微生物介导的液态燃料的制作方法

本工作的一部分由联邦基金支持，合同编号为DOE/NETL奖金：DE-Fe0001259。

背景技术：

技术领域

本发明涉及生产液态燃料，具体地涉及煤向液态的原位(in-situ)或异位(ex-situ)转化。

背景技术

煤还可以通过几种不同的过程转化为液态体燃料，例如汽油或柴油。在一种发展的商业过程中，通过利用Fischer-Tropsch(FT)过程，煤首先转化为气态，接着转化为液态。在FT过程—一种间接途径中，首先使煤气化，以生成合成气(CO和H₂气体的纯化混合物)。接着，利用FT催化剂将合成气转化为轻烃例如乙烷，其进一步加工为可精炼液态燃料。除了生产燃料之外，合成气还可以转化为甲醇，其可用作燃料或燃料添加剂。

可替代地，煤可以通过加氢过程直接转化为液态燃料。例如，Bergius过程，其中通过将煤与氢气混合并加热系统从而使煤液化。已经研发出几种其他的直接液化过程，例如溶剂精炼煤(Solvent Refined Coal,SRC)过程，其已经在数个试验性工厂设备中使用。此外，经干燥、粉碎并且与大约1重量％钼催化剂混合的煤可以利用高温和高压氢化，产生合成气。然而，合成气必须在单独的气化器中产生。

然而，这些煤转化为液态燃料的过程涉及从地下开采煤。如所大量记载的，煤的开采是危险的过程，许多煤矿在开采完所有可利用产物之前被迫关闭。而且，安全运行的那些煤矿遗留大量支撑顶板的煤和矿床壁中的煤残留。这些煤源表示被开采操作所遗弃的大量能量。而且，这些未被开采的资源可以出于运输目的而转化为液态燃料。因此，工作中需要移除来自开采操作的被遗弃、低质量或残留的煤，以将煤用于生产液态燃料。

发明概述

本文公开了一种生产液态烃产物的方法，所述方法包括使烃源分裂，对已分裂的烃源进行预处理；使已分裂的烃源溶解，以形成包含烃源反应物分子的浆液；混合生化液剂至浆液中，其中所述生化液剂包含至少一种转化酶，其构造为有助于所述烃源反应物分子的键选择性光分解，以通过酶辅助的键选择性光分解形成液态烃，其中所述转化酶包含反应性位点，其构造为限制所述反应物分子以使光分解有利地靶向所述反应物分子的预选内部键；从浆液中分离液态烃，其中浆液中残留杂质；以及富集液态烃，以形成液态烃产物。

在一个实施方案中，使烃源分裂包括粉碎烃源。在一个实施方案中，粉碎包括研磨。在一个实施方案中，粉碎包括高压蒸汽处理。在一个实施方案中，对已分裂的烃源进行预处理包括化学预处理、热预处理、烃源的氧化或其组合。

在一个实施方案中，使已分裂的烃源溶解包括用至少一种酶处理已分裂的烃源。在一个实施方案中，混合生化液剂包括混合至少一种额外的酶。在一个实施方案中，混合至少一种额外的酶进一步包括混合酶以用于将烃源转化为较低分子量的烃。

在一个实施方案中，分离液态烃包括从液态烃中沉降浆液的过程。在一个实施方案中，分离液态烃包括从液态烃中沉降杂质。在一个实施方案中，富集液态烃包括使液态烃与至少一种酶混合。

在一个实施方案中，生化液剂包括经修饰的酶。在一个实施方案中，经修饰的酶包括经基因修饰的酶。在一个实施方案中，经修饰的酶包括经化学修饰的酶。

在一个实施方案中，所述方法在煤矿中原位进行或者在开采出的煤上异位进行。在一个实施方案中，富集液态烃包括蒸馏前提高液态烃产物的质量。在一个实施方案中，液态烃产物包含选自由汽油、柴油、煤油及其蒸馏物组成的组中的至少一种。在一个实施方案中，烃源包含选自由煤、无烟煤、烟煤、褐煤、亚烟煤、低阶煤、焦炭、沥青砂和油页岩以下组成的组中的至少一种。

本文还公开了一种用于将煤原位转化为液态烃的方法，其包括：定位地下煤层；钻出至少一个孔，所述孔与地下煤层接触，并且具有使液体在其中循环的工具；利用蒸汽对地下煤层加压；使反应物循环穿过地下煤层，其中所述反应物包含至少一种酶，以形成浆液；弃去一部分浆液；对浆液进行加工，以产生液态烃；从浆液中分离液态烃；以及使浆液返回煤层以用于进一步加工。

在一个实施方案中，所述至少一个孔在液体中与反应物蒸汽反应。在一个实施方案中，所述至少一个孔在液体中与浆液加工蒸汽反应。

在一个实施方案中，使反应物循环以形成浆液进一步包括使煤溶解以形成浆液；使煤发生转化，以形成液态烃；从液态烃中分离杂质化合物，其中所述杂质化合物包含污染物；从液态烃中沉降浆液，其中所述液态烃适用作液态燃料；以及将液态烃加工成液态燃料。

在一个实施方案中，使煤溶解的步骤包括用至少一种酶处理煤。在一个实施方案中，使煤发生转化的步骤包括用至少一种酶处理酶。在一个实施方案中，分离杂质化合物的步骤包括用至少一种酶处理液态烃。

进一步公开了一种利用酶生产液态燃料的方法，其包括选择微生物，所述微生物能够产生酶；对微生物进行基因修饰，以增加酶产量；对酶进行结构修饰，以改变酶活性，形成经修饰的酶；收集经修饰的酶，以形成包含至少一种经修饰的酶的生化液剂；以及使烃源暴露于生化液剂，以形成液态燃料前体。

在一个实施方案中，选择微生物的步骤包括选择选自由以下组成的组中的至少一种微生物：石下生物(hypoliths)、岩内生物(endoliths)、隐藏生物(cryptoliths)、嗜酸生物(acidophiles)、嗜碱生物(alkaliphiles)、嗜热生物(thermophiles)、无机自养生物(ithoautotrophs)、低温生物(halophiles)、嗜压生物(piezophiles)及其组合。在一个实施方案中，对微生物进行修饰包括插入核酸载体。在一个实施方案中，对微生物进行基因修饰包括定点突变。在一个实施方案中，对酶进行修饰包括从结构上改变酶。在一个实施方案中，使烃源暴露于生化液剂进一步包括发射辐射的定向分解。

在一个实施方案中，一种用于生产液态烃产物的方法，其包括使烃源分裂，对已分裂的烃源进行化学处理；使已分裂的烃源溶解，混合生化液剂，其中所述生化液剂包含至少一种酶以形成液态烃，分离液态烃，以及富集液态烃，以形成液态烃产物。

在另一个实施方案中，一种用于将煤原位转化为液态烃的方法，其包括定位地下煤层；钻出至少一个孔，所述孔与地下煤层接触；利用蒸汽对地下煤层加压；使反应物循环穿过地下煤层，其中所述反应物包含至少一种酶，以形成浆液；弃去一部分浆液；对浆液进行加工，其中从浆液中分离液态烃；以及使浆液返回煤层以用于进一步加工。

在又一个实施方案中，一种利用酶生产液态燃料的方法，其包括选择微生物，所述微生物能够产生酶；对微生物进行基因修饰，以增加酶产量；对酶进行结构修饰，以改变酶活性，形成经修饰的酶；收集经修饰的酶，以形成包含至少一种经修饰的酶的生化液剂；以及使烃源暴露于生化液剂，以形成液态燃料前体。

上述内容广泛地概括了本发明的特性和技术优势，以更好地理解下面的发明详述。通过阅读以下优选实施方案的详细描述以及通过参考附图，上述多个特征以及其他特性对于本领域技术人员来说将是显而易见的。

附图简述

为了详细描述本发明的优选实施方案，现在将参考附图，其中：

图1阐述了用于将煤转化为液态的总体流程示意图。

图2阐述了用于将煤转化为液态的异位过程的一个实施方案。

图3阐述了用于将煤转化为液态的原位过程的一个实施方案。

图4阐述了催化性抗体的代表图。

图5阐述了活化的催化性抗体的代表图。

图6阐述了野生型酶的代表图。

图7阐述了活化的酶复合物的代表图。

图8阐述了活化的酶复合物定向进化的代表图。

图9阐述了活化的酶复合物定点突变的代表图。

图10阐述了活化的酶复合物定向变构突变的代表图。

图11阐述了活化的酶复合物的活性位点重新设计的代表图。

图12阐述了活化的酶复合物的活性位点合理设计的代表图。

图13阐述了辅助因子定向的活化酶复合物活性位点重新设计的代表图。

图14阐述了光分解图。

图15阐述了激光介导的光分解的示意图。

图16阐述了在减小尺寸的粉碎机Fluid Energy Model 0101JET-O-MIZE 630上进行的机械研磨运行的结果。

图17阐述了得自完成的CFS Mill的结果。

图18A-18C是在水中操作的显微照片；18A放大倍数125X；18B放大倍数43OX；18C放大倍数1000X。

图19A示出了在酶增溶和转化中来自3％H202预处理的煤的结果。

图19B示出了在化学增溶和转化中来自3％H202预处理的煤的结果。

图19C示出了在含有P.chrysosporium的PD生长培养基中来自3％H202预处理的煤的结果。

图19D示出了在含有P.chrysosporium的0.1X SD生长培养基中来自3％H202预处理的煤的结果。

图19E示出了在酶增溶和转化中来自15％H202预处理的煤的结果。

图19F示出了在化学增溶和转化中来自15％H202预处理的煤的结果。

图19G示出了在含有P.chrysosporium的PD生长培养基中来自15％H202预处理的煤的结果。

图19H示出了在含有P.chrysosporium的0.1X SD生长培养基中来自15％H202预处理的煤的结果。

图19I示出了在酶增溶和转化中来自30％H202预处理的煤的结果。

图19J示出了在化学增溶和转化中来自30％H202预处理的煤的结果。

图19K示出了在含有P.chrysosporium的PD生长培养基中来自30％H202预处理的煤的结果。

图19L示出了在含有P.chrysosporium的0.1X SD生长培养基中来自30％H202预处理的煤的结果。

图19M示出了在酶增溶和转化中来自加热30％H202预处理的煤的结果。

图20A示出了在含有P.chrysosporium的PD生长培养基中来自加热煤的结果。

图20B示出了在含有P.chrysosporium的0.1X SD生长培养基中来自加热煤的结果。

图21A示出了在酶增溶和转化中来自矿井水预处理的煤的结果。

图21B示出了在化学增溶和转化中来自矿井水预处理的煤的结果。

图21C示出了在含有P.chrysosporium的PD生长培养基中来自矿井水预处理的煤的结果。

图21D示出了在含有P.chrysosporium的0.1X SD生长培养基中来自矿井水预处理的煤的结果。

图22A示出了在酶增溶和转化中来自HN03(pH 1)预处理的煤的结果。

图22B示出了含有P.chrysosporium的PD生长培养基中来自FTN03(pH 1)预处理的煤的结果。

图22C示出了在含有P.chrysosporium的0.1X SD生长培养基中来自HN03(pH 1)预处理的煤的结果。

图23(现有技术)是示出苯酚的微生物降解的简化图。

图24(现有技术)示出苯酚降解的UV图谱。

优选实施方案详述

公开了将煤转化为液态燃料的过程。煤包括从煤矿、煤层或煤窑发现或者开采的任何煤。煤可以进一步包括无烟煤或者来自烟煤的焦炭。在某些情况中，煤包括褐煤、亚烟煤、其他低阶煤和/或其他烃源，例如但不限于沥青砂。可替代地，煤包括但不限于风化的、老化的、过滤的或者降解的煤。

在某些情况中，通过两个阶段的过程将煤转化为液态燃料。所述过程包括酶催化的反应。第一阶段，阶段I，包括利用酶将煤预处理和转化成液态。在实施方案中，阶段I将煤给料转化为液态烃。给料包括煤矿中剩余的煤或者原位给料。可替代地，给料包括远离煤矿的煤或者异位给料。在某些情况下，烃源可以包括任何资源，例如其他工业中并不优选的沥青砂。

第二阶段，阶段II，包括液态烃产物的富集。液态烃产物的富集或改良进一步包括酶催化的反应。此外，反应是酶介导的加工步骤。阶段II进一步包括液态产物性质的改良，以用于燃料中。阶段II酶催化的过程改变燃料的性能。在示例性情况中，阶段II处理可以改变柴油的十六烷值或者汽油的辛烷值。

与现有的处理技术相比，酶促介导的两个阶段的过程需要较少的能量以用于进行处理。额外地，由于酶在微生物生产者的自我平衡条件下表现最佳，因而反应条件更加温和。进一步地，可以使用额外的酶或微生物以隔离液态燃料中需要控制的杂质。例如，终产物蒸馏前可以从液态燃料中降低或去除硫和氮。污染杂质的早期去除使得可以调节过程以满足现有和将来排放规章。此外，酶介导的两个阶段的过程适用于先前无法获得的给料，例如煤矿中过于危险而无法利用后退式开采去除的煤柱。

微生物。在所公开的过程中，微生物产生的酶介导转化。在实施方案中，微生物包括细菌、藻类或者真菌。在某些情况中，微生物包括异养生物，其分泌用于催化消化烃的酶。微生物利用烃作为生命周期的碳源。微生物获自不限于油页岩、油砂、煤沥青坑或者煤洞。例如，微生物可以来源于拉布雷亚沥青坑中发现的那些。进一步地，微生物可以收集自不限于热温泉、泥火山、硫釜、喷气孔、间歇泉、泥喷泉等。微生物可以进一步包括嗜极生物，例如石下生物、岩内生物、隐藏生物、嗜酸生物、嗜碱生物、嗜热生物、无机自养生物、低温生物或嗜压生物。在示例性实施方案中，微生物包括古细菌。可替代地，适合的微生物包括以下属中发现的那些：卧孔属(Poria)、多孔属(Polyporus)、硫化细菌(Thiobacillus)、念珠菌(Candida)、链霉菌(Streptomyces)、绿脓杆菌(Psuedomonas)、青霉属(Penicillium)或者木霉属(Trichoderma)。如本领域技术人员所理解，可以鉴定适合应用于所公开系统的替代性微生物，虽未明确命名，其结构和功能没有显著差别。进一步地，可以想象，预期这些微生物可以作为改变、改进或者修改目前公开的工具。

在某些情况中，微生物暴露于先前开采的煤、煤渣或者较不利于产生能量的煤渣，以收获酶。在某些情况中，微生物天然地产生酶。如本领域技术人员所理解，持续暴露于底物例如煤中将导致用于产生液态烃的酶的表达和产量增加。

酶。所公开过程中使用的酶获自以高产率产生这些酶的微生物。优选地，酶为胞外分泌和/或酶被释放到环境中。可替代地，细胞被裂解，酶被捕获以用于煤加工。在实施方案中，用于煤加工之前从微生物中分离酶。为了减少暴露、释放或者环境污染，微生物与加工过程是分离的。微生物不直接参与液态燃料生产过程的任何实施方案中。而且，供应足够的用于培养这些微生物的设备，以从天然环境中分离宿主微生物。

可替代地，微生物经历定点突变，以上调、过表达和/或增加酶产量。定点突变包括特定核酸碱基对序列处DNA分子的突变。定点突变可以发生于染色体DNA或者来自载体的染色体外DNA。额外地，定点突变可以包括基因缺失/删除、引物介导的突变、盒突变、附加突变、错配突变、基因转换、拓扑操作、特定重组或者PCR介导的突变。进一步地，基因的突变和过表达可以由任意致突变因素诱导。例如，可以利用不限于电离辐射、UV暴露、脱氨基作用、嵌入、烷化、同源物插入、转座子复制和其他分子生物学技术。在某些情况中，暴露于致突变因素诱导微生物生成载体，例如质粒。进一步地，突变可以诱导载体DNA掺入染色体DNA中。出于本文公开的目的，可以实施致突变技术，以诱导产生额外的酶。进一步地，突变可以用于增加酶活性。

在某些情况中，酶在产生后可以进行化学修饰。可以在从微生物中收获之前或之后对酶进行修饰。可以实施本领域技术人员已知的任何方法，包括但不限于加入功能性基团、加入其他肽、改变化学性质和/或结构变化。例如，预期包括但不限于酰化作用、糖基化作用、泛素化作用、脱氨基作用和/或剪切的过程可以应用于本文公开中。

所产生且经修饰的酶应用于生化液剂中。生化液剂包括蛋白质、酶、无机催化剂以及有机和无机化合物的液态混合物。生化液剂进一步包括辅助、改进或者改变酶肉汤或生化液剂的功能的盐、电解质、金属和/或其他分子。生化液剂是不限于每个上述基团的至少一种的混合物。生化肉汤可以悬浮于任何已知的溶剂中，优选有机溶剂。在示例性实施方案中，水是溶剂。

过程。如图1中所阐述，过程包括使煤流过一系列单独的处理步骤。在阶段I中，过程包括至少一个预处理步骤。接着煤经历溶解，其可以包括于预处理步骤中。经预处理的溶解的煤物质被转化为液态烃。同时或者依次地，所述物质经历硫和氮转化。从产物中去除硫和氮提高加工后例如分离后燃料的性能。分离不同的燃料，以对水相反应物进行回收，和/或对废水进行处理以返回系统中。在阶段II中，对转化步骤中的烃相产物进一步精炼。产物的精炼包括燃料精炼、富集和蒸馏，以提高产物质量。

预处理。预处理步骤包括煤的物理和化学降解，以产生经降解的酶。为了增加所公开过程的效率，增加物质的表面积是有利的。可以通过减小颗粒体积(例如在粉碎过程中)从而增加煤的表面积。例如，表层煤、开采的煤、煤残渣或者剩余的煤被机械破坏或者碾压成精细颗粒。剩余的煤可以包括但不限于源自弃之不用的任何工业的煤。颗粒可以包括但不限于卵石、粉尘、粉末等。

在某些情况中，通过高压蒸汽对酶进行原位处理，例如在地下煤层中。地下矿井、管道和/或其他管线将蒸汽输送至煤矿中。可以对蒸汽加压、过热或者其组合，以增加其透入煤层中。预处理前，使用蒸汽使地下煤床断裂。进一步地，高压蒸汽将煤从周围的岩层机械地分离出来。

额外地，对煤进行化学处理。煤的化学处理使煤的反应性增加。额外地，化学处理设计为从煤产物中去除、消化或消除非煤物质。进一步地，化学处理可以进一步通过诱导形成孔、腔、坑从而增加煤的表面积。化学处理可以进一步包括氧化剂。在某些实施方案中，利用温和的离子性、酸性、碱性或者自由基溶液使煤氧化。在一个实施方案中，溶液包括温和的酸性溶性。在一个示例性实施方案中，化学处理包括过氧化氢。过氧化氢是大约10％至大约50％的浓度，可替代地是大约20％至大约40％，优选大约30％的过氧化氢。如上面所讨论，溶液与蒸汽或者水注入煤矿中，因此优选溶液是水性的。在某些情况中，可以实施无机化学处理。

溶解。进一步地，预处理步骤包括经降解的煤的溶解。一经机械分解和化学氧化，将第一组酶引入，以破坏煤中的交联键。在某些情况中，第一种酶可以来源于例如但不限于皮氏类芽孢杆菌属、多孔菌属、卧孔菌种和多孔菌种中发现的酶。第一种酶使得煤颗粒溶解于液态培养基中。在实施方案中，液态培养基与递送酶时使用的相同。在某些情况中，培养基是上面所述的生化液剂。进一步地，液态培养基包括水性培养基。已溶解的煤颗粒重悬于液态培养基，形成煤浆液，可替代地但不限于形成煤悬液、煤混合物、煤胶体或者煤溶液。煤浆液促进生化液剂中的酶对煤颗粒的可利用性。使颗粒悬浮于培养基中可以提高随后酶介导步骤中的反应活力学。煤浆液进一步促进加工步骤之间的煤传送。

转化。溶解后，通过转化步骤对酶进行加工。在某些情况中，煤浆液中已溶解的酶转化为较小或较低级的烃。低级烃可以包括任何烃，例如包含大约24个碳至大约2个碳的烃。第二种酶或者第二种酶溶液保持于生化肉汤中。第二种酶溶液可以来源于例如但不限于由硫化细菌属、念珠菌属、链霉属、绿脓杆菌属、青霉属或者木霉属微生物产生的酶。第二种酶可以在转化过程中引入煤浆液中。在某些情况中，使煤浆液暴露于第二种酶包括将煤转化为低分子量烃级分。可替代地，第二种酶是转化酶。转化酶是经选择、改造或者修饰以将煤中存在的大分子烃催化转化为较低分子量烃的那些。在转化步骤中，烃经历饱和以及硫、氮和其他杂质的转化。转化步骤形成反应浆液或者具有生化液剂的烃浆液。

酶促转化反应成功地将天然的、原始的或者已溶解的煤颗粒降解为较小分子烃，保留于反应浆液中。酶促转化反应将高分子量的煤分子组分转化为较小分子量的烃液体和烃气体混合物。

在转化过程中，某些废物、杂质和潜在污染物从过程中去除。在某些情况中，这些产物的去除由添加至反应浆液中的第三种酶介导。第三种酶或者第三种酶溶液与催化转化的产物反应，以从烃复合物中释放出硫，并形成可溶解于反应浆液中的多种含硫简单化合物。可以从反应浆液中过滤出可溶性含硫化合物，并加工成其他产物。

额外地，为了去除其他废物、杂质和潜在污染物，可以将第四种酶添加至反应浆液中。在某些情况中，可以使用任意数量的废物去除酶，以特定地消除、隔离或者剪切不希望有的化合物。在某些实施方案中，第四种酶溶液与催化转化的产物反应，以释放出氮并形成可溶解于反应浆液中的多种含氮简单化合物。

被处理的废物可以包括溶解于反应浆液中的气体。气体可以包括但不限于氮气、氮的氧化物、硫、硫的氧化物、一氧化碳、二氧化碳和其他气体。某些废物产物用于进一步的过程中，例如合成气的产生或者液态燃料的催化合成。进一步地，酶促催化的反应将煤中存在的硫和氮的复合化合物转化为较简单形式，后者在产物分离过程中去除。

如本领域技术人员所理解，对反应属性例如温度、压力、pH和停留时间进行分别监控，以使产量最大化。在某些情况中，控制反应属性以获得产物蒸汽中烃分子量的分布。进一步地，由于反应浆液中包含生化液剂，改变条件可以使转化最佳。

如上文所讨论，生化液剂包含任意数量的酶。如本领域技术人员所理解，每种酶具有优选条件以进行有效催化。就其本身而言，可以预见使反应条件例如温度和压力循环使得任何过程部分的效率或者任何酶部分的作用最大化。在其他实施方案中，转化步骤包括分离反应容器以进行催化断裂以及氮和硫转化反应。这种排布允许在每个容器中使用不同的运行条件(例如温度和个体反应器回收率)，以使酶催化的反应最佳。

产物分离。转化后，将烃混合物送入沉降池中。在实施方案中，沉降池可以是构造为从水性煤浆液中分离烃液体的任何容器。在某些情况中，沉降池可以包括动态沉降器，其中引入恒定低体积或者低速率的反应浆液流，以分离水相和烃相。可替代地，沉降池包括静态沉降器，其中水相煤浆液利用重力从较轻的烃中沉降。在某些实施方案中，剩余的硫和氮化合物分布于水相中。通过从较致密的水层中抽出较轻的烃层，从而分离烃相。可替代地，导管从池底部排出水相。

产物富集。烃层被送入阶段II，所述烃层常常含有汽油、煤油、柴油和燃料油，在阶段II中，通过将较低价值的级分、轻油、柴油、燃料油、蜡等转化为较高价值的级分例如汽油或者煤油，使烃层进一步升级。在实施方案中，产物富集可以包括酶促转化、分子光分解、转化和酶辅助的分子光分解转化。在某些情况中，产物富集包括被引入来自分离步骤的煤产物中的第五种酶或者第五种酶溶液。富集后，通过常规蒸馏将烃混合物分离成为终产物。

异位加工。图2阐述了煤给料的持续异位加工的实施方案，或者异位系统10。在异位系统10中，预处理、转化和产物加工设计为在流体窜槽中。在异位系统10中，首先利用机械工具12将煤研磨成小颗粒.如先前所描述，机械工具12产生颗粒产物流14。将颗粒产物流引入包含例如弱酸溶液的化学处理系统16中。在某些情况中，机械工具12和化学处理生活经验统16可以包括单个容器或者单个加工设备。煤和酸溶液形成煤浆液，其中煤经历预氧化。预氧化的程度由浆液在化学处理系统16中的停留时间确定。进一步地，在组合的实施方案中，至少部分地通过由混合器18提供的搅拌度而控制煤在煤浆液中的氧化。

接着将浆液产物流20泵出给料池并泵入反应阶段22。反应阶段22包括溶解反应。在某些情况中，将包含选择用于溶解煤的酶的第一酶流24注入浆液产物流20中。可替代地，第一酶流24被直接注入反应阶段22中。不希望受理论限制，第一酶流24在引入反应阶段22之前被引入浆液流22中是有利的。

反应阶段22包含介导酶促转化反应的酶。将第二酶流26流入反应阶段22中。酶催化发生反应，使大分子烃转化并产生产物流30.进一步地，将用于转化硫化合物的第三酶流27和用于转化氮化合物的第四酶流28添加至反应阶段22。第三酶流27和第四酶流28将煤浆液20中存在的各种杂质转化为较简单的水溶性形式。反应阶段流出物23在回收流25和产物流30之间被持续分流，所述回收流25被泵回至反应阶段22中。

在其他实施方案中，反应阶段22包括分离反应容器以进行溶解、催化转化以及氮和硫转化反应。多个反应器的排布允许在每个容器中使用不同的运行条件(例如温度和个体反应器回收率)，以使反应的不同组件最佳。

将产物流30泵入分离阶段32。分离阶段32可以包括用于排出分离过程中释放的气体和挥发性化合物的排气口33。分离阶段32包括水相36沉降在烃相34之下的步骤。分离阶段32包括沉降器或者沉降容器。可替代地，分离阶段是过滤器或者其他仪器，以从产物流30中分离水相和烃相。分离阶段32包括连续流、油分离容器。从分离阶段32中抽出水相36，并且经由回收流39送至反应阶段22。回收流包括废水处理系统。处理系统包括构造为处理酸性污水的任何系统，其构造以去除残留物以及氮和硫副产物。接着经处理的水循环返回反应部分。

在某些情况中，可以从沉降器顶部抽出烃相34作为烃流38，以用于富集和/或蒸馏，以生产运输燃料。烃流38被泵至产物富集阶段。

原位加工。另一个实施方案涉及煤的持续原位加工，或者阐述于图3中的原位系统100。在本实施方案中，原位系统100包括废弃的、倒塌的、不可利用的或除此之外难以开采的煤沉积物，或者地下煤层101。在实施方案中，向煤层101中钻出至少一个孔102。孔102通常构造为用于在地下煤层101和加工中心120之间运输液体和浆液。进一步地，孔102可以构造为用于使加工流体持续循环入和循环出地下煤层101。可以预见的是，多个孔102将提高不限于原位系统101的产物产率、加工时间和总体经济状况。

原位系统100的过程起始于将蒸汽注入孔102的管道中，以诱导地下煤层101的断裂。该断裂步骤105被构造以使煤层分解为颗粒、煤碎渣等。在某些情况中，根据地下煤开采工业的常规实践利用高压蒸汽。

断裂步骤105完成后，撤回高压蒸汽。氧化步骤106包括注入酸溶液以使已断裂的酶预氧化。在实施方案中，持续回收酸溶液以形成循环的过程流150，以使酸在煤层一侧泵入孔102A，在煤层另一侧泵出孔102B。为了完成该循环，将酸溶液运回并泵入第一孔102A。可以重复循环过程流150，直至达到预期的预氧化水平。

如上所述，溶解步骤107可以包括将第一种酶溶液引入地下煤层101。将第一种酶溶液引入循环过程流150中，以使已暴露的煤溶解于循环过程溶液中。

一旦达到足够的可溶性煤的水平，为了在循环过程流150中产生煤浆液，依次或者同时加入额外的酶。在某些情况中，将第二种酶106、第三种酶107和第四种酶108溶液添加至循环流150中。如本文中上面所述，第二种酶流106选择为使烃催化性裂解。第三种酶107和第四种酶108选择为去除来自循环过程流150的含硫和含氮化合物和/或废产物。在实施方案中，可以将额外的酶流注入循环过程流150中，以使煤的溶解和转化最佳。

接着分流循环过程流150的一部分作为粗产物流160，并送至加工阶段120。加工阶段120与上述异位过程的实施方案中使用的相似。分离容器162包括水相163沉降在烃相164之下的步骤。分离容器162包括沉降器或者沉降容器。从分离容器162中抽出水相163，并且经由回收流170送至循环过程流150。回收流170包括废水处理系统。处理系统包括构造为处理酸性污水的任何系统，其构造以去除残留物以及氮和硫副产物。在某些情况中，可以从沉降器顶部抽出烃相164作为烃流168，以用于富集和/或蒸馏，以生产运输燃料。烃流38被泵至产物富集阶段。

突变。用于生产适合于在阶段II中使用、用于燃料升级的酶的方法包括利用催化性抗体。如图4中所阐述，对催化过程所需的生物酶进行鉴定。在某些情况中，生物酶来源于上文中讨论的微生物。在进一步的实施方案中，酶包括仅具有天然性质的(Mother Nature Only)酶。MNO酶是微生物内未经修饰的基因序列的表型表达。可替代地，MNO酶是野生型酶。在进一步的情况中，如图5中所阐述，MNO酶选自包含活化的酶的那些。在某些情况中，通过抗体试验筛选活化的酶。可替代地，任何适宜的筛选方法可以包括用于鉴定野生型MNO酶的任何适宜的方案，如图6和7中进一步所阐述。

如图8中所阐述，所选择的MNO由定向进化形成。对所选择的MNO进行整个酶的定点和随机突变，而不仅局限于活性位点。在某些情况中，还在变构位点处以及远离活性和/或变构位点处使酶突变。多位点突变包括同时促进和限制潜在产物的方法，如图9和10中所阐述。在某些情况中，如图11中所示，突变包括活性位点化学性重新设计。优选地，结果包括合理设计的酶或者酶促结构。

结构被合成，经计算机设计，其具有与酶骨架连接的基序。由于酶是非常大的分子，具有数百个氨基酸、数十个千道尔顿(Kds)以及数千立方埃，其可被认为是空间上无效的。在某些情况中，大分子酶包括小的活性位点。相比而言，酶促活性位点非常小，其他折叠的氨基酸用作骨架以形成活性位点容纳区。相对来讲，如图12中所阐述，这些“其他”氨基酸可以距离酶的活性位点非常远。额外地，酶可以包括如图13中所示重新设计的辅助因子连接位点。为了重新设计辅助因子连接位点，重复实施上文所讨论(例如第21段)的定点突变。

如图14中的图解，可以使shaped IR毫微微秒激光脉冲冲击酶复合物，以诱导反应物的分解。进一步地，可以预见的是，本领域技术人员已知的任何特定的冲击辐射均不限于能够产生相同的反应物分解。用于反应物的定向分解/向产物的转化的激光脉冲可以帮助形成反应产物。如本领域技术人员所理解，可以形成多次分解反应物产物。在某些情况中，多次分解产物对于形成多种反应物片段是有利的。可替代的，如图15中所示，shaped IR毫微微秒激光脉冲可以与用于辅助在酶促活性位点、变构位点和远离结合或变构位点的位点处选择性分解反应物的上述酶技术结合使用。如本领域技术人员所理解，反应物、烃、酶反应性位点分子的键合可以包括但不限于共价键、非共价键、氢键、离子键、范德华键或者其他的键、相互作用、偶联或者联结。进一步地，酶反应性位点构造为限制反应物分子及其移动范围。进一步地，反应性位点限制内部自由度，以有利地使毫微微秒激光脉冲靶向预选择的内部键。在某些情况中，酶反应性位点阻碍内部自由度，使得内部振动重排(internal vibrational rearrangement,IVR)受到抑制，并且激光能量聚焦于预选择的内部键。

煤向液态烃的转化。在一个实施方案中，煤向液态烃的转化过程包括机械预处理和/或化学预处理、溶解和转化(从煤向液态烃)。机械预处理包括锤式粉碎机研磨或喷射式粉碎机研磨。在一些情况中，喷射式粉碎机研磨能够将煤研磨成尺寸为5μπι或更小的颗粒。例如，可以使用Fluid Energy Model 0101JET-O-MIZER-630使尺寸减小。

在一个实施方案中，对多种经预处理的煤进行溶解和转化。在一些情况中，通过酶促过程对煤进行预处理，例如利用胞外漆酶和锰过氧化物酶(MnP)。在一些情况中，通过化学过程对煤进行预处理，例如利用酒石酸盐和锰过氧化物酶。在一些情况中，通过酶促过程对煤进行预处理，例如利用活的微生物黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)。

实施例

概要。利用三种不同的方法使酶分解：(1)酶促过程—利用胞外漆酶和锰过氧化物酶(MnP)；(2)化学过程—利用酒石酸胺和锰过氧化物酶；和(3)酶促过程—利用活的微生物黄孢原毛平革菌。利用光谱分析确定这些方法中的每种分解烟煤的效率。对结果和其他考虑因素例如成本和环境影响进行分析之后，确定与利用螯合剂的化学方法相比，酶促方法对于分解煤更加有效。对漆酶/MnP实验和黄孢原毛平革菌实验的结果进行了展示和比较。

酶促方法的光谱显示在240nm至300nm区域中的吸收峰。这些峰与当煤结构破坏时形成的芳香族中间物相对应。接着吸收值随时间下降，对应于芳香族中间物随着其经历环剪切而被消耗。结果显示，当利用胞外酶时，该过程在1小时内发生，而当使用活的微生物时花费数天时间。此外，活的微生物需要特定的培养条件以及对杂质和杀真菌剂的控制，以有效地产生降解煤的胞外酶。因此，当与两种酶促方法相比时，结果显示利用胞外木质素降解酶例如漆酶和锰过氧化物酶的过程似乎是更加有效的分解烟煤的方法。

机械预处理。机械预处理过程涉及在化学预处理和实验之前将煤颗粒研磨成较小尺寸。该过程为煤的化学预处理提供增加的表面积，并且为随后煤向液态烃的酶促转化提供较大的表面积。

利用来自Rosebud Mining Company,Kittanning,PA的Lower Kittanning煤层的烟煤，高容量-No.5。

在Q1中，使用三种不同的煤研磨：尺寸为1mm、400μm和40μm的颗粒。利用锤式粉碎机研磨进行所有三种这些研磨。1mm的颗粒来自Rosebud Coal,Kittanning,PA。400μm和40μm的颗粒来自。Pulva Corporation,Valencia,PA(尽管尺寸为微米级的研磨的起始材料也是1mm Rosebud煤)。Q2中的机械预处理过程由锤式粉碎机研磨改变为喷射式粉碎机研磨。这由Fluid Energy,Inc.,Telford,PA进行。所使用的仪器是JET-O-MIZER Size Reduction System。在密封条件下进行实际研磨，无任何氧气或者空气。这是出于安全原因，是为了避免任何自发性点火或者爆炸。在Q3中利用Fluid Energy减小式粉碎机(例如减小尺寸的粉碎机Fluid Energy Model 0101JET-O-MIZE 630)进行进一步的机械研磨工作。减小尺寸的粉碎机Fluid Energy Model 0101JET-O-MIZE 630接收投入尺寸为3mm的煤颗粒。该颗粒尺寸可以容易地从煤生产者获得。在大约1,000kWh/t的特定能量消耗时，利用蒸汽作为移动气体获得了小于5微米的平均颗粒尺寸。

结果和讨论。图16显示了在减小尺寸的粉碎机Fluid Energy Model0101JET-O-MIZE 630上进行的机械研磨运行的结果。如该图中所见，25％的颗粒小于1.7微米，50％小于4微米。Sauter平均直径D(3,2)仅为2.128微米，其特定的表面积超过每cm³ 28000cm²。这些小的颗粒尺寸导致表面积增加，这意味着在溶解和烃转化过程中开始暴露于酶的煤功能性基团的数量增加(参见下面表1)。

Model 0101JET-O-MIZER CFS Test Mill缩写为“CFS Mill”，其安装有研磨器的蒸汽界面。CFS Mill的尺寸大约是7×6×3英尺。右侧控制面板下面是2个蒸汽加热器。煤漏斗使煤进料至研磨部(漏斗左侧为夹套立方体)。使经研磨的煤产物进料至夹套研磨器后面的容器中。

表1

图17显示了由完成的CFS Mill获得的最终结果。煤产物统计学数据取自液态产物。这些结果来自MICROTRAC Standard Range Analyzer(SRA150)。如图17中所示，在每小时27磅的进料速率下在CFS Mill上进行研磨。移动蒸汽是450OF和110PSIG。煤颗粒范围大约是从0.5微米至25微米。平均数值是5.769微米。

除统计学结果之外，在显微镜下对来自CFS Mill的煤进行检验。在下列显微图片中，煤研磨物和颗粒的一些性质是明显的。

图18A是水中的产物的显微图片。放大倍数是125×。带有标线的显微镜载玻片被分成毫米的十分之一(0.1mm)，如0至0.5分隔区中所见。0.1mm分隔区被进一步在0.0至0.1mm的亚分隔区域中再次亚分为十分之一(0.01mm)。0.01mm分隔区看起来像“吉他弦”。“吉他弦”中间的大颗粒直径大约为30微米。这是可见区中的最大颗粒。如后面2张显微图片中所见，一些颗粒远远小于30微米。

图18B的放大倍数是430X。吉他弦是10-5m的分隔区。如弦之间和中心区域周围可见，存在弦分隔区的0.1或者大约1微米的颗粒。图18C是与图18A-18B相同的中心区的显微图片。放大倍数是1000X。在该放大倍数下，请注意橙色的圆形颗粒。其直径大约为10微米。天然地存在该尺寸颗粒周围的可见光衍射。然而，注意似乎颗粒中心存在透明。这种现象在该载玻片上的其他颗粒以及其他未显示的显微图片中也是显然的。

在本实施例中使用了几种机械预处理方法。最终，决定使用喷射式粉碎机进行研磨(与锤式粉碎机研磨相反)，其能够将煤颗粒研磨成5μm的尺寸或者更小。如结果中所见，减小尺寸的粉碎机Fluid Energy Model 0101JET-O-MIZE 630能够进行所需的特定规格并将煤颗粒研磨为5μm的尺寸或者更小。煤研磨过程极为重要，因为当颗粒尺寸为5μm或者更小时，显著增加的表面积提供了功能性基团的进一步暴露，所述功能性基团随后开始暴露于酶。这是有益的，因为反应速率和产物体积的增加高度依赖于这些功能性基团的可利用度或者暴露。

煤颗粒的颗粒尺寸和散布与“可溶性”的定义接近。颗粒的级别为800-1200个苯环。这些是“进料”至一系列酶以生产液态燃料的非常有利的尺寸。

溶解和转化。利用烟煤(来自Rosebud Mining Company,Kittanning,PA的Lower Kittanning煤层，高容量-No.5)。在进行实验之前，使用机械研磨器对煤进行研磨。如机械预处理部分中所提及，使用几种不同的颗粒尺寸，但是大部分实验利用大约5μm尺寸的煤颗粒。所分析的结果来自利用5μm尺寸的煤颗粒的实验。

利用化学预处理使煤“风化”或者氧化，这转而有助于酶促转化过程中煤的可溶性。实验中使用几种不同的预处理方法，包括：过氧化氢、H₂O₂(3％pH 5，15％pH 4.5和30％pH 4)、PBS Mine H₂O(Somerset,PA pH2.2)、硝酸HNO₃(pH 1，pH 2，pH 3，pH 4和15M)、蒸馏H₂O和预热的煤，其中5μm的煤在120℃温度下预热大约36小时。使用煤进行实验之前，使所有经预处理的样品干燥。

除了利用不同类型的经预处理的煤进行实验之外，还利用未经处理的煤进行实验。对来自经预处理的煤实验的结果进行分析，以确定最有效的预处理方法。从这些结果中，确定了最有效的预处理方法是过氧化氢(>3％，>15％和30％)、经加热的煤、矿井水和硝酸。对利用这些经特定预处理的煤样品的实验结果进行了讨论。

酶促方法：漆酶和锰过氧化物酶

在本实施例酶促实验使用漆酶来自黄孢原毛平革变色栓菌和锰过氧化物酶(MnP的)，无论是从Sigma-Aldrich公司购买的进行。漆酶和锰过氧化物酶的白腐菌产生的胞外酶。它们被认为是两个木质素降解酶的主要组并且能够有效地降解木质素。被用于此过程中，酶可溶化的第一步漆酶，锰过氧化物酶和在此过程中，烃转化的第二工序中使用。这种方法的详细的实验步骤如下所示。

漆酶和锰过氧化物酶程序

步骤1：漆酶

解决方案：

·漆酶缓冲液-100mM的柠檬酸-l00mM磷酸钠缓冲液，pH4.5

·漆解决方案-漆酶(杂色吨)溶解于漆酶缓冲

程序

1)干燥，预处理的煤的0.1克用在试管漆酶缓冲3ml的组合

2)的漆酶溶液2ml加入到每个试管含有煤和漆酶缓冲

3)每个试管摇动振荡器上实验室线轨道摇床过夜

4)用所述的Genesys10UV-VIS分光光度计(范围190nm测量从实验产品-1100nm)，购自Fisher Scientific。在分光光度计测得的产物浓度(滴数)进行了调整，以使吸收强度相对相同。

第2步：锰过氧化物酶(锰过氧化物酶)

解决方案

·MnP的缓冲器-160MM丙二酸液，pH值4.5

·MnP的溶液-锰过氧化物酶氧化剂的溶液中锰过氧化物酶缓冲液混合以形成Mnmalonate络合物(在测定过程中所述复合体)

程序

1)中加入的锰过氧化物酶溶液2.5毫升，以分光光度计比色皿

2)从漆酶实验(来自步骤1的产品的每个产品的几滴)加入到反应杯进行烃转化。浓度(滴数)进行了调整，以使吸收强度相对相同。

3)从实验产品立即测量，然后用每15分钟(达到1小时)Genesys的10UV-VIS分光光度计(范围190nm-1100nm)，购自Fisher Scientific

化学方法：螯合剂

使用螯合剂化学的方法也用在这个例子。螯合剂行动起来，从煤结构中删除络合离子溶解煤。三种不同的螯合剂被使用，然而，酒石酸铵似乎是最有效的螯合剂。对于实验，在此过程中的溶解步骤中使用酒石酸铵，然后锰过氧化物酶在该过程的烃转化步骤中使用。对于这种方法的一个更详细的步骤如下所示。

螯合剂程序

第1步：酒石酸铵

过程

·螯合剂解决方案-酒石酸铵的l.00g与H20程序250毫升混合

用于每个试验0各l0g每个预处理的干燥的煤样的-1)煤

2)煤的0.1克，在每个试管的螯合剂溶液10ml混合

3)每个试管摇动振荡器上实验室线轨道摇床过夜

4)用所述的Genesys10UV-VIS分光光度计(范围190nm测量从实验产品-1100nm)，购自Fisher Scientific。在分光光度计测得的产物浓度(滴数)进行了调整，以使吸收强度相对相同。

第2步：锰过氧化物酶

解决方案

·MnP的缓冲器-160MM丙二酸液，pH值4.5

·MnP的溶液-锰过氧化物酶氧化剂的溶液中锰过氧化物酶缓冲液混合以形成Mnmalonate络合物(在测定过程中所述复合体)

方法

1)中加入的锰过氧化物酶溶液2.5毫升，以分光光度计比色皿

2)从酒石酸实验(来自步骤1的产品的每个产品的几滴)加入到反应杯进行烃转化。浓度(滴数)进行了调整，以使吸收强度相对相同。

3)从实验产品立即测量，然后用每15分钟(达到1小时)Genesys的10UV-VIS分光光度计(范围190nm-1100nm)，购自Fisher Scientific

酶法:Phanerochaete Chrysosporium

除了使用胞外酶，实验使用已知产生木质素降解酶活生物体进行。这些实验被设计为活生物体排泄此类胞外酶来降解预热煤提供的环境。机体采用，白腐菌(P.菌)，是一种白腐真菌其排泄胞外酶降解木质素。该生物自ATCC(ATCC#24725)购得。两个不同的生长培养基用于培养巴斯德菌：马铃薯葡萄糖(PD)和沙氏葡萄糖(SD)。对于这种方法的一个更详细的实验步骤如下所示。

P.Chrysosporium方法

1)干燥，预热煤0.2克称重并放入50ml的三角烧瓶中

2)生长培养基肉汤30毫升(接种黄孢原毛平革)加入到煤在烧瓶

3)每个烧瓶摇动振荡器上实验室线轨道摇床不断14天

4)前2小时后，从每个烧瓶中取的样品为一个初始读数，以及一旦在第1-7天，第10天，每天使用测定日14.这些样品Genesys的10UV-VIS分光光度计(范围190nm-l100nm)，购自Fisher Scientific。

结果

(1)漆酶和锰过氧化物酶，(2)酒石酸铵和锰过氧化物酶，和(3)活使用两种不同的生长培养基P.金孢子菌属：如先前所述，进行增溶和转化实验时采取了三种不同的方法。前两种方法包括一个增溶步骤中，使用这两种酶和螯合剂，最初分解煤结构；分解煤传递至烃转化步骤，使用其他的酶，以进一步破解烃分子为较小的烃分子。在活的有机体的做法，P.金孢子被用来排泄一些胞外酶的既分解，然后进一步打击煤炭结构。

在第二和第三季度酶和螯合剂的实验后，将其确定该酶促方法是在比化学(螯合剂)的方法降解烟煤更有效。此外，螯合剂是昂贵的并且造成潜在的不利，对环境的影响。从这些实验结果和环境考虑，它被确定螯合剂的方法是不理想。

与活黄孢原毛平革实验是使用不同类型的生长培养基进行。从这些实验结果表明，在最佳生长条件为：对PD生长培养基和SD生长培养基，既与胨的至少量加入。

煤炭降解成功的结果无论从酶方法(漆酶和锰过氧化物酶)和活的有机体办法(P.金孢子菌属)获得。因此，只有从这些方法的分光结果呈现和分析。图19A至22C示出了从这些实验的结果。

每一条曲线显示波长(nm)与相对吸光度(A)，其中相对吸光度(A)是与透射率(T)：A＝logl0(1/T)。在图的图例应当从左到右阅读，示出测定样品的顺序。

结果，根据所用的预处理的类型划分为多个部分。仅由最有效的预处理的光谱结果。这些预处理是过氧化氢(3％，15％和30％)，加热煤，矿井水和硝酸(pH为1)的预处理。这些结果的比较后为烟煤的劣化的最佳总体方法将被确定。

3％H₂O₂预处理的煤

图19A示出从3％H₂O₂的结果，使用的漆酶和锰过氧化物酶溶液进行预处理的煤的实验。在漆酶缓冲预处理煤的光谱显示周围波长215nm的峰和大约1.0A的吸光度(红色曲线)。这个频谱可以比较经预处理的煤中漆酶溶液的光谱，其示出围绕波长215nm的峰和大约2.0A(蓝色曲线)的吸光度。

这两个光谱表明，3％的H₂O₂预处理确实对增溶煤一定效果，但漆酶工程以进一步氧化和溶解它。在图19A中的光谱也示出了在从波长215nm的峰至约244nm的移位和吸光度1.74A减少从2.OA，当漆酶产物加入到锰过氧化物酶溶液(绿色曲线-0min)时发生。吸光度(绿色曲线-0分钟)继续随时间而减少约1.45A(粉红色曲线-15分钟，绿松石曲线-30分钟，黄色曲线-45分钟，灰色曲线-1小时)。

图19B显示了从3％H₂O₂，预处理的煤实验的结果。在酒石酸盐溶液中未处理煤频谱不会出现在光谱(红色曲线)的强吸收峰。然而，在酒石酸盐溶液预处理煤示出围绕225nm的峰和大约0.634A的吸光度(蓝色曲线)。这示出了预处理对使用酒石酸溶液的煤的化学增溶了非常强烈的影响。在图19B中的光谱也示出了在峰值从225nm至约243nm的偏移，当酒石酸产物加入到锰过氧化物酶溶液(绿色曲线-0分钟)时发生。这吸光度(绿色曲线-0分钟)继续随时间降低到大约0.286A(粉红色曲线-15分钟，绿松石曲线-30分钟，黄色曲线-45分钟，灰色曲线-LHR)。

图19C示出从3％H₂O₂中的PD培养基中含有黄孢原毛平革结果，预处理的煤试验。在这些生长条件预处理煤频谱最初显示周围245纳米的峰具有大约1.30A的吸光度和周围290nm的峰值约2.10A(红色曲线)的吸光度。这些峰不波长(nm)随时间移位，但每天不存在这样的吸光度(A)稍微改变。在第1天，吸收减少到245纳米和1.60A在290nm的(蓝色曲线)约0.52A，但第2天(绿线)为290nm增加到约1.45A在245纳米和2.20A。第2天之后，将吸光度再次降低在第3天，以1.28A在245纳米和1.35A在290纳米(粉红色曲线)。吸光度然后继续增加为剩余天。第4天：1.36A在245纳米和1.58A在290nm的(绿松石曲线)；第5天：1.51A在245纳米和2.02A在290nm的(黄色曲线)；第6天：1.56A在245纳米和2.48nm在290nm的(灰色曲线)；第7天：1.52A在245纳米和2.63A在290nm的(黑线)。

图19D示出了从3％H₂O₂的结果，经预处理的煤试验中的SD生长培养基，以十分之一胨的量(0.1×)，含黄孢原毛平革。在这些生长条件预处理煤频谱最初显示周围245纳米的峰和2.73A的吸光度(红色曲线)。该峰值在245纳米不波长移位，并且不增加或显著吸光度从第1天，通过天下降10 1天：2.52A(蓝色曲线)；第2天：2.57A(绿线)；第3天：2.42A(粉红色曲线)，第4天：2.39A(青绿色曲线)；第5天：2.71A(黄色曲线)；第6天：2.66A(灰色曲线)；第7天：2.52A(黑线)；第10天：2.60A(橙色曲线)。在245纳米的吸光度然后在14日到2.02A(米黄色曲线)降低。

15％H2O2预处理的煤

图19E示出了从15％H₂O₂，预处理的煤实验的结果。在漆酶缓冲预处理煤的光谱显示周围为230nm的峰，只有约0.877A(红色曲线)的吸光度。这个频谱可以比较经预处理的煤在漆溶液，其示出围绕224nm的峰与约3.20A(蓝色曲线)的吸光度光谱。通过比较这些光谱，可以看出，预处理确实对煤的溶解的影响，但是，需要进一步的溶解的漆酶。在图2.05的光谱也示出了在从224nm峰至约249nm的移位和吸光度1.99A减少从3.20A，当漆酶产物最初加入到锰过氧化物酶溶液(绿色曲线-0分钟)时发生。这吸光度(绿色曲线-0分钟)继续随时间降低到约1.63A(粉红色曲线-15分钟，绿松石曲线-30分钟，黄色曲线-45分钟，灰色曲线-LHR)。

图19F示出了从15％H₂O₂，预处理的煤实验的结果。在酒石酸盐溶液中未处理煤频谱不会出现在光谱(红色曲线)的强吸收峰。然而，在解决酒石酸预处理煤显示周围227nm的峰值和大约1.21的吸光度(蓝色曲线)。这表明，在预处理对煤的酒石酸溶液中的化学增溶了非常强烈的冲击。在图19F的光谱也示出了在从227nm峰至约245纳米的位移和吸光度略有下降，从1.21A到1.14A，当酒石酸产物最初加入到锰过氧化物酶溶液(绿色曲线-OMIN)时发生。这吸光度(绿色曲线-0分钟)继续随时间而减少约0.52A(粉红色曲线-15分钟，绿松石曲线-30分钟，黄色曲线-45分钟，灰色曲线-LHR)。

图19G示出了从15％H₂O₂，预处理的煤试验在含有黄孢原毛平革PD培养基的结果。为在这些条件下，预处理的煤中的光谱(红色曲线)最初显示两个峰：在在290nm的与2.20A的吸光度的波长与1.00A的吸光度和一个峰245纳米的波长有一个峰。在图19G的峰值并不出现在波长移位，但确实显示在从每天的吸光度变化。后的第一天，将峰的吸光度，从在290nm的(蓝色曲线)的初始峰在245纳米和1.80A大约0.69A减小。这种吸收，然后在245纳米和2.30A在290nm的(绿线)第2天增加到1.56A，在245纳米和1.35A在290nm的(粉红色曲线)在第3天降低到1.31。第3天之后，曲线然后在吸光度增加对剩余天数。第4天：1.38A在245纳米和1.58A在290nm的(绿松石曲线)；第5天：1.53A在245纳米和2.13A在290nm的(黄色曲线)；第6天：1.62A在245纳米和2.22A在290nm的(灰色曲线)；第7天：1.74A在245纳米和2.69A在290nm的(黑线)；第10天：1.75A在245纳米和2.76A在290nm的(橙色曲线)。

图19H示出了从15％H₂O₂的结果，经预处理的煤试验中的SD生长培养基，以十分之一胨的量(0.1×)，含黄孢原毛平革。在这些生长条件预处理煤频谱最初显示周围245纳米的峰和2.78A的吸光度(红色曲线)。此峰在245纳米不会波长漂移，但略有吸收，从1天到天减少14天1：2.64A(蓝色曲线)；第2天：2.45A(绿线)；第3天：2.38A(粉红色曲线)，第4天：2.39A(青绿色曲线)；第5天：2.02A(黄色曲线)；第6天：2.09A(灰色曲线)；第7天：2.12A(黑线)；第10天：2.13A(橙色曲线)；第14天：1.50A(米黄色曲线)。

30％H₂O₂预处理的煤

图19I示出了从30％H₂O₂，预处理的煤实验的结果。在漆酶缓冲预处理煤的光谱显示围绕224nm的峰和大约1.99A的吸光度(红色曲线)。这个频谱可以比较经预处理的煤在漆溶液，其示出围绕211nm的峰与约2.58A(蓝色曲线)的吸光度光谱。这些光谱的比较示出了，通过将自身的30％的预处理是作为在溶解该煤的漆酶几乎一样有效。在图19I中的光谱也示出了在从211nm峰至约249nm的移位和吸光度1.77A减少从2.58A，当漆酶产物最初加入到锰过氧化物酶溶液(绿色曲线)时发生。这吸光度(绿线)也继续随时间而减少约1.13A(粉红色曲线-15分钟，绿松石曲线-30分钟，黄色曲线-45分钟，灰色曲线-1小时)。

图19J示出了从30％H₂O₂，预处理的煤实验的结果。在酒石酸盐溶液中未处理煤频谱不会出现在光谱(红色曲线)的强吸收峰。然而，在酒石酸盐溶液预处理煤示出围绕228nm的峰和大约1.52A的吸光度(蓝色曲线)。在这些峰的差示出了预处理是必要的化学溶解煤中酒石酸溶液。在图19J中的光谱也示出了在从228nm峰至约245纳米的移位和吸光度的下降从1.52A到1.18A，当酒石酸产物加入到锰过氧化物酶溶液(绿色曲线-0分钟)时发生。这吸光度(绿色曲线-0分钟)继续随时间而减少约0.87A(粉红色曲线-15分钟，绿松石曲线-30分钟，黄色曲线-45分钟，灰色曲线-LHR)。

图19K示出了从30％H₂O₂，预处理的煤试验在含有黄孢原毛平革PD培养基的结果。对于该特定预处理煤频谱最初显示具有大约0.86A的吸光度和周围295nm的峰值与1.89A(红色曲线)的吸光度周围245纳米的峰。后的第一天，吸光度降低到在245纳米左右0.59A，但保持在大约0.86A在295nm的(蓝色曲线)。从第2天到第5天，在245纳米的吸光度不显著改变，而在295nm的峰的每一天稍有变化。第2天：1.54A在245纳米和2.56A在295nm的(绿线)；第3天：1.38A在245纳米和2.22A在295nm的(粉红色曲线)；第4天：1.57A在245纳米和2.26A在295nm的(绿松石曲线)；第5天：1.76A在245纳米和2.83A在295nm的(黄色曲线)。在第6天，在两个峰的吸光度的增加在245纳米和3.46A大约2.29A在295nm的(灰色曲线)。

图19L示出了从30％H₂O₂的结果，经预处理的煤试验中的SD生长培养基，以十分之一胨的量(0.1×)，含黄孢原毛平革。在这些生长条件预处理煤频谱最初显示周围243纳米的峰和1.56A的吸光度(红色曲线)。该峰值在245纳米不波长超过1天至7天调整，但降低的吸光度，与增加吸收天3和10除外。第1天：1.47A(蓝色曲线)；第2天：1.39A(绿线)；第3天：2.09A(粉红色曲线)，第4天：1.30A(青绿色曲线)；第5天：1.07A(黄色曲线)；第6天：0.93A(灰色曲线)；第7天：0.93A(黑线)。第10天，吸光度在245纳米增加到2.58A(橙色曲线)。

热煤预处理

图19M示出了从加热时，30％的H₂O₂，预处理的煤实验的结果。在漆酶缓冲预处理煤频谱显示周围237nm的峰值，只有约1.41的吸光度(红色曲线)。这个频谱可以比较经预处理的煤在漆溶液，其示出围绕227nm的峰与约3.09A(蓝色曲线)的吸光度光谱。这些光谱的比较表明，在预处理确实对煤溶解一定的效果，但该漆酶进一步氧化的煤进行溶解。在图19M中的光谱也示出了在从227nm峰至约247nm的移位和吸光度2.31A减少从3.09A，当漆酶产物最初加入到锰过氧化物酶溶液(绿色曲线-0分钟)时发生。这条曲线也继续随时间而改变(粉红色曲线-15分钟，绿松石曲线-30分钟，黄色曲线-45分钟，灰色曲线-1小时)。

图20A示出了从加热煤实验的结果。这个预处理与P.菌PD生长培养基的光谱最初不显示在0天(红色曲线)或1天(蓝色曲线)巅峰强者。那么A峰开始形成第2天左右为240nm与1.39A的吸光度(绿线)。此峰为240nm然后在3日到0.68A(粉红色曲线)和4日至0.23A(蓝绿色曲线)的吸收减少。最后，在最后2天的峰值增加吸光度为240nm。第5天：1.39A在245纳米(黄色曲线)和6日：在波长240nm(灰色曲线)1.93。

图20B示出了从以SD生长培养基中加热煤实验的结果，以十分之一胨(0.1X)的量，含有黄孢原毛平革。为在这些条件下，预处理的煤频谱最初显示在约240nm处的峰和0.61A的吸光度(红色曲线)。此峰在240nm的再吸收增加至1日(蓝色曲线)约0.78A。从第2天至5天，在此波长的吸光度继续改变。第2天：0.73A(绿线)；第3天：0.56A(粉红色曲线)；第4天：0.78A(青绿色曲线)；第5天：0.44A(黄色曲线)。在第6天的波长出现移位至约260nm处并保持在该波长在第7天与第10天第6天：0.66A(灰色曲线)；第7天：0.55A(黑线)和第10天：0.95A(橙色曲线)。

矿井水预处理的煤

图21A显示了从矿井水的结果，预处理煤实验。在漆酶缓冲预处理煤频谱显示利用245nm左右的峰值和大约0.71的吸光度(红色曲线)。这个频谱可以比较经预处理的煤在漆溶液，其示出围绕217nm的峰与约2.34A(蓝色曲线)的吸光度光谱。这些光谱的比较结果表明，该预处理确实有助于最初氧化和分解的煤，但该漆酶是必要的进一步分解。在图21A还示出了在从217nm峰的移位至约249nm和在吸光度2.25A略有下降，从2.58A光谱，当漆酶产物最初加入到MnP的溶液发生(绿色曲线-0分钟)。这吸光度(绿色曲线-0分钟)继续随时间降低到约1.83A(粉红色曲线-15分钟，绿松石曲线-30分钟，黄色曲线-45分钟，灰色曲线-1小时)。

图21B显示了矿井水的结果，预处理煤实验。在酒石酸盐溶液中未处理煤频谱不会出现在光谱(红色曲线)的强吸收峰。然而，在解决酒石酸预处理煤显示周围228nm的峰值和大约1.43的吸光度(蓝色曲线)。这两条曲线的比较表明，在预处理是必要的化学溶解煤中酒石酸溶液。图2中的光谱1B还示出了从228nm中的峰值移位到约245纳米，在酒石酸盐产物加入到锰过氧化物酶溶液(绿色曲线-0分钟)时发生。这吸光度(绿色曲线-0分钟)继续随时间而减少约0.87A(粉红色曲线-15分钟，绿松石曲线-30分钟，黄色曲线-45分钟，灰色曲线-LHR)。

图21C显示了从矿井水在PD培养基中含有P.菌的结果，煤炭预处理试验。此预处理煤频谱显示2峰：约245纳米一个峰和周围305nm一个峰。在245纳米的峰值最初具有1.17A(红色曲线)的吸光度，并保持在第1天(蓝色曲线)之后1.17A。在245纳米的峰值再吸收增加了2天至约2.00A(绿线)，只有在吸收了剩余天数略有变化。第4天：1.84A(粉红色曲线)；第5天：1.89A(青绿色曲线)；第6天：1.87A(黄色曲线)；第7天：1.78A(灰色曲线)；第10天：1.82A(黑线)。在305nm的峰具有2.97A(红色曲线)的初始吸光度，也超过了时间周期非常轻微改变。第1天：3.06A(蓝色曲线)；第2天：3.51A(绿线)；第4天：3.49A(粉红色曲线)；第5天：3.12A(青绿色曲线)；第6天：3.31A(黄色曲线)；第7天：3.24A(灰色曲线)；第10天：3.06A(黑线)。

图21D示出了从矿井水的结果，经预处理的煤试验中的SD生长培养基，以十分之一蛋白胨(0.1×)的量，含有黄孢原毛平革。为在这些条件下，预处理的煤中的光谱最初显示围绕297nm的宽峰用约3.94A(红色曲线)的吸光度。第1天至第5天的频谱保持在297nm相对不变。第1天：3.95A(蓝色曲线)；第2天：3.96A(绿线)；第3天：3.89A(粉红色曲线)；第4天：3.97A(青绿色曲线)；第5天：3.82A(黄色曲线)。第6天的吸光度开始在297nm略有下降，并继续第7天与天略有下降10.6日：3.70A(灰色曲线)；第7天：3.60A(黑线)；第10天：3.45A(橙色曲线)。第14天，吸光度增加至3.76A(米色曲线)。

HNO3(pH 1)预处理的煤

图22A示出了从HNO 3(pH值为1)中，预处理的煤实验的结果。在漆酶缓冲预处理煤的光谱显示周围为210nm的峰和大约只有0.47A(红色曲线)的吸光度，并可以比较频谱在漆溶液中，经预处理的煤表示围绕213nm和峰约1.68A(蓝色曲线)的吸收。这些曲线的比较表明，在预处理确实对煤增溶的效果，但该漆酶溶液工作，以进一步氧化和分解的煤。在图22A中的光谱也示出了在从213nm峰至约244nm的移位和吸光度1.35A减少从1.68A，当漆酶产物最初加入到锰过氧化物酶溶液(绿色曲线-0分钟)时发生。这吸光度(绿色曲线-0分钟)继续随时间而减少约0.99A(粉红色曲线-15分钟，绿松石曲线-30分钟，黄色曲线-45分钟，灰色曲线-1小时)。

图22B示出了从HNO 3(pH值为1)中，预处理的煤试验在含有黄孢原毛平革PD培养基的结果。该实验的光谱最初显示与-0.52A(红色曲线)的相对吸光度260nm附近的峰。这吸光度在260nm处的吸光度增加至-0.32A 1日(蓝色曲线)。在第2天的峰值偏移，并开始与0.794A(绿色曲线)的吸光度，以形成为240nm。此峰在240nm的第3天略微增加至0.93A(粉红色曲线)，但之后从第4天在吸收降低至第7天第4天：0.80A(青绿色曲线)；第5天：0.49A(黄色曲线)；第6天：0.44A(灰色曲线)；第7天：0.003A(黑线)。

图22C示出了从HNO 3(pH值为1)中，预处理的煤试验中的SD培养基的结果，具有十分之一胨的量(0.1X)，含黄孢原毛平革。为在这些条件下，预处理的煤频谱最初显示-0.23A约235nm的吸光度(红色曲线)。在该波长的吸光度，然后继续通过天在第1天，以减少7 1天：-0.35A(蓝色曲线)；第2天：-0.44A(绿线)；第3天：-0.34A(粉红色曲线)；第4天：-0.33A(青绿色曲线)；第5天：-0.55A(黄色曲线)；第6天：-0.70A(灰色曲线)；第7天：-0.78A(黑线)。最后在第10天，吸光度在235nm增加到约-0.30A(橙色曲线)。

本例的工作集中在烟煤转化为液体燃料。这一过程涉及由天然微生物在煤中发现的分子结构分解成可以输入他们的代谢途径为碳和能量的释放可用形式采取同样的步骤。这样的途径的一个例子是在图23给出的苯酚的消化。

酚类表示自从在烟煤中的碳40-75％，一类重要的官能团的芳香，和酚及酚类部分代表微生物芳香环裂解首选入口点。

打开芳环结构也是煤炭在CFS过程中转化为液体燃料的必要的第一步。作为参考，对于苯酚降解时间序列紫外光谱的在图24中给出尽管这些结果没有从生物系统获得的，但它们确实提供了可以从所示的反应途径可以预期在紫外光谱的过渡的定性测量以上。

如该图所示，吸光度的期间降解的对应于芳族中间体的形成的初始阶段的UV光谱增大的前端。作为形成多种中间体，苯酚的浓度降低，通过在268nm处吸光度的减少为苯酚所示。两个峰然后开始减小，苯酚被消耗和芳香族中间体经受环切割。作为切割的芳香中间体转化成有机酸最终吸光度接近零。

在本实施例呈现的光谱表明在本实施例中使用的方法产生相同类型的退化中所示的UV光谱苯酚降解。它同样清楚的是，以其中煤炭经受转化的程度与煤进行预处理的方式显著而变化。

如前所述，采取了三种不同的方法来降解烟煤：(1)漆酶和锰过氧化物酶，(2)酒石酸盐和锰过氧化物酶，并使用两种不同的生长培养基(3)住黄孢原毛平革。从漆酶和锰过氧化物酶实验和现场黄孢原毛平革实验的结果显示了最好的结果和进行比较。

这些光谱是通过22C示出图19A。通过22C在图19A所示，使用煤显示峰的各种预处理在240nm的这些方法的频谱至300nm区域。这些峰对应于来自烟煤的降解形成较小的芳香环的中间体和有机酸。从这些光谱，很明显，这两个方法都工作，以降低煤。

第一个酶促溶解和转化实验使用漆酶和锰过氧化物酶，在图19A，19E，19I，19M，21A，和22A所示进行。周围245纳米的光谱显示峰-250nm的。在这些光谱的峰开始吸光度历时1小时，以减少，相应于芳族中间体的消耗，因为他们经历环切割。

活黄孢原毛平革用作其他方法降解烟煤。它是在两个不同的生长培养基中生长到对生物体排泄胞外酶来降解煤提供足够的生长条件。从含有在240nm的至300nm区域P.chrysosporium显示的山峰，如图19C所示，19G，19K，20A，21C和22B中所示的马铃薯葡萄糖(PD)的生长培养基的光谱。峰值吸光度示出，以减少在这些实验中，为期7至10天。

第菌也生长在沙氏葡萄糖(SD)生长介质。对应于这些实验光谱在图中示出图19D，19H，19L，20B，2号，和22C。大多数在光谱的峰周围235nm看到245纳米。在吸收峰的减少，可以看出在一段10至14天。

对于两个不同的酶方法在UV-VIS光谱之间比较的主要参数是峰(nm)，而在峰吸光度(A)的降低的位置。如上所述，从实验的峰值落在为240nm至300nm的范围内，其对应于打破煤结构时形成的芳族中间体。从漆酶+锰过氧化物酶和P.chrysosporium在S.D.峰生长培养基实验表明，在235nm波长250nm到类似地区的山峰。从P.chrysosporium在P.D.峰生长培养基显示两个不同的峰，在245纳米地区和290nm的区域。

当比较在峰值吸光度减小，可以看出，与漆酶和锰过氧化物酶的实验进行的实验的吸光度，用1小时的时间周期减少。然而，在直播体育菌的实验中，在吸收峰的减少被认为是在一段10至14天。这是在它需要的芳族中间体发生时间，以形成并环切割一个显著差异，并说明了使用胞外酶，并使用活有机体之间的主要差异之一。

当比较不同类型的预处理中的光谱，可以看出，最一致的结果是在3％，15％，和30％的过氧化氢预处理看到。这些光谱显示在235nm峰为240nm地区所有预处理煤样。在光谱的加热煤，使用活黄孢原毛平革实验峰都不如使用胞外酶的实验的峰值为一致。在矿井水预处理煤，峰值不超过吸收时间，因为他们使用胞外酶在实验中做到减少使用活P.chrysosporium的实验。最后，对于硝酸光谱在用活黄孢原毛平革，这是不使用胞外酶的峰相一致的实验预处理煤显示负吸光度。在这个例子中，已经显示，这两个胞外酶和活有机体可以用来分解烟煤。从这些实验的光谱表明在240nm的峰至300nm区域，对应于从降解煤形成的更小的芳香环的中间体和有机酸。但是，比较这些不同的方法时，显然的是攻击煤结构的最有效的方法是使用酶。这方法比使用活生物体的几个优点。

对使用代替活生物体胞外酶的主要优点是必要的分解时间。如在光谱可见，从使用漆酶和锰过氧化物的试验的结果表明：试验的第一个小时内的吸收率的降低。在吸收大致相同的跌幅也见于P.chrysosporium结果。然而，这些结果分别记录在数天，而不是分钟。它显然需要较长的时间用于活生物体排泄适当胞外酶降解煤。此外，如之前所提到的，与生物体的工作，因为它们是活的，未知量的数目众多是困难的。这包括维持对生物体提供了理想的培养条件，也控制污染物和杀真菌的副产物，可能防止细菌生长或分泌胞外酶来分解煤。也可以使用

其他木质素降解酶，如木素过氧化物酶，降解烟煤。此外，其他类型的白腐真菌，如变色栓菌，可以生长并暴露于烟煤。不同培养条件也可影响生物体如何排泄胞外酶降解煤。

虽然本发明的优选实施例已被示出和描述，修饰物可以通过本领域技术人员不脱离本发明的精神和教导中做出。和描述的实施例本文所提供的实施例仅是示范性的，并且不旨在进行限制。许多变化和在此公开的本发明的修改是可能的并且在本发明的范围之内。因此，保护的范围不受上文描述的限制，而是仅由所附的权利要求，包括在权利要求的主题的所有等同物的范围的限制。