用纳米孔的分析物测序的制作方法

专利名称：用纳米孔的分析物测序的制作方法
用纳米孔的分析物测序相关申请的交叉引用本申请要求2010年2月23日提交的美国临时申请系列No. 61/307，441，和2010年8月20日提交的美国临时申请系列No. 61/375，707的权利，各通过引用以其整体并入本文。有关序列表的声明与本申请关联的序列表以文本形式代替纸拷贝提供及通过引用并入说明书。含有序列表的文本文件的名称是36172_SEQ_Final_2011-02-23. txt。文本文件是12KB ;创建于2011年2月23日；及经EFS-Web随着说明书的提交而提交。政府许可证权利的声明
本发明在由美国健康学会颁发的资金号5R21HG004145和R01H6005115的政府支持下完成。政府在本发明中具有特定权利。
背景技木DNA中编码的信息对医学及生命科学具有至上重要性。人基因组的标位革命化遗传病症理解和疾病的预测，及会辅助发展治疗。快速和不昂贵地测序DNA的能力是个别化的医学及科学研究所必要的。需要超过原Sanger测序的新测序技术的开发来达到这些目标。甚至更优选的是可应用于除了核酸之外的聚合物的新测序技木。发明概述因此，一些实施方式提供对2个或更多用至少第I阻拦构建体和第2阻拦构建体修饰的分析物单元进行测序的方法，其包括(a)提供在包含第I导电液体介质和修饰的分析物的顺式侧和包含第2导电液体介质的反式侧之间定位的纳米孔，其中纳米孔包含提供顺式侧和反式侧之间的液体交通的开ロ ；(b)使修饰的分析物的第I阻拦构建体在进入开ロ后中止修饰的分析物，由此产生第I离子电流水平，其中第I离子电流水平代表第I单元；(c)改变修饰的分析物的第I阻拦构建体，所述改变允许修饰的分析物向反式侧前进；(d)使修饰的分析物的第2阻拦构建体在进入开ロ后中止修饰的分析物，由此产生代表第2単元的第2离子电流水平；及(e)将第I离子电流水平和第2离子电流水平与已知的単元的已知的离子电流水平进行比较，由此对2个或更多分析物单元进行测序。也提供的是对核酸的2个或更多核苷酸进行测序的方法，其包括(a)提供包含至少2个各定义为Xn的未知的核苷酸或未知的重复核苷酸组的核酸，其中n=l 1，000，000,且其中各X和各η可相同或不同；将第I插入物阻拦构建体和第2插入物阻拦构建体放入核酸，各包含双链核酸和各与Xn相邻，以提供修饰的核酸；(c)提供在包含第I导电液体介质和修饰的核酸的顺式侧和包含第2导电液体介质的反式侧之间定位的突变MspA孔蛋白；Cd)使第I插入物阻拦构建体在进入突变MspA孔蛋白的隧道后中止修饰的核酸，由此产生第I离子电流水平，其中第I离子电流水平代表第IXn ; (e)改变第I插入物阻拦构建体，所述改变允许修饰的核酸向反式侧前进；(f)使修饰的核酸的第2插入物阻拦构建体在进入开ロ后中止，由此产生代表第2Xn的第2离子电流水平；及(g)将第I离子电流水平和第2离子电流水平与已知的Xn的离子电流水平进行比较，由此对核酸的2个或更多核苷酸进行测序。也提供的是将离子电流水平与已知的分析物单元关联的方法，其包括(a)提供在包含第I导电液体介质和用2个或更多阻拦构建体修饰且含有全部已知的目标单元的分析物的顺式侧和包含第2导电液体介质的反式侧之间定位的纳米孔，其中纳米孔包含提供顺式侧和反式侧之间的液体交通的开ロ ；(b)使修饰的分析物的第I阻拦构建体在进入开ロ后中止修饰的分析物，由此产生离子电流水平，其中离子电流水平代表第I已知的分析物单元；(c)改变修饰的分析物的第I阻拦构建体，所述改变允许修饰的分析物向反式侧前进；(d)使修饰的分析物的第2阻拦构建体在进入开ロ后中止修饰的分析物，由此产生代表第2単元的第2离子电流水平；及(e)用含有全部単元及对应目标离子电流水平的已知的修饰的分析物校准纳米孔和任选地获得分隔物水平，由此将各离子电流水平与已知的分析物单元关联。
还提供的是减缓或促进修饰的分析物通过纳米孔的开ロ转位的速度的方法，其包括Ca)提供在包含第I导电液体介质和修饰的分析物的顺式侧和包含第2导电液体介质 的反式侧之间定位的纳米孔；(b)使修饰的分析物的阻拦构建体在进入开ロ后中止修饰的分析物，由此产生一个或更多离子电流水平，其中各离子电流水平是可区分的；及(C)改变至少修饰的分析物的第I阻拦构建体，所述改变允许修饰的分析物向反式侧前进；其中修饰的分析物具有小于分析物在修饰和改变的缺失下通过隧道转位的平均转位速度的经开ロ平均转位速度。系统也在本文提供，诸如包含具有开ロ的纳米孔的系统，其中纳米孔定位在第I导电液体介质和第2导电液体介质之间，其中至少ー个液体介质包含定义为修饰的核酸的修饰的分析物。

本发明的上述方面和许多伴随优势会变得更容易被同意，如通过參考以下详述结合附图变得更佳明白。图I描绘MspA的晶体结构。使用空间填充模型的通过Ml-NNN-MspA的结构的交叉-截面图显示氨基酸类红是带正电的；蓝是带负电的；紫是极性的；黄是疏水-脂肪族；橙是疏水-芳族。见 Science 303:1189 (2004)。图2A，2B, 2C和2D描绘通过纳米孔MspA的DNA转位。卡通描绘通过MspA的DNA转位和得到的残余电流。图2A:正电压吸引带负电的发卡DNA进入孔隙。图2B:DNA穿过孔隙直到更宽发卡双链体防止进ー步转位。图2C :几个ms之后，发卡解离允许完全转位。图2D :得到的与以上卡通关联的电流迹显示，存在于孔隙的发卡DNA允许残余电流，Ires，直到发卡双链体解离。图3A和3B提供平均的残余离子电流，<Ires>的例直方图，其显示14bp发卡(hp)的不同"同聚物"单链尾。在(a) 180mV及(b) 140mV取数据。包括在图3A的转位具有相比Ims更长的持续时间及掲示可区分的和良好-解析的电流水平。许多实验的拟合的高斯平均值的平均提供于下例。有用各发卡DNA的至少4个实验重复。在140mV宽度减小是由于作为解离时间平均增加的时间是相比在180mV的解离时间的几乎30X更长。附加信息可见于表A。图4A，4B，4C和4D提供由于在另外聚_dA发卡尾中单核苷酸取代的残余电流直方图。图4A :为比较目的，图4A总结在ISOmV同聚物发卡尾Ires的平均的高斯平均值和宽度(在下例中描述拟合值)。黑色，蓝色，红色和绿色的颜色用于辅助分离分别由于dA，dG，dC和dT对Iras的效应。残余电流随着在另外聚-dA同聚物发卡(hp)尾内单核苷酸dNx的位置，X而显著变化。图4B :当核苷酸取代与双链末端相邻，x=l，残余电流偏离以模拟与取代的核苷酸关联的同聚物值。ClT1取代最接近地模拟IdT。图4C:在x=2，核苷酸取代也导致残余电流更接近与取代的核苷酸关联的同聚物。dC2取代最接近Id。。图4D:随着在x=3的任何取代，Ires仅稍微不同于IdA，提示MspA在发卡双链体之后主要 敏感于2nt。在x=l,2,或3的dGx取代不显著影响电流，如给定Ide和Itw的相对接近可预期的。
图5A，5B和5C描绘使用MspA的双链体间断的(DI)纳米孔测序的展示。将模拟分析物DNA的合成的DNA转化为具有携带信息的核苷酸之间的双链体。各这些双链必需依次熔解，或解离，如拉DNA通过孔隙，致使残余电流测定序列。采用选择以代表不同分析物 序列的 DNA :3' -ATGC-5，[SEQ ID NO: I](图 5A) ;3' -TACG-5’ [SEQ ID N0:2](图 5B)和"盲"序列测定为3' -GTCAC-5’ [SEQ ID N0:3](图5C)。残余电流的例迹显示在各图5A，5B和5C的左侧。残余电流中的各步骤是由14bp DNA双链体把持的MspA的收缩之内的3个核苷酸的代表。对于各这些步骤，对于N转位，各水平的直方图在各图5A，5B和5C的右侧显示。这些结果从3个或更多实验在140mV产生。在更高电压，转位数增加(见图10 12中的表)，但由于减少的时间平均而水平特异性减小(见表A和B和图10 12中的表)。图6A，6B，6C和6D是对于在同聚物发卡尾中，在远离发卡双链体的位置x的核苷酸dN插入，表示为dNx的平均残余电流，〈Ires〉的代表性的直方图。垂直虚线指示指示的同聚物残余电流的高斯平均值。由N给各直方图的计数。注意同聚物背景对核苷酸取代的效应的效应。图7A，7B和7C呈现来自对于分析物DNA，3' ATGC5 ' [SEQ ID N0:1](左栏)3’TACG 5’ [SEQ ID N0:2](中栏)及盲 DNA 测定为 3’GTCAC 5’ [SEQ ID N0:3](右栏)，在140mV的施加的电压的DI-测序例的数据。各组图含(a)含有4 (或5)个水平的一例电流迹，(b)对于自具有4 (或5)个水平的多个事件的各水平的各平均电流的直方图，及(c)指示对于直方图中的多个事件的电流水平之间的转变的密度标绘图。未阻断的孔隙电流是237. 0± I. OpA (平均值土标准误差)。用各DI-DNA进行3或更大个体实验。图8A，8B和8C代表以类似于图7A，7B和7C的形式，但对于160mV的施加的电压的数据。未阻断的孔隙电流是294. 7±0. SpA (平均值土标准误差)。图9A，9B和9C代表以类似于图8A，8B和8C的形式，但对于180mV的施加的电压的数据。未阻断的孔隙电流是325. 1±1. SpA (平均值土标准误差)。在更高电压，区别电流迹中的独特水平变得更难，因为电流水平的减少的时间-平均。图10 12在以上图5A，5B和5C的图标及以下实施例中所述。发明详述本文提供用于测序分析物单元的方法和系统。一般而言，测序可如下发生。在天然状态，分析物单元能通过纳米孔的开口转位。分析物通过孔隙的转位可对于溶解分析物单元的组合物太快。阻拦构建体用于修饰分析物，使得修饰的分析物不再能通过开口拟合。各阻拦构建体允许修饰的分析物在开口中止，使得可检测离子电流水平及与特定单元关联。然后可改变阻拦构建体，以提供现在能通过开口前进的修饰的分析物。修饰的分析物包含至少第2阻拦构建体，其导致开口中修饰的分析物的第2次中止，使得可检测相关于下一单元的下一离子电流水平。第2阻拦构建体的改变允许修饰的分析物再次通过开口前进。修饰的分析物中有多少阻拦构建体就可重复几次过程，使得对各分析物单元测序。因此，一些实施方式提供对2个或更多用至少第I阻拦构建体和第2阻拦构建体修饰的分析物单元进行测序的方法，其包括(a)提供在包含第I导电液体介质和修饰的分析物的顺式侧和包含第2导电液体介质的反式侧之间定位的纳米孔，其中纳米孔包含提供顺式侧和反式侧之间的液体交通的开口 ；(b)使修饰的分析物的第I阻拦构建体在进入开口后中止修饰的分析物，由此产生第I离子电流水平，其中第I离子电流水平代表第I单元，其可为修饰的分析物中的第I单元；(c)改变修饰的分析物的第I阻拦构建体，所述改变允许修饰的分析物向反式侧前进；(d)使修饰的分析物的第2阻拦构建体在进入开口后中止修饰的分析物，由此产生代表第2单元的第2离子电流水平；及&)将第I离子电流水平和第2离子电流水平与已知的单元的已知的离子电流水平进行比较，由此对2个或更多分析物单元进行测序。本文中的此或任何其他方法可根据需要通过使用修饰的分析物中第3，第4，第5，等，阻拦构建体来重复修饰的分析物中的序列第3，第4，第5，等，单元。 在一些实施方式中，修饰的分析物包含修饰的核酸，修饰的肽或修饰的蛋白。在一些实施方式中，修饰的分析物包含修饰的核酸。在一些实施方式中，修饰的核酸包含修饰的DNA,修饰的RNA，修饰的PNA或其组合。在一些实施方式中，修饰的分析物包含使分析物与阻拦构建体接合的接头。修饰的分析物可还被定义为包含使核酸与阻拦构建体接合的接头的修饰的核酸。在一些实施方式中，修饰的分析物包含具有IMDa或更小分子量的无机部分。在其他实施方式中，修饰的分析物包含具有IMDa或更小分子量的有机部分。任选地，至少一个阻拦构建体是插入物阻拦构建体。在一些实施方式中，插入物阻拦构建体是双链核酸。在其他实施方式中，至少一个阻拦构建体是悬吊物阻拦构建体。各阻拦构建体可相同或不同。在一些实施方式中，2个或更多阻拦构建体不同。在一些实施方式中，修饰的分析物包含转位起始尾。任选地，修饰的分析物是用至少2个各还被定义为双链DNA的插入物阻拦构建体修饰的ssDNA，其中各双链体可相同或不同，且其中各单元是单核苷酸(例如，C)或重复核苷酸(例如，CCC)。本文公开的方法可用于鉴定分析物中的重复单元，诸如重复核苷酸。在一些实施方式中，一个阻拦构建体中止修饰的分析物以允许离子电流水平测定单元的同一性和另一阻拦构建体中止修饰的分析物以产生不同于任何单元-特异性离子电流水平及定义为分隔物水平的离子电流水平。在一些实施方式中，分隔物水平区别分析物的连续单元。在一些实施方式中，分隔物水平区别分析物的连续及重复的单元。在一些实施方式中，周期性地设计分隔物水平以产生不同离子电流水平以提供检查和。任选地，至少2个分隔物水平用于提供二进制码以代表分析物单元。任选地，至少一个分隔物水平提供校验位。当对一个或更多修饰的分析物测序多次时，测序保真度可改善，以产生允许平均及共有读数的多个电流图案。电场的施加可导致修饰的分析物进入开口或另外导致修饰的分析物移动，诸如修饰的分析物在改变之后通过纳米孔的开口移动。在一些实施方式中，物理压力导致修饰的分析物进入开口或另外导致修饰的分析物移动。在一些实施方式中，磁珠附接于反式侧上的修饰的分析物，及改变由导致修饰的分析物进入或通过开口行进的磁力所导致，或另外导致修饰的分析物移动。例如，磁珠不通过孔隙拟合，但一旦转位起始尾使其通过孔隙，则其可使用。在一些实施方式中，改变由电压脉冲，电压渐变，光脉冲，或机械力脉冲所导致。改变可还被定义为阻拦构建体的解离。改变可还被定义为阻拦构建体的构象变化。一些方法可还包括随着其进入开口变化修饰的分析物速度或通过调整第I或第2导电液体介质的PH来改变测序灵敏度。一些方法可还包括随着其进入开口变化修饰的分析物速度或通过调整第I或第2导电液体介质的离子强度来改变测序灵敏度。一些方法可还包括随着其进入开口变化修饰的分析物速度或通过调整第I或第2导电液体介质的离子类型来改变测序灵敏度。一些方法可还包括随着其进入开口变化修饰的分析物速度或通过调整第I或第2导电液体介质的温度来改变测序灵敏度。一些方法可还包括随着其进入开口变化修饰的分析物速度或通过调整第I或第2导电液体介质的粘度来改变测序灵敏度。一些方法可还包括随着其进入开口变化修饰的分析物速度或通过采用双链-结合剂来改 变测序灵敏度。一些实施方式还包含获得修饰的分析物。纳米孔可包含固态材料，诸如氮化硅，修饰的氮化硅，硅，氧化硅，或石墨烯或其组合。在一些实施方式中，纳米孔是在插入双层，膜，薄膜，或固态孔后形成隧道的蛋白。在一些实施方式中，纳米孔包含在脂质双层中。在一些实施方式中，纳米孔包含在包含分枝菌酸的人工膜中。纳米孔可为具有定义隧道的前庭和收缩区域的耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)孔蛋白(Msp)孔蛋白。Msp孔蛋白可为突变MspA孔蛋白。在一些实施方式中，突变MspA孔蛋白的第90，91和93位的氨基酸各用天冬酰胺取代。一些实施方式可包含通过移出，添加或取代Msp孔蛋白的至少一个氨基酸来改变修饰的分析物速度或测序灵敏度。纳米孔可为α-溶血素或其变体。一些实施方式可包含通过移出，添加或取代a -溶血素或其变体的至少一个氨基酸来改变修饰的分析物速度或测序灵敏度。也提供的是对核酸的2个或更多核苷酸进行测序的方法，其包括(a)提供包含至少2个各定义为Xn的未知的核苷酸或未知的重复核苷酸组的核酸，其中n=l 1，000，000,且其中各X和各η可相同或不同；将第I插入物阻拦构建体和第2插入物阻拦构建体放入核酸，各包含双链核酸和各与Xn相邻，以提供修饰的核酸；(c)提供在包含第I导电液体介质和修饰的核酸的顺式侧和包含第2导电液体介质的反式侧之间定位的突变MspA孔蛋白；(d)使第I插入物阻拦构建体在进入突变MspA孔蛋白的隧道后中止修饰的核酸，由此产生第I离子电流水平，其中第I离子电流水平代表第IXn ;(e)改变第I插入物阻拦构建体，所述改变允许修饰的核酸向反式侧前进；(f)使修饰的核酸的第2插入物阻拦构建体在进入开口后中止，由此产生代表第2Xn的第2离子电流水平；及化)将第I离子电流水平和第2离子电流水平与已知的Xn的离子电流水平进行比较，由此对核酸的2个或更多核苷酸进行测序。在一些实施方式中，一个插入物阻拦构建体中止修饰的核酸以允许离子电流水平测定核苷酸的同一性，和另一插入物阻拦构建体中止修饰的核酸以产生不同于任何核苷酸-特异性离子电流水平及定义为分隔物水平的离子电流水平。在一些实施方式中，分隔物水平区别核酸的连续核苷酸。在一些实施方式中，分隔物水平区别核酸的连续及重复的核苷酸。在一些实施方式中，周期性地设计分隔物水平以产生不同离子电流水平以提供检查和。任选地，至少2个分隔物水平用于提供二进制码以代表分析物单元。任选地，至少一个分隔物水平提供校验位。还提供的是将离子电流水平与已知的分析物单元关联的方法，其包括(a)提供在包含第I导电液体介质和用2个或更多阻拦构建体修饰且含有全部已知的目标单元的分析物的顺式侧和包含第2导电液体介质的反式侧之间定位的纳米孔，其中纳米孔包含提供顺式侧和反式侧之间的液体交通的开口 ；(b)使修饰的分析物的第I阻拦构建体在进入开口后中止修饰的分析物，由此产生离子电流水平，其中离子电流水平代表第I已知的分析物单元；(c)改变修饰的分析物的第I阻拦构建体，所述改变允许修饰的分析物向反式侧前进；(d)使修饰的分析物的第2阻拦构建体在进入开口后中止修饰的分析物，由此产生代表第2单元的第2离子电流水平 '及(e)用含有全部单元及对应目标离子电流水平的已知的修饰的分析物校准纳米孔和任选地获得分隔物水平，由此将各离子电流水平与已知的分析物单元关联。可重复此或任何其他方法，以通过使用第3，第4，第5，等，阻拦构建体来对修饰的分析物的第3，第4，第5，等，已知的单元进行测序。在一些实施方式中，各阻拦构建体相同，及在一些实施方式中，各阻拦构建体不同。 还提供的是减缓或促进修饰的分析物通过纳米孔的开口转位的速度的方法，其包括Ca)提供在包含第I导电液体介质和修饰的分析物的顺式侧和包含第2导电液体介质的反式侧之间定位的纳米孔；(b)使修饰的分析物的阻拦构建体在进入开口后中止修饰的分析物，由此产生一个或更多离子电流水平，其中各离子电流水平是可区分的；及((3)改变至少修饰的分析物的第I阻拦构建体，所述改变允许修饰的分析物向反式侧前进；其中修饰的分析物具有小于分析物在修饰和改变的缺失下通过隧道转位的平均转位速度的经开口平均转位速度。也在本文提供系统，诸如包含具有开口的纳米孔的系统，其中纳米孔定位在第I导电液体介质和第2导电液体介质之间，其中至少一个液体介质包含修饰的分析物，诸如修饰的核酸。在一些实施方式中，修饰的核酸还被定义为修饰的DNA，且修饰的DNA的各阻拦构建体是含有相同的数的核苷酸的双链DNA，且各双链DNA相同。在一些实施方式中，系统运作以使修饰的核酸的阻拦复合物在进入开口后解离。系统可运作以对修饰的核酸进行测序。包含在系统中的纳米孔可包含在双层，膜，薄膜，或固态孔中。在一些实施方式中，纳米孔还被定义为耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)孔蛋白(Msp)孔蛋白或a -溶血素或其变体。系统可还包含膜片钳放大器，光学膜片钳，数据获取装置，或一个或更多与第I液体介质，第2液体介质，或其任何组合交通的温度调控装置。关于光学膜片钳，电流可翻译为荧光，其可读取及以类似样式作为电流关联。可制备系统以允许在多个纳米孔，诸如数千或数百万个纳米孔中并行读数。因此，任何系统的组分可功能性地重复，以倍增测序通量。任何系统也可与微流体学或自动化适应。在一些实施方式中，用于分析物单元的离子电流水平，虽然必需彼此不同，不必需先验已知。由于电流水平可每个实验不同，可首先运行校准构建体。例如为DNA测序，会运行构建体修饰的分析物，其含有全部4种核苷酸和任选地非标准(修饰的)核苷酸，诸如甲基化的C (mC)。使用本文公开的方法，各修饰的分析物单元产生独特及鉴定的电流水平(例如，各离子电流水平的幅度或特征对于各分析物单元类型是独特的)。维持各该电流水平，直到修饰的分析物前进一个单元。分析物的序列是直接标位进离子电流记录。在一些实施方式中，双链核酸可暴露于第I酶，其在一条核酸链的每nth核苷酸的位置选择性地切口，以暴露另一链的每nth核苷酸，以影响离子电流。得到的核酸可被认为是具有多个双链体的修饰的核酸，其中各双链体被认为是阻拦构建体。可导致双链体，以在进入纳米孔的开口后中止，以产生离子电流水平，其中各离子电流水平代表暴露的核苷酸。双链体可然后被解离以提供改变的核酸，其然后可通过开口前进，直到下一双链体中止移动，以允许待检测的另一离子电流水平与下一单元相关。各离子电流水平可然后与已知的核苷酸的已知的离子电流水平比较，而已知的双链终止，由此测序每nth核苷酸。与第I双链核酸具有同一性的第2双链核酸可然后暴露于第2 (或相同的)酶，其选择性地在每nth核苷酸的位置切口，以暴露每nth核苷酸，但具有不同起始位置(nth+i，其中i是恒定偏移)。可对第2核酸执行如上相同的过程。此过程可根据需要用至少η切口的核酸(及可能η/2切口的核酸，由于也可鉴定终止的碱基对)重复，使得各核苷酸测序。
"分析物"指称具有2个或更多单元的序列的分子，其中各单元可相同或不同。分析物单元的尺寸是可通过纳米孔的开口转位，使得单元进入开口的一侧及移动通过及移动出另一侧。一般而言，分析物在与纳米孔接触的至少一个导电液体介质中是可溶性的或部分可溶性的。非限制性例包括核酸，肽和蛋白，以及各种烃聚合物(例如，聚乙烯，聚苯乙烯)及官能化的烃聚合物，其中聚合物主链包含碳链(例如，聚氯乙烯，聚甲基丙烯酸酯)。单元可为单一部分(例如，单核苷酸，Τ)或其可为是重复子或改变的多部分(例如，TTT三核苷酸或TGC三核苷酸)。在一些实施方式中，分析物是具有I 1，000，000个核苷酸长的单元的核酸。分析物也包括聚合物，诸如共聚物，嵌段共聚物及分支的聚合物诸如星状聚体和树状聚体。分析物可包含纳米粒子。可在本文实施方式中采用分析物的混合物。分析物可由阻拦构建体修饰，以产生以下描述的"修饰的分析物”。修饰的分析物可改变，如下文所述。"阻拦构建体"是用来修饰分析物，使得修饰的分析物不再通过纳米孔的开口拟合的实体。由于阻拦构建体的一种或更多性质(例如，取向，尺寸或电荷)，阻拦构建体导致转位期间修饰的分析物在纳米孔的开口中中止。阻拦构建体可将插入一个或更多分析物单元之间("插入物阻拦构建体")或可用于修饰单元本身("悬吊物阻拦构建体")。由此，阻拦构建体可位于待测序的单元的相邻处，或其可盖(即，掩罩)所述单元，如下所述。阻拦构建体也可取代单元，其中阻拦构建体与单元关联。阻拦构建体可为单分子或分子组合(例如，双链DNA)。阻拦构建体可为蛋白。阻拦构建体可包含纳米粒子。如本文所用，"纳米粒子"指称具有一个或更多IOOnm或更小量级的尺度的粒子。另外的阻拦构建体在以下描述。阻拦构建体也能被改变，或改变纳米孔的开口，或两者，使得转位持续前进修饰的分析物一个单元。改变可由各种手段发生。在一些实施方式中，改变通过施加刺激诸如电压(例如，电压脉冲或电压渐变)，辐射(例如，光脉冲)，温度变化(例如，温度脉冲)或物理运动(例如，超声波，使用磁珠以产生力脉冲)来诱导。在一些实施方式中，改变使承担阻拦构建体的部分或全部的解离，诸如双链核酸的一条链的解离。改变可使承担构象变化，诸如形状或取向的变化。构象变化可使承担手性反转。作为构象变化的一例，阻拦构建体可为施加刺激后变化形状的蛋白。改变可使承担取向变化，诸如由阻拦构建体的辐射导致的取向变化。阻拦构建体可导致纳米孔的开口形状或电荷的变化。相反，由纳米孔的开口提供的力可导致阻拦构建体的改变，诸如尺寸的变化。阻拦构建体也可涉及这些方面的任何组合(例如，阻拦构建体可变化形状，如其也变化开口形状；由纳米孔的开口提供的力可导致阻拦构建体的形状和取向的变化)。插入物阻拦构建体位于与单元相邻处，及由可自彼此解离或另外改变的配对的部分组成。插入物阻拦构建体导致修饰的分析物在开口中中止，由此允许待检测的离子电流水平与相邻单元相关。在已检测离子电流水平之后，插入物阻拦构建体的改变导致变化(例如，配对之一解离)，使得修饰的分析物的残留物可向反式侧前进。下一阻拦构建体的改变允许可检测的下一离子电流水平的产生，等等。插入物阻拦构建体可由可解离的结合对组成。结合对具有对于彼此的亲和性。是结合对的插入物阻拦构建体的非限制性例包括核酸，诸如双链核酸(例如，双链DNA)，可将其插入分析物单元，诸如核苷酸单元之间，以产生修饰的分析物。双链核酸可导致修饰的分析物由于双链体的尺寸而在纳米孔的开口中中止，其后解离导致双链体的一条链解离，使得修饰的分析物的残留物可向反式侧前进。双链核酸可，在一些实施方式中，含有I IOObp0插入物阻拦构建体可为与I-IOObp双链核酸约相同的长度。可采用的其他已知的结合对包括单链DNA结合蛋白，RNA，PNA和RNA，PNA和DNA的组合。在一些实施方式中，一个或更多核苷酸形成插入物阻拦构建体。例如，可将一个或更多核苷酸插入分析物单元之间，以提供修饰的分析物，及液体介质中包含的与修饰的分析物接触的游离的核苷酸可与核苷酸原位结合，然后解离。在一些实施方式中，作为插入物阻拦构建体可采用介电弹性体，光学机械材料或温度-响应聚合物。这些类为本领域熟知。见，例如，美国专利No. 7，594，359和7，625，764，各通过引用以其整体并入本文，及J Mech Physics Solids 57:1103 (2009)。除了结合对之外，也可采用由光解键接合的分子，使得辐射自另一分子光切割一个分子。该光解键为本领域熟知。非限制性例包括补骨脂素和衍生物，DNA-测序策略中使用的光切割性染料，化合物I-(4，5-二甲氧基-2-硝基-苯基)乙基酯(Photochem Photobio81:953 (2005))，及光敏氨基酸，诸如L-光-亮氨酸。其他插入物阻拦构建体包括肽，蛋白，纳米粒子和聚电解质(例如，硫酸葡聚糖和聚(丙烯酸))。悬吊物阻拦构建体涵盖单元及由可如上述改变的悬吊部分组成。悬吊物阻拦构建体一般修饰连续单元。悬吊物阻拦构建体导致修饰的分析物在纳米孔的开口中中止。在悬吊物阻拦构建体改变之后，之前被悬吊物阻拦构建体覆盖的单元变得暴露。因为另一悬吊物阻拦构建体位于与现在-暴露的单元相邻处，现在-暴露的单元在开口中止，使得离子电流水平可检测。下一悬吊物阻拦构建体的改变允许产生可检测的下一离子电流水平，等等。悬吊物阻拦构建体的非限制性例包括与上述插入物阻拦构建体相同的例和类的构建体。例如，悬吊物阻拦构建体可，与分析物单元一起，形成结合对。悬吊物阻拦构建体可，与分析物单元一起，构成介电弹性体，光学机械材料或温度-响应聚合物。悬吊物阻拦构建体可由光解键与单元接合。悬吊物阻拦构建体可包含肽，蛋白，纳米粒子或聚电解质。在一些实施方式中，核苷酸是悬吊物阻拦构建体。例如，在液体介质中包含的与分析物接触的游离的核苷酸可与核苷酸单元原位结合，然后解离。用阻拦构建体修饰的分析物提供"修饰的分析物"。修饰的分析物由于阻拦构建体的性质(例如，取向，尺寸或电荷)而不随通过纳米孔的开口转位前进，除非修饰的分析物改变。而修饰的分析物一般会包含插入物阻拦构建体或悬吊物阻拦构建体，修饰的分析物也可包含两种类型。各插入物阻拦构建体可在相同的修饰的分析物之内相同或不同。各悬吊物阻拦构建体可在相同的修饰的分析物之内相同或不同。修饰的分析物可以各种方式获得，包括获得分析物及要求商业实体制备修饰的分析物。DNA修饰方案起初开发以希望对自由地转位的扩展进许多相同的类型的核苷酸以产生足够长电流标记的DNA测序。此修饰一般使用DNA限制和连接酶的循环应用来实现。Meller等人假定了用由2个12聚体寡聚体组成的转变为特定二进制码的各核苷酸使用该DNA修饰方案的光学-纳米孔测序策略("New High Throughput Technologies for DNASequencing and Genomics, " ed K. Mitchelson (Elsevier, Oxford, UK), pp 245264;ClinChem 53:1996(2007) ;Nano Lett. 10:2237 (2010))。自动化的，大规模-并行过程(见美国专利No. 6，723，513和WO 2006/092582,各通过引用以其整体并入本文)需要 24h用于将完全 人基因组转变为由片段，各对应于原基因组的24bp段组成的DNA混合物(Nat Biotechnol26:1146 (2008))。例如，LingVitae Corp. (Oslo,挪威)可制备具有是选择的双链核酸的插入物阻拦构建体的修饰的核酸。DI测序需要的DNA转变是欠需求的，因为各插入的DNA可相同和独立于分析物核苷酸。相比之前建议的涉及转变的DNA的测序方法，DI测序不需要另外的硬件诸如荧光检测或转变为二进制码。工作目前在进行中以开发用减少的转变时间的原基因组的长段的廉价，低-误差转变(Nano Lett 10:2237(2010))。相比依赖于连接反应的通过连接技术的测序，通过大量并行化可达到转变成本和速度进一步减小。接头可将阻拦构建体接合于分析物以提供修饰的分析物。一般而言，接头是无特定活性的二价分子，而非将阻拦构建体接合于分析物或保存该物种之间的一些最小距离或其他空间关系。但是，可选择接头，以影响连接的物种的一些性质，诸如3-维构象，净电荷，或疏水性。适合的接头为本领域所知，及包括在阻拦构建体和分析物之间形成键的接头，所述键选自共价键(例如，二硫化物或碳-碳键)，氢键(例如，Watson-Crick或Hoogstein碱基配对)，离子键或其他静电诱导的键。"纳米孔"指称具有其最窄点具有约O.3nm 约2nm的直径的开口的孔隙。例如，纳米孔可为固态纳米孔，石墨烯纳米孔，弹性体纳米孔，或可为在插入双层，薄膜，膜(例如，本文公开的膜)，或固态孔后形成隧道的天然存在的或重组蛋白，也在本文称之为蛋白孔或蛋白纳米孔(例如，跨膜孔隙)。如果蛋白插入膜，则蛋白是隧通-形成蛋白。测定是否蛋白是隧通-形成蛋白的方法为本领域熟知。例如，可通过测定是否蛋白插入双层来测定是否Msp孔蛋白形成隧道，诸如描述于美国临时申请系列No. 61/098, 938和其相关的PCT申请，W02010/034018，各通过引用以其整体并入本文，及 Proc Natl Acad Scil05:20647(2008)。一般而言，隧通形成通过观察导电性的离散变化来检测。见，例如，Mol Microbiol 33:933(1999)。开口是一般处于与膜或纳米孔的顺式和反式侧液体或气体交通。纳米孔可包含固态材料，诸如氮化硅，修饰的氮化硅，硅，氧化硅，或石墨烯或其组合(例如，纳米孔可通过制造弟ISiN孔来制备，将石墨稀片材放到其上，然后在石墨稀中制造纳米孔)。蛋白纳米孔的非限制性例包括α -溶血素和其变体(以下定义的)，耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)孔蛋白(Msp)孔蛋白(以下定义的)或OmpATb。"改变允许修饰的分析物向反式侧前进"一此短语指称修饰的分析物的阻拦构建体的改变允许修饰的分析物向反式侧前进的作用，使得(a )修饰的分析物的整个残留物可通过开口转位，如果无进一步阻拦构建体中止转位，或(b)另一阻拦构建体迎对开口及导致被改变，由此允许另一修饰的分析物单元产生离子电流水平。由于修饰的分析物与纳米孔的开口相互作用，通过开口的电流变化。当阻拦的构建体暂时防止修饰的分析物单元免于通过开口转位，离子电流水平产生。即，离子电流水平关联于，或代表，分析物单元。对于具有双链DNA阻拦构建体的DNA分析物，用Ml-NNN-MspA分析的，本文所述的简单分析揭示了被2pA分离的平均电流水平及延续大于I. 5ms可鉴定分析物单元DNA序列。本领域技术人员能建立其他分析物单元的离子电流水平。离子电流水平一般是平均离子电流。在一些实施方式中，通过孔隙的离子电流幅度可转化为荧光光学系统，如本领域熟知。见，例如，J Amer Chem Soc 13:1652 (2009)。当一个阻拦构建体中止修饰的分析物以允许离子电流水平测定单元的同一性，和 另一阻拦构建体中止修饰的分析物以产生不同于任何单元-特异性离子电流水平的离子电流水平时，后来的离子电流水平定义为分隔物水平。分隔物水平可区别分析物的连续单元。分隔物水平区别分析物的连续及重复的单元。可设计分隔物水平以产生不同离子电流水平以提供检查和。任选地，至少2个分隔物水平用于提供二进制码以代表分析物单元。任选地，至少一个分隔物水平用于提供构成基本上校验位。转位起始尾是可随附于修饰的分析物以起始通过纳米孔的开口转位的任何线性荷电的聚合物。由此，尾直径必需相比开口更小。尾可位于修饰的分析物的任一端或两端。尾的非限制性例包括多核苷酸诸如单链DNA。其他尾包括杂多聚体，同多聚体，碱性和/或碱性残基的核酸(例如，DNA或RNA)。在一些实施方式中，尾是聚腺嘌呤，诸如聚-dAm，其中m在1-100的范围[SEQ ID N0:53]。尾可包含聚(丙烯酸)。其他聚(酸)可包括酸基-C00H，-SO3H或-PO3H2。尾也可包括荷电的聚-L赖氨酸或其他荷电的氨基酸。双链体结合剂用于增强双链核酸的形成。该试剂增加产生成功的双链体的频度，其，当双链体用作阻拦构建体时，可改善测序灵敏度。非限制例包括二价阳离子诸如Mg2+，主要和少数DNA凹槽结合蛋白和化学品，链间DNA交联剂，及DNA嵌入剂。"液体介质"包括水性，有机-水性和仅有机液体介质。有机介质包括，例如，甲醇，乙醇，二甲基亚砜和其混合物。在本文所述的方法中可采用的液体为本领域熟知。该介质，包括导电液体介质的描述和例提供于美国专利No. 7，189，503，例如，通过引用以其整体并入本文。可将盐,去污剂或缓冲剂加入该介质。可采用该剂来改变液体介质的pH或离子强度。粘度-改变物质，诸如甘油或其各种聚合物(例如，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙二醇，聚乙烯基醇，纤维素聚合物)和混合物，可包括在液体介质中。测量粘度的方法为本领域熟知。可加入液体介质的任何剂也可变化待研究的修饰的分析物的速度。如此，速度-改变剂可为盐，去污剂，缓冲剂，粘度-改变物质，或添加到液体介质的增加或降低分析物或修饰的分析物的速度的任何其他剂。任何实施方式中采用的第I和第2液体介质可相同或不同，及任意者或两者可包含一种或更多盐，去污剂，或缓冲剂。的确，本文所述的任何液体介质可包含一种或更多盐，去污剂，或缓冲剂。任选地，至少一个液体介质是导电的。任选地，至少一个液体介质不是导电的。液体介质可包含本文所述的任何分析物。如本文所用，"氨基酸"指称见于蛋白的20种天然存在的氨基酸的任何，天然存在的氨基酸的D-立体异构体(例如，D-苏氨酸)，非天然的氨基酸，及化学修饰的氨基酸。氨基酸的各这些类型不是相互排他的。α-氨基酸包含氨基，羧基，氢原子，及称之为"侧链"的特征性的基团所键合的碳原子。天然存在的氨基酸的侧链为本领域熟知及包括，例如，氢(例如，如在甘氨酸)，烷基(例如，如在丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸)，取代的烷基(例如，如在苏氨酸，丝氨酸，甲硫氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，谷氨酰胺，精氨酸和赖氨酸)，芳基烷基(例如，如在苯丙氨酸和色氨酸)，取代的芳基烷基(例如，如在酪氨酸)，及杂芳基烷基(例如，如在组氨酸)。以下缩写用于20种天然存在的氨基酸丙氨酸(Ala;A)，天冬酰胺(Asn;N)，天冬 氨酸(Asp;D)，精氨酸(Arg;R)，半胱氨酸(Cys;C)，谷氨酸(Glu;E)，谷氨酰胺(Gln;Q)，甘氨酸(Gly;G)，组氨酸(His;H)，异亮氨酸(116;1)，亮氨酸(1^11丄)，赖氨酸(1^8;10，甲硫氨酸(Met;M),苯丙氨酸(Phe;F)，月甫氨酸(Pro;P)，丝氨酸(Ser; S)，苏氨酸(Thr;T),色氨酸(Trp; W),酪氨酸(Tyr; Y),及纟颜氨酸(Val; V)。 非天然的氨基酸(S卩，不天然地见于蛋白的那些)也为本领域熟知，如见于，例如，Mol Cell Biol 9:2574 (1989)；J Amer Chem Socll2:4011-4030 (1990)；J Amer Chem Soc56:1280-1283 (1991)；JAmer Chem Soc 113:9276-9286 (1991);及该文引用的全部参考文献。及Y-氨基酸为本领域所知及也涵盖在本文为非天然的氨基酸。以下表显示在本文涵盖的非天然的氨基酸的非限制性例。表I.例示非天然的氨基酸
氨基酸rrnM氨基酸
Aad2-氨基己二酸EtAsnN-乙基天冬酰胺
Baad 3-氨基己二酸H^l轻基赖氨酸
Bala P-丙氨酸，P-氨基-丙酸Mil别-羟基赖氨酸
Ib^2-氨基丁酸3-羟脯氨酸
4Abu 4-氨基丁酸，哌啶酸4H^4-羟脯氨酸
6-氨基己酸Id^异锁链素
2-氨基庚酸别-异亮氨酸
Hb2-氨基异丁酸N-甲基甘氨酸，肌氨酸
Baib 3-氨基异丁酸MeIleN-甲基异亮氨酸
Apm2-氨基庚二酸MeLys6N-甲基赖氨酸
权利要求
1.对2个或更多用至少第I阻拦构建体和第2阻拦构建体修饰的分析物単元进行测序的方法，其包括 (a)提供在包含第I导电液体介质和修饰的分析物的顺式侧和包含第2导电液体介质的反式侧之间定位的纳米孔，其中纳米孔包含提供顺式侧和反式侧之间的液体交通的开Π ； (b)使修饰的分析物的第I阻拦构建体在进入开ロ后中止修饰的分析物，由此产生第I离子电流水平，其中第I离子电流水平代表第I単元； (c)改变修饰的分析物的第I阻拦构建体，所述改变允许修饰的分析物向反式侧前进； Cd)使修饰的分析物的第2阻拦构建体在进入开ロ后中止修饰的分析物，由此产生代表第2単元的第2离子电流水平；以及(e)将第I离子电流水平和第2离子电流水平与已知的单元的已知的离子电流水平进行比较，由此对2个或更多分析物単元进行测序。
2.权利要求I的方法，其中修饰的分析物包含修饰的核酸，修饰的肽或修饰的蛋白。
3.权利要求2的方法，其中修饰的分析物包含修饰的核酸。
4.权利要求3的方法，其中修饰的核酸包含修饰的DNA，修饰的RNA，修饰的PNA或其组ムロ ο
5.权利要求I的方法，其中修饰的分析物包含使分析物与阻拦构建体接合的接头。
6.权利要求5的方法，其中修饰的分析物还被定义为包含使核酸与阻拦构建体接合的接头的修饰的核酸。
7.权利要求I的方法，其中修饰的分析物包含具有IMDa或更小分子量的无机部分。
8.权利要求I的方法，其中修饰的分析物包含具有IMDa或更小分子量的有机部分。
9.权利要求I的方法，其中至少ー个阻拦构建体是插入物阻拦构建体。
10.权利要求9的方法，其中插入物阻拦构建体是双链核酸。
11.权利要求I的方法，其中至少ー个阻拦构建体是悬吊物阻拦构建体。
12.权利要求I的方法，其中各阻拦构建体相同。
13.权利要求I的方法，其中2个或更多阻拦构建体不同。
14.权利要求I的方法，其中修饰的分析物包含转位起始尾。
15.权利要求I的方法，其中修饰的分析物是用至少2个各还被定义为双链DNA的插入物阻拦构建体修饰的ssDNA，且其中各单元是单核苷酸或重复核苷酸。
16.权利要求I的方法，其中 第I阻拦构建体中止修饰的分析物以允许离子电流水平测定单元的同一性，和任选地与第I阻拦构建体连续的第2阻拦构建体中止修饰的分析物以产生不同于任何単元-特异性离子电流水平及定义为分隔物水平的离子电流水平。
17.权利要求16的方法，其中分隔物水平区别分析物的连续单元。
18.权利要求17的方法，其中分隔物水平区别分析物的连续及重复的单元。
19.权利要求16的方法，其中周期性地设计分隔物水平以产生不同离子电流水平以提供检查和。
20.权利要求16的方法，其中至少2个分隔物水平用于提供ニ进制码以代表分析物单元。
21.权利要求20的方法，其中至少ー个分隔物水平提供校验位。
22.权利要求I的方法，其中当对ー个或更多修饰的分析物测序多次时测序保真度改善，以产生允许平均及共有读数的多个电流图案。
23.权利要求I的方法，其中电场的施加导致修饰的分析物进入开ロ。
24.权利要求I的方法，其中物理压カ导致修饰的分析物进入开ロ。
25.权利要求I的方法，其中磁珠附接于反式侧上的修饰的分析物，及改变由导致修饰的分析物移动通过开ロ的磁力所导致。
26.权利要求I的方法，其中改变由电压脉冲，电压渐变，光脉冲，或机械カ脉冲所导致。
27.权利要求I的方法，其中改变还被定义为阻拦构建体的解离。
28.权利要求I的方法，其中改变还被定义为阻拦构建体的构象变化。
29.权利要求I的方法，其还包括通过调整第I或第2导电液体介质的pH来改变修饰的分析物速度或测序灵敏度。
30.权利要求I的方法，其还包括通过调整第I或第2导电液体介质的离子強度来改变修饰的分析物速度或测序灵敏度。
31.权利要求I的方法，其还包括通过调整第I或第2导电液体介质的离子类型来改变修饰的分析物速度或测序灵敏度。
32.权利要求I的方法，其还包括通过调整第I或第2导电液体介质的温度来改变修饰的分析物速度或测序灵敏度。
33.权利要求I的方法，其还包括通过调整第I或第2导电液体介质的粘度来改变修饰的分析物速度或测序灵敏度。
34.权利要求I的方法，其还包括通过采用双链-结合剂来改变修饰的分析物速度或测序灵敏度。
35.权利要求I的方法，其还包括获得修饰的分析物。
36.权利要求I的方法，其中纳米孔包含固态材料。
37.权利要求36的方法，其中固态材料还被定义为氮化硅，修饰的氮化硅，硅，氧化硅，或石墨烯或其组合。
38.权利要求I的方法，其中纳米孔是在插入双层，膜，薄膜，或固态孔后形成隧道的蛋白。
39.权利要求I的方法，其中纳米孔包含在脂质双层中。
40.权利要求38的方法，其中纳米孔包含在包含分枝菌酸的人工膜中。
41.权利要求38的方法，其中纳米孔是具有定义隧道的前庭和收缩区域的耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)孔蛋白(Msp)孔蛋白。
42.权利要求41的方法，其中Msp孔蛋白是突变MspA孔蛋白。
43.权利要求42的方法，其中突变MspA孔蛋白的第90，91和93位的氨基酸各用天冬酰胺取代。
44.权利要求41的方法，其还包括随着其进入开ロ改变修饰的分析物速度或通过移出，添加或取代Msp孔蛋白的至少ー个氨基酸来改变测序灵敏度。
45.权利要求38的方法，其中纳米孔是α-溶血素或其变体。
46.权利要求45的方法，其还包括随着其进入开ロ改变修饰的分析物速度或通过移出，添加或取代α-溶血素或其变体的至少ー个氨基酸来改变测序灵敏度。
47.对核酸的2个或更多核苷酸进行测序的方法，其包括 (a)提供包含至少2个各定义为Xn的未知的核苷酸或未知的重复核苷酸组的核酸，其中n=l 1，000，000，且其中各X和各η可相同或不同； (b)将第I插入物阻拦构建体和第2插入物阻拦构建体放入核酸，各包含双链核酸和各与Xn相邻，以提供修饰的核酸； (c)提供在包含第I导电液体介质和修饰的核酸的顺式侧和包含第2导电液体介质的反式侧之间定位的突变MspA孔蛋白； Cd)使第I插入物阻拦构建体在进入突变MspA孔蛋白的隧道后中止修饰的核酸，由此产生第I离子电流水平，其中第I离子电流水平代表第IXn ； Ce)改变第I插入物阻拦构建体，所述改变允许修饰的核酸向反式侧前进； (f)使修饰的核酸的第2插入物阻拦构建体在进入开ロ后中止，由此产生代表第2Xn的第2离子电流水平；以及 (g)将第I离子电流水平和第2离子电流水平与已知的Xn的离子电流水平进行比较，由此对核酸的2个或更多核苷酸进行测序。
48.权利要求47的方法，其中 第I插入物阻拦构建体中止修饰的核酸以允许离子电流水平測定核苷酸的同一性，和任选地与第I插入物阻拦构建体连续的第2插入物阻拦构建体中止修饰的核酸以产生不同于任何核苷酸-特异性离子电流水平及定义为分隔物水平的离子电流水平。
49.权利要求48的方法，其中分隔物水平区别核酸的连续核苷酸。
50.权利要求49的方法，其中分隔物水平区别核酸的连续及重复的核苷酸。
51.权利要求48的方法，其中周期性地设计分隔物水平以产生不同离子电流水平以提供检查和。
52.权利要求48的方法，其中至少2个分隔物水平用于提供ニ进制码以代表分析物单J Li ο
53.权利要求48的方法，其中至少ー个分隔物水平提供校验位。
54.将离子电流水平与已知的分析物单元关联的方法，其包括 Ca)提供在包含第I导电液体介质和用2个或更多阻拦构建体修饰且含有全部已知的目标单元的分析物的顺式侧和包含第2导电液体介质的反式侧之间定位的纳米孔，其中纳米孔包含提供顺式侧和反式侧之间的液体交通的开ロ； (b)使修饰的分析物的第I阻拦构建体在进入开ロ后中止修饰的分析物，由此产生离子电流水平，其中离子电流水平代表第I已知的分析物単元； (c)改变修饰的分析物的第I阻拦构建体，所述改变允许修饰的分析物向反式侧前进； Cd)使修饰的分析物的第2阻拦构建体在进入开ロ后中止修饰的分析物，由此产生代表第2単元的第2离子电流水平；以及 (e)用含有全部単元及对应目标离子电流水平的已知的修饰的分析物校准纳米孔和任选地获得分隔物水平， 由此将各离子电流水平与已知的分析物单元关联。
55.减缓或促进修饰的分析物通过纳米孔的开ロ转位的速度的方法，其包括 (a)提供在包含第I导电液体介质和修饰的分析物的顺式侧和包含第2导电液体介质的反式侧之间定位的纳米孔； (b)使修饰的分析物的阻拦构建体在进入开ロ后中止修饰的分析物，由此产生ー个或更多离子电流水平，其中各离子电流水平是可区分的；以及 (C)改变至少修饰的分析物的第I阻拦构建体，所述改变允许修饰的分析物向反式侧前进； 其中修饰的分析物具有小于分析物在修饰和改变的缺失下通过隧道转位的平均转位速度的经开ロ平均转位速度。
56.系统，其包含具有开ロ的纳米孔，其中纳米孔定位在第I导电液体介质和第2导电液体介质之间，其中至少ー个液体介质包含定义为修饰的核酸的修饰的分析物。
57.权利要求56的系统，其中修饰的核酸还被定义为修饰的DNA，且修饰的DNA的各阻拦构建体是含有相同的数的核苷酸的双链DNA，且各双链DNA相同。
58.权利要求56的系统，其中系统运作以使修饰的核酸的阻拦复合物在进入开ロ后解离。
59.权利要求56的系统，其中系统运作以对修饰的核酸进行测序。
60.权利要求56的系统，其中纳米孔包含在双层中。
61.权利要求56的系统，其中纳米孔还被定义为耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)孔蛋白(Msp)孔蛋白或α -溶血素或其变体。
62.权利要求56的系统，其还包含膜片钳放大器，光学膜片钳，数据获取装置，或ー个或更多与第I液体介质，第2液体介质，或其任何组合交通的温度调控装置。
63.权利要求56的系统，其中功能性地重复系统组分以倍增测序通量。
64.权利要求56的系统,其中系统与微流体学或自动化适应。
全文摘要
本文提供属于使用纳米孔测序分析物单元的方法和系统。一般而言，阻拦构建体用于修饰分析物使得修饰的分析物在纳米孔的开口中中止。该中止期间，获得对应于分析物单元的离子电流水平。在改变修饰的分析物使得修饰的分析物通过开口前进之后，另一阻拦构建体再次中止分析物，允许获得代表第2分析物单元的第2离子电流水平。此过程可重复直到对各分析物单元测序。也公开实施该方法的系统。
文档编号B82Y15/00GK102834527SQ201180018449
公开日2012年12月19日 申请日期2011年2月23日 优先权日2010年2月23日
发明者J·H·古德拉彻, I·M·德灵顿, M·D·科林斯 申请人:华盛顿大学