求观所述的方法，其中所述酶是NAD+依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述NADPH/NADH转化是通过两步机制实现i)使用卡尔文循环的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的步骤，其利用NADPH将1，3- 二磷酸甘油酸还原为甘油醛-3-磷酸；和 )使用所述NAD+依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶的步骤，其在将甘油醛-3-磷酸氧化 为1，3_ 二磷酸甘油酸中产生NADH。
33.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物或植物细胞经基因工程改造以还使淀 粉合成活性失活。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述淀粉合成活性失活包括抑制淀粉合成酶、 葡萄糖-ι-磷酸腺苷酰转移酶、磷酸葡萄糖异构酶或磷酸葡萄糖变位酶的表达或活性。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述失活包括引入DNA构建体，其编码和诱导性 地表达干扰iRNA分子。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述iRNA分子选自由淀粉合成酶iRNA、葡萄 糖-1-磷酸-腺苷酰转移酶iRNA、磷酸葡萄糖异构酶iRNA、磷酸葡萄糖变位酶iRNA和其组 合组成的组。
37.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物或植物细胞经基因工程改造以诱导性地表达另一组设计者酶，其促进叶绿体基质区域中的淀粉降解和糖酵解。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述另一组设计者酶包括淀粉酶、淀粉磷酸化 酶、己糖激酶、磷酸葡萄糖变位酶、磷酸葡萄糖异构酶、磷酸果糖激酶、醛缩酶、磷酸丙糖异 构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇化酶、丙酮酸激酶 和其组合。
39.一种核酸构建体，其从5’到3’包含诱导型启动子、编码基质信号肽的核苷酸序列 和编码光合丁醇生产途径酶的核苷酸序列。
40.根据权利要求39所述的构建体，其中所述酶选自由以下组成的组磷酸果糖激酶、 醛缩酶、磷酸丙糖异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、烯 醇化酶、丙酮酸激酶、丙酮酸-NADP+氧化还原酶(或丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶)、硫 解酶、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶、巴豆酸酶、丁酰辅酶A脱氢酶、丁醛脱氢酶、丁醇脱氢酶和 其组合。
41.一种核酸构建体，其从5’到3’包含诱导型启动子、编码基质信号肽的核苷酸序列 和编码至少一种促进NADPH/NADH转化的酶的核苷酸序列。
42.根据权利要求41所述的构建体，其中所述酶是NADPH磷酸酶或NAD激酶或NAD+依 赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶或其组合。
43.一种核酸构建体，其从5’到3’包含诱导型启动子和编码抑制淀粉合成酶表达的干 扰RNA分子的核苷酸序列。
44.根据权利要求43所述的构建体，其中所述淀粉合成酶选自由淀粉合成酶、葡萄 糖-1-磷酸(G-I-P)腺苷酰转移酶、磷酸葡萄糖变位酶和磷酸己糖异构酶组成的组。
45.一种核酸构建体，其从5’到3’包含诱导型启动子、编码基质信号肽的核苷酸序列 和编码促进淀粉降解和糖酵解的酶的核苷酸序列。
46.根据权利要求45所述的构建体，其中所述酶选自由以下组成的组淀粉酶、淀粉磷 酸化酶、己糖激酶、磷酸葡萄糖变位酶、磷酸葡萄糖异构酶、磷酸果糖激酶、醛缩酶、磷酸丙 糖异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇化酶、丙酮酸 激酶和其组合。
47.根据权利要求39、41、43或45中任一项权利要求所述的构建体，其中所述启动子 选自由以下组成的组氢化酶启动子[HydAl(Hydl)和HydA2，登记号AJ308413、AM89201、 AY090770]、Cyc6基因启动子、Cpxl基因启动子、热休克蛋白启动子HSP70A、CabII-I基因 (登记号MM072)启动子、Cal基因(登记号P20507)启动子、Ca2基因(登记号P24258) 启动子、硝酸还原酶(Nial)启动子、亚硝酸还原酶基因(nirA)启动子、双向氢化酶基因hox 启动子、光反应性和热反应性groE启动子、Rubisco操纵子rbcL启动子、金属(锌)诱导 型smt启动子、铁反应性idiA启动子、氧化还原反应性crhR启动子、热休克基因hspl6. 6 启动子、小分子热休克蛋白(Hsp)启动子、CO2反应性碳酸酐酶基因启动子、绿光/红光反应 性cpcB2A2启动子、UV光反应性lexA、recA和ruvB启动子、硝酸还原酶基因(narB)启动 子和其组合。
48.根据权利要求39、41、43或45中任一项权利要求所述的构建体，其中所述信号 肽是选自由以下组成的组的蛋白质的转运肽序列氢化酶载脂蛋白、铁氧还蛋白载脂蛋白 (Frxl)、硫氧还蛋白m载脂蛋白(Trx2)、谷氨酰胺合成酶载脂蛋白((^2) ,LhcII载脂蛋白、PSII-T 载脂蛋白(PsbT)、PSII-S 载脂蛋白(PsbS)、PSII-W 载脂蛋白(PsbW) JFtlCF1 亚基-Y 载脂蛋白(AtpChCFciCF1亚基-δ载脂蛋白(AtpDhCFciCF1亚基-II载脂蛋白(AtpG)、光系 统I(PSI)载脂蛋白、Rubisco SSU载脂蛋白和其组合。
49.一种可用于光合生产丁醇的转基因植物或植物细胞，其包含根据权利要求39、41、 43或45中任一项权利要求所述的核酸构建体。
50.一种可用于光合生产丁醇的转基因植物或植物细胞，其经基因工程改造以在叶绿 体中诱导性地表达磷酸甘油酸变位酶、烯醇化酶、丙酮酸激酶、丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还 原酶(或丙酮酸-NADP+氧化还原酶)、硫解酶、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶、巴豆酸酶、丁酰 辅酶A脱氢酶、丁醛脱氢酶和丁醇脱氢酶。
51.根据权利要求50所述的转基因植物或植物细胞，其还在叶绿体中诱导性地表达甘 油醛-3-磷酸脱氢酶和磷酸甘油酸激酶。
52.根据权利要求51所述的转基因植物或植物细胞，其还在叶绿体中诱导性地表达醛 缩酶和磷酸丙糖异构酶。
53.根据权利要求52所述的转基因植物或植物细胞，其还在叶绿体中诱导性地表达磷 酸果糖激酶。
54.根据权利要求53所述的转基因植物或植物细胞，其还在叶绿体中诱导性地表达淀 粉酶、淀粉磷酸化酶、己糖激酶、磷酸葡萄糖变位酶、磷酸葡萄糖异构酶。
55.根据权利要求49-54中任一项权利要求所述的转基因植物或植物细胞，其还在 叶绿体中诱导性地表达以下至少一种=NADPH磷酸酶；NAD激酶；抑制磷酸葡萄糖异构酶 (G-P-异构酶)或磷酸葡萄糖变位酶表达的干扰RNA分子；或促进淀粉降解和糖酵解的由 以下组成的一组酶的一部分或全部淀粉酶、淀粉磷酸化酶、己糖激酶、磷酸葡萄糖变位酶、 磷酸葡萄糖异构酶、磷酸果糖激酶、醛缩酶、磷酸丙糖异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸 甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇化酶、丙酮酸激酶和其组合。
56.根据权利要求49-55中任一项权利要求所述的转基因植物，其中所述植物是藻类。
57.根据权利要求49-55中任一项权利要求所述的转基因植物，其中所述设计者丁醇 生产途径酶不仅在叶绿体中，而且也在细胞质中表达和分布。
58.根据权利要求57所述的转基因植物，其中所述设计者丁醇生产途径酶在细胞质中 的所述表达通过在丁醇生产途径基因设计中省略叶绿体靶向序列实现。
59.根据权利要求49-55中任一项权利要求所述的转基因植物，其中所述植物是蓝绿 藻(蓝藻或原绿球藻)。
60.根据权利要求59所述的转基因植物，其中所述设计者丁醇生产途径酶通过在丁醇 生产途径基因设计中省略叶绿体靶向序列而全部在细胞质中表达。
61.一种光合生产丁醇的方法，所述方法包括以下步骤a)使转基因设计者植物、藻类、蓝绿藻或植物细胞在包含水的液体培养基中生长，其中 所述转基因设计者植物、藻类、蓝绿藻或植物细胞包含用于至少一种设计者丁醇生产途径 的至少一种外源转基因；b)诱导所述转基因设计者植物、藻类、蓝绿藻或植物细胞以产生被诱导转基因生物体， 其使所述至少一种转基因被激活以赋予至少一种设计者丁醇生产途径；和c)提供二氧化碳和光能，借此被诱导的转基因设计者植物、藻类、蓝绿藻或植物细胞将二氧化碳、水和光能转化为某些中间产物，最终转化为丁醇和氧。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述转基因设计者生物体使用(X)2作为主要碳 源进行光自养生长。
63.根据权利要求61所述的方法，其中转基因设计者生物体使用选自由以下组成的组 的有机底物进行光异养或光混合营养生长蔗糖、葡萄糖、乙酸盐、丁醇、甲醇、丙醇、丁醇、 丙酮、淀粉、半纤维素、纤维素、脂质、蛋白质、有机酸、生物质材料和其组合。
64.根据权利要求61所述的方法，其中步骤a)中具有氢化酶启动子控制型设计者基因 的设计者生物体的生长是在有氧环境下进行。
65.根据权利要求61所述的方法，其中步骤a)中具有硝酸还原酶启动子控制型设计者 基因的设计者生物体的生长是在有氧环境下在铵而不是硝酸盐形式的氮肥存在下进行。
66.根据权利要求61所述的方法，其中步骤a)中具有硝酸还原酶启动子控制型设计者 基因的设计者生物体的生长是在厌氧环境下在铵而不是硝酸盐形式的氮肥存在下进行。
67.根据权利要求61所述的方法，其中步骤b)中具有氢化酶启动子控制型设计者基因 的设计者生物体的诱导是在无A的厌氧环境下进行。
68.根据权利要求61所述的方法，其中步骤b)中具有硝酸还原酶启动子控制型设计者 基因的设计者生物体的诱导是在有氧环境下通过添加硝酸盐形式的氮肥进行。
69.根据权利要求61所述的方法，其中步骤b)中具有硝酸还原酶启动子控制型设计者 基因的设计者生物体的诱导是在厌氧环境下通过添加硝酸盐形式的氮肥进行。
70.根据权利要求61所述的方法，其中所提供的CO2的来源是来自燃烧化石燃料和/ 或燃烧生物质的工业设施的烟气co2。
71.根据权利要求61所述的方法，其中来自燃烧化石燃料和/或燃烧生物质的工业设 施的烟气(X)2流通过管道引入生物反应器中。
72.根据权利要求61所述的方法，其中所提供的(X)2的来源是来自环境和大气的空气CO2。
73.根据权利要求61所述的方法，其中所提供的CO2的其它来源选自由气态CO2、溶解 CO2、碳酸氢盐和碳酸盐组成的组。
74.根据权利要求70所述的方法，其中产生CO2供应的所述燃烧化石燃料和/或燃烧生 物质的工业设施选自由以下组成的组燃煤电厂、炼钢铁工业、水泥厂、炼油设施、化肥厂、 燃烧生物质和/或化石燃料的生物燃料蒸馏/分离设施、生物质热解工艺、烟 、发酵生物 反应器、生物燃料精炼设施和其组合。
75.根据权利要求61所述的方法，其进一步包括以下步骤d)通过膜过滤与丁醇收集技术的组合从环境收集丁醇；e)收集用过的从被诱导转基因生物体转化而来的转基因设计者生物体；f)重复权利要求61的步骤a)到c)和步骤d)和e)，以用于连续的光生物丁醇生产。
76.根据权利要求75所述的方法，其进一步包括收集也可由被诱导的转基因设计者生 物体利用所述设计者丁醇生产途径生产的中间产物的步骤。
77.根据权利要求76所述的方法，其中可利用所述设计者途径从(X)2和H2O光生物生产 的所述中间产物选自由以下组成的组丁醛、丁酰辅酶A、巴豆酰辅酶A、3-羟基丁酰辅酶A、 乙酰乙酰辅酶A、乙酰辅酶A、丙酮酸、磷酸烯醇丙酮酸、2-磷酸甘油酸、1，3-二磷酸甘油酸、甘油醛-3-磷酸、二羟基丙酮磷酸、果糖-1，6- 二磷酸、果糖-6-磷酸、6-磷酸葡萄糖、葡萄 糖、葡萄糖-1-磷酸和其组合。
78.根据权利要求77所述的方法，其中所述中间产物的生产可通过关闭催化设计者途 径中所述中间产物的消耗的设计者酶活性来选择性地增强。
79.根据权利要求77所述的方法，其中所述中间产物的生产可通过使用设计者生物体 来增强，其中编码催化所述中间产物的消耗的酶的设计者基因从设计者途径中选择性地省 略。
80.一种用于生物燃料的生物安全防护型光合生产的方法，其包括使细胞分裂可控 型转基因设计者植物或植物细胞在液体培养基中生长，其中所述植物或植物细胞经基因工 程改造以含有设计者生物安全机制并表达一组设计者生物燃料生产途径酶，所述酶作用于 卡尔文循环的中间产物并将所述中间产物转化为生物燃料；和从所述液体培养基回收生物 燃料。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述植物是水生植物。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述水生植物选自由以下组成的组水下水 草(黑藻、水蕴草、杉叶藻、气泡草、硬叶浪草、大卷浪草、牛顿草、新加坡莫丝、小柳、珍珠金 线、大艾克草、美洲三白草、舌头椒草、北极杉百叶草、红苦草、柳叶水蓑衣、泰国水剑、培茜 椒草、美洲苦草、托塔苦草、北极杉、黑乐草、石龙尾、穿叶眼子菜、红松尾、贝克椒草、无尾水 筛、水罗兰)、浮萍(紫萍、无根萍、品藻、卵叶青萍、青萍、紫萍)、水芙蓉、毛茛、菱角(四角 菱和乌菱)、睡莲(齿叶睡莲、睡莲科和莲科)、水葫芦、黑木蕨、水盾草、海藻(小竹叶、波喜 荡草科、大叶藻科、水鳖科和丝粉藻科)和藻类。
83.根据权利要求82所述的方法，其中所述藻类选自由以下组成的组绿藻、红藻、褐 藻、蓝绿藻(生氧光细菌，包括蓝藻和原绿球藻)、硅藻、海洋藻、淡水藻、耐冷藻株、耐热藻 株、天线色素缺陷型突变株、耐丁醇藻株和其组合。
84.根据权利要求82所述的方法，其中所述藻类选自由以下组成的组莱茵衣藻、 亚心形扁藻、小球藻、耐热性小球藻、寻常小球藻、椭圆小球藻、小球藻、杜氏盐藻、韦氏杜 氏藻、巴氏杜氏藻、雨生血球藻、Parachlorella kessleri、琼枝、皱波角叉菜、原始红藻、 Cyanidium caldarium、Galdieria sulphuraria、甸枝凝花菜、张氏江萬、长心卡帕藻、 Porphyra miniata、Ostreococcus tauri、条斑紫菜、紫球藻、掌状红皮藻、江蓠、球等鞭金 藻、卡帕藻、海带、海带、礁膜、微拟球藻、紫菜、紫球藻、裙带菜、石莼、石莼、裙带菜、三角褐 指藻、舟形藻、寇氏隐甲藻、筒柱藻、隐秘小环藻、纤细眼虫、前沟藻、单细胞双鞭毛藻、巨藻、 布朗纤维藻、斜生栅藻和其组合。
85.根据权利要求82所述的方法，其中所述藻类是莱茵衣藻。
86.根据权利要求82所述的方法，其中所述藻类选自由单细胞藻类、多细胞藻类和海 藻组成的组。
87.根据权利要求86所述的方法，其中所述海藻选自由以下组成的组青海苔(海白 菜)、褐藻、刺松藻、墨角藻、细齿麒麟菜、细江蓠、水网藻、海带、裙带菜、昆布、条斑紫菜和紫ο
88.根据权利要求83所述的方法，其中所述蓝绿藻(生氧光细菌，包括蓝藻和原绿球 藻)选自由以下组成的组细长嗜热聚球藻BP-1、发菜PCC 7120、细长聚球藻PCC 6301、聚球藻PCC 7942株、聚球藻PCC 7002株、集胞藻PCC 6803株、海洋原绿球藻MED4、海洋原绿 球藻MIT 9313、海洋原绿球藻NATL1A、原绿球藻SS120、钝顶螺旋藻(钝顶节旋藻)、太平洋 螺旋藻、巨大鞘丝藻、鱼腥藻、集胞藻、细长聚球藻、聚球藻(MC-A)、束毛藻、胞内植生藻、聚 球藻WH7803、聚球藻WH8102、念珠藻、聚球藻PCC 7943株、集胞藻PCC 6714藻蓝蛋白缺陷 型突变株PD-1、蓝杆菌51142株、蓝杆菌CCY0110、丰裕颤藻、巨大鞘丝藻、藓生束藻、无类囊 体蓝藻、原绿藻、荷兰原绿丝蓝细菌、聚球藻(MC-A)、束毛藻、胞内植生藻、海洋原绿球藻、原 绿球藻SS120、聚球藻WH8102、巨大鞘丝藻、藓生束藻、Synechococcus bigranulatus、嗜冷 颤藻、席藻、发菜-1、墙壁眉藻、嗜热Synechococcus bigranulatus、灰蓝聚球藻、嗜热层理 鞭枝藻、佛氏拟绿胶蓝细菌PCC 6912、瓦氏聚球藻、聚球藻MA4株、聚球藻MA19株和细长嗜 热聚球藻。
89.根据权利要求80所述的方法，其中所述植物细胞是水生植物组织或细胞培养物。
90.根据权利要求80所述的方法，其中所述植物细胞是非水生植物组织或细胞培养物。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述非水生植物组织或细胞培养物选自由以下 组成的组木苹果的幼苗组织培养物、玉米植物的叶绿素愈伤组织培养物、菊科和茄科物种 的绿色根培养物、甘蔗茎杆薄壁组织的组织培养物、小立碗藓的组织培养物、大豆植物的光 合细胞悬浮培养物、绿色普通烟草细胞的光自养和光混合营养培养物、针晶粟草(C4植物) 的细胞悬浮培养物，和鲍威尔苋、毛曼陀罗、陆地棉和普通烟草χ心叶烟融合杂交体的光合 悬浮培养细胞系。
92.根据权利要求80所述的方法，其中所述设计者生物安全机制包括可在某些特定诱 导条件下诱导的设计者质子通道基因。
93.根据权利要求92所述的方法，其中所述设计者质子通道基因是在某些特定诱导条 件下诱导性地表达，以将设计者质子通道插入细胞质膜并保持光合类囊体膜完好。
94.根据权利要求93所述的方法，其中设计者质子通道在细胞质膜中的所述插入破 坏横跨细胞质膜的质子梯度，从而使任何细胞分裂和杂交能力永久丧失以帮助确保生物安 全。
95.根据权利要求92所述的方法，其中所述设计者质子通道基因包括诱导型启动子、 质子通道编码序列和转录与翻译终止子。
96.根据权利要求95所述的方法，其中所述质子通道编码序列是蜂毒肽编码序列。
97.根据权利要求95所述的方法，其中所述诱导型启动子是硝酸还原酶Mal启动子。
98.根据权利要求80所述的方法，其中所述设计者生物安全机制包括可在某些特定诱 导条件下诱导的设计者细胞分裂周期iRNA基因。
99.根据权利要求98所述的方法，其中所述设计者细胞分裂周期iRNA基因在某些特定 诱导条件下诱导性地表达，以永久抑制细胞分裂周期并保持细胞处于G1期或状态以帮助 确保生物安全。
100.根据权利要求80所述的方法，其中所述设计者生物安全机制是通过使用高(X)2需 求突变株作为宿主生物体而赋予，所述宿主生物体是供设计者生物燃料生产途径基因转化 之用，以便产生所述设计者细胞分裂可控型光合生物体。
101.根据权利要求100所述的方法，其中所述高CO2需求突变株选自由以下组成的组莱茵衣藻碳酸酐酶缺陷型突变株12-1C(CC-1219 cal mt_)、莱茵衣藻cia3突变株、聚球藻 PCC 7942株的高CO2需求突变株M3、集胞藻PCC 6803的羧酶体缺陷型细胞和其组合。
102.根据权利要求100所述的方法，其中所述设计者生物燃料生产途径基因选自由以 下组成的组设计者丁醇生产途径基因、设计者乙醇生产途径基因、生物油生产基因、生物 氢生产基因和其组合。
103.根据权利要求80所述的方法，其中所述设计者生物燃料生产途径酶选自由以下 组成的组设计者乙醇生产途径酶、设计者丁醇生产途径酶和其组合。
104.根据权利要求80所述的方法，其中所述设计者生物燃料生产途径酶选自由以下 组成的组淀粉酶、淀粉磷酸化酶、己糖激酶、磷酸葡萄糖变位酶、磷酸葡萄糖异构酶、磷酸 果糖激酶、醛缩酶、磷酸丙糖异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸 变位酶、烯醇化酶、丙酮酸激酶、丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶、丙酮酸-NADP+氧化还原酶(或丙 酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶)、硫解酶、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶、巴豆酸酶、丁酰辅酶A 脱氢酶、丁醛脱氢酶、丁醇脱氢酶和其组合。
105.根据权利要求80所述的方法，其中所述设计者生物安全机制和所述生物燃料生 产途径酶的表达是通过使用诱导型启动子控制。
106.根据权利要求80所述的方法，其中所述诱导型启动子选自由以下组成的组氢化 酶启动子[HydAl(Hydl)和 HydA2，登记号AJ308413、AM89201、AY090770]、Cyc6 基因启动 子、Cpxl基因启动子、热休克蛋白启动子HSP70A、CabII-I基因(登记号MM072)启动子、 Cal基因(登记号P20507)启动子、Ca2基因(登记号P24258)启动子、硝酸还原酶(Nial) 启动子、亚硝酸还原酶基因(nirA)启动子、双向氢化酶基因hox启动子、光反应性和热反 应性groE启动子、Rubisco操纵子rbcL启动子、金属(锌)诱导型smt启动子、铁反应性 idiA启动子、氧化还原反应性crhR启动子、热休克基因hspl6.6启动子、小分子热休克蛋白 (Hsp)启动子、CO2反应性碳酸酐酶基因启动子、绿光/红光反应性cpcB2A2启动子、UV光 反应性leXA、recA和ruvB启动子、硝酸还原酶基因(narB)启动子和其组合。
107.一种光合生产生物燃料的方法，所述方法包括以下步骤a)使细胞分裂可控型转基因设计者植物、藻类、蓝绿藻(生氧光细菌)或植物细胞在包 含水的液体培养基中生长，其中所述转基因设计者植物、藻类、蓝绿藻或植物细胞包含用于 至少一种设计者生物燃料生产途径的至少一种外源转基因；b)诱导所述转基因设计者植物、藻类、蓝绿藻或植物细胞以产生被诱导转基因生物体， 其使得所述至少一种转基因被激活以赋予至少一种设计者生物燃料生产途径；和c)提供二氧化碳和光能，借此被诱导的转基因设计者植物、藻类、蓝绿藻或植物细胞将 二氧化碳、水和光能转化为某些中间产物，最终转化为生物燃料(例如乙醇和/或丁醇)和 氧。
108.根据权利要求107所述的方法，其中所述细胞分裂可控型转基因设计者生物体使 用(X)2作为主要碳源进行光自养生长。
109.根据权利要求107所述的方法，其中细胞分裂可控型转基因设计者生物体使用选 自由以下组成的组的有机底物进行光异养或光混合营养生长蔗糖、葡萄糖、乙酸盐、甲醇、 丙醇、丁醇、丙酮、淀粉、半纤维素、纤维素、脂质、蛋白质、有机酸、生物质材料和其组合。
110.根据权利要求107所述的方法，其中步骤a)中具有氢化酶启动子控制型设计者基因的细胞分裂可控型设计者生物体的生长是在有氧环境下进行。
111.根据权利要求107所述的方法，其中步骤a)中具有硝酸还原酶启动子控制型设计 者基因的细胞分裂可控型设计者生物体的生长是在有氧环境下在铵而不是硝酸盐形式的 氮肥存在下进行。
112.根据权利要求107所述的方法，其中步骤a)中具有硝酸还原酶启动子控制型设计 者基因的细胞分裂可控型设计者生物体的生长是在厌氧环境下在铵而不是硝酸盐形式的 氮肥存在下进行。
113.根据权利要求107所述的方法，其中步骤b)中具有氢化酶启动子控制型设计者基 因的细胞分裂可控型设计者生物体的诱导是在无O2的厌氧环境下进行。
114.根据权利要求107所述的方法，其中步骤b)中具有硝酸还原酶启动子控制型设计 者基因的设计者生物体的诱导是在有氧环境下通过添加硝酸盐形式的氮肥进行。
115.根据权利要求107所述的方法，其中步骤b)中具有硝酸还原酶启动子控制型设计 者基因的设计者生物体的诱导是在厌氧环境下通过添加硝酸盐形式的氮肥进行。
116.根据权利要求107所述的方法，其中所提供的(X)2的来源是来自燃烧化石燃料和 /或生物质的工业设施的烟气co2。
117.根据权利要求107所述的方法，其中来自燃烧化石燃料和/或生物质的工业设施 的烟气(X)2流通过管道引入生物反应器中。
118.根据权利要求107所述的方法，其中所提供的(X)2的来源是来自环境和大气的空 气 CO2。
119.根据权利要求107所述的方法，其中所提供的(X)2的其它来源选自由气态0)2、溶 解CO2、碳酸氢盐和碳酸盐组成的组。
120.根据权利要求119所述的方法，其中产生CO2供应的所述燃烧化石燃料和/或生 物质的工业设施选自由以下组成的组燃煤电厂、炼钢铁工业、水泥厂、炼油设施、化肥厂、 生物质燃烧和/或化石燃料燃烧生物燃料蒸馏/分离设施、生物质热解工艺、烟 、发酵生 物反应器、生物燃料精炼设施和其组合。
121.根据权利要求107所述的方法，其进一步包括以下步骤d)通过膜过滤与生物燃料收集技术的组合从环境收集生物燃料；e)收集用过的从被诱导转基因生物体转化而来的转基因设计者生物体；f)使用所述细胞分裂可控型设计者生物体，重复权利要求107的步骤a)到c)和步骤 d)和e)，以用于生物燃料的连续的生物安全防护型光生物生产。
122.根据权利要求121所述的方法，其进一步包括收集也可由被诱导转基因设计者生 物体利用所述设计者丁醇生产途径生产的中间产物的步骤。
123.根据权利要求122所述的方法，其中可利用所述设计者途径从(X)2和H2O光生物 生产的所述中间产物选自由以下组成的组乙醛、丁醛、丁酰辅酶A、巴豆酰辅酶A、3-羟基 丁酰辅酶A、乙酰乙酰辅酶A、乙酰辅酶A、丙酮酸、磷酸烯醇丙酮酸、2-磷酸甘油酸、1，3- 二 磷酸甘油酸、甘油醛-3-磷酸、二羟基丙酮磷酸、果糖-1，6- 二磷酸、果糖-6-磷酸、6-磷酸 葡萄糖、葡萄糖、葡萄糖-ι-磷酸和其组合。
全文摘要
本发明提供一种基于设计者转基因植物、设计者藻类、设计者蓝绿藻(蓝藻(cyanobacteria)和原绿球藻(oxychlorobacteria))或设计者植物细胞的生物安全防护型光生物丁醇生产技术。产生设计者光合生物体以便驯化内源光生物调控机制，且从光合过程获得的还原力(NADPH)和能量(ATP)是用于从二氧化碳(CO2)和水(H2O)直接合成丁醇(CH3CH2CH2CH2OH)。本发明的丁醇生产方法通过避免生物质技术的瓶颈问题完全消除了顽抗性木质纤维素的问题。预期本发明的光生物丁醇生产技术具有比当前技术高得多的太阳能至丁醇能源转换效率，并且也可帮助保护地球环境，避免大气中CO2的危险积聚。
文档编号C10L1/30GK102124118SQ200980114542
公开日2011年7月13日 申请日期2009年2月21日 优先权日2008年2月23日
发明者詹姆斯·伟甫·郦 申请人:詹姆斯·伟甫·郦