一种检测毒死蜱农药残留的酶传感器制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种检测毒死蜱农药残留的酶传感器制备方法，属于生物传感器制备领域。本发明第一步为多壁碳-二氧化锡-壳聚糖纳米复合材料及0.5%Nafion溶液的制备：以多壁碳、二氧化锡、壳聚糖为原料，利用多壁碳-二氧化锡-壳聚糖复合材料的良好电化学氧化还原活性、好的生物相溶性以及高度的化学稳定性，修饰工作电极以促进电子转移；第二步为乙酰胆碱酯酶和多壁碳-二氧化锡-壳聚糖纳米复合膜共同修饰电极的酶传感器制备。本发明的乙酰胆碱酯酶生物传感器，检测时间较短，灵敏度高，选择性、稳定性好，再生能力好，回收率符合要求。
【专利说明】一种检测毒死蜱农药残留的酶传感器制备方法【技术领域】[0001]本发明提供一种检测毒死蜱农药残留的酶传感器制备方法，属于生物传感器制备 领域。【背景技术】[0002]近年来，农药残留引起的中毒事件屡屡发生，果蔬中的有害、剧毒农药的残留问题 一直是人们关注的焦点，也是现今中国加入WTO后，农产品出口遭遇“绿色壁垒”的主要影 响因素之一。随着我国人民生活水平不断提高，农产品的质量安全问题越来越受到关注，尤 其果品、蔬菜中农药残留问题已经成为公众关注的焦点。全国每年都有上百起因食用被农 药污染的农产品而引起的急性中毒事件，严重影响广大消费者的身体健康，因此由农药残 留超标导致的食品安全问题，已越来越受到各国政府和公众的重视。有机磷农药是我国应 用最为广泛的一类农药，其中毒死蜱是目前全世界生产和销售量最大的杀虫剂品种之一。 毒死蜱是高效中毒的广谱杀虫剂兼除草剂，具有一定的内吸性，可以通过食物链的富集作 用转移至人体，对人体具有潜在致癌作用。可见，加强对农产品中农药残留的检测对保护生 态环境，尤其是保障人类健康有着十分深远的意义，其中毒死蜱一直是环境和食品中农药 残留检测的重要项目。[0003]传统的农药残留检测方法主要有:气相色谱(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、色谱/ 质谱联用技术(GC/LC-MS)、毛细管电泳法(CE)、荧光分析、酶联免疫法(ELISA)。这些方法 虽然选择性好、灵敏度高、准确度高、检出限低，可同时检测多种元素或化合物，但其需要昂 贵的仪器设备，样品前处理过程繁琐、费时，并且对分析人员的技术水平要求很高，不适于 现场快速检测。常用的农药残留快速检测方法有酶抑制法(酶抑制试纸法和酶抑制分光光 度法)，可以实现有机磷农药的现场快速检测，具有较好的实用价值。但是，速测卡是通过肉 眼观察卡片的颜色变化，因此一般只能用于严重超标的蔬菜样品的定性测量。酶抑制分光 光度法的原理是基于吸光度的变化进行检测的，但蔬菜水果中大量的色素会影响检测结果 的准确度。并且上述方法存在回收率低、错检、漏检比例较高、重复性差、难以满足低残留和 定量检测的要求等缺点。酶传感器是利用有机磷的毒理性原理所研制的传感器，与传统的 分析方法相比，它具有特异性强、分析速度快、结构简单、成本低廉等优点。酶传感器的关键 是酶的固定技术，酶的固定技术包括酶的固定方法和固定酶的载体材料。其直接影响生物 分子的固定化、酶传感器的稳定性和灵敏度等主要性能。[0004]发明的目的在于提供一种能克服上述缺陷以及操作简单、灵敏度高、检出限高的 检测毒死蜱农药残留的酶传感器制备方法。[0005]其技术方案为:一种检测毒死蜱农药残留的酶传感器制备方法，其特征在于: 电流型酶传感器的敏感界面组成包括由多壁碳、二氧化锡、壳聚糖制备的纳米复合膜和0.5%Nafion保护膜，进而固定酶的技术。[0006]所述的一种检测毒死蜱农药残留的酶传感器制备方法，其特征在于:金电极 (d=lmm)的清洗，酶传感器敏感界面的构建及过程表征(制备多壁碳-二氧化锡纳米复合材料并以壳聚糖作为分散剂进行分散，利用多壁碳-二氧化锡的协同作用共同修饰电极)，酶 传感器标准曲线的建立，酶传感器性能的检测，酶传感器对实际样品的检测。[0007]所述的一种检测毒死蜱农药残留的酶传感器制备方法，其特征在于:实验条件的 优化，主要包括酶滴加量、测试底液的PH以及农药抑制时间；酶传感器性能检测包括重现 性、稳定性、再生性以及酶传感器对蔬菜样品回收率的测定。[0008]其制备原理为:以乙酰胆碱酯酶的催化性为基础的酶电化学传感器是将乙酰胆碱 酯酶固定在金电极表面，催化底物乙酰硫代胆碱(ATCl)水解，产生具有电活性的巯基胆碱， 巯基胆碱可在金电极表面发生氧化反应，产生的电信号可转化为电流，在一定条件下该电 流的大小可反映乙酰胆碱酯酶的活性。由于乙酰胆碱酯酶是一种以三个丝氨酸残基联体为 活性的酶，当其中的任何一个氨基酸残基遭到破坏时，将使酶丧失催化活性。有机磷农药与 乙酰胆碱酯酶作用能形成稳定的磷酰化胆碱酯酶而破坏其氨基酸残基结构，从而使乙酰胆 碱酯酶失去活性，降低催化乙酰硫代胆碱水解的能力。因此，在加入含有机磷农药的底物溶 液中，因部分酶活性被抑制导致其相应电流减小。通过比较酶被抑制前后的电流信号的大 小，可对有机磷农药进行定性检测。本发明采用以壳聚糖作为分散剂制备的多壁碳-二氧 化锡复合物和0.5%Naf ion溶液对金电极进行修饰。多壁碳纳米管(MWCNTs)拥有独特的电 化学特性、较高的化学稳定性和机械强度，被广泛用于酶传感器敏感界面的制作。壳聚糖 (CHIT)属于多糖类，它具有优异的成膜性、吸附性、透气性和渗透性，成膜后具有很好的吸 附性、稳定性和良好的生物相容性，其丰富的氨基、多孔性结构使它被广泛用于生物分子的 固定和修饰电极的制备。壳聚糖的氨基端连接二氧化锡，为酶在电极表面的固定提供了一 个良好的生物界面，保持了酶的生物活性以用来和农药进行抑制反应。此外，二氧化锡具有 较高的比表面积、稳定性和导电性可以增大电极表面电子的传导能力和生物相容性，进而 增大酶传感器的响应电流。采用本发明制成的电流型酶传感器可以在蔬果采收、上市前，进 行农药残留的快速测定，直接对农药残留量是否超标进行检测，避免因食用含有残留农药 的蔬果而引起中毒，为农产品安全生产与消费提供残留检测的技术支撑。[0009]为达到以上目的，采取以下技术方案实现:一种检测毒死蜱农药残留的酶传感器 制备方法，其特征在于:(1)酶传感器制备前裸金电极的清洗、活化和性能测试，如果测试 循环伏安曲线中的峰电位差在120mV以下，氧化峰和还原峰对称，则所述金电极可使用，否 则要重新返回清洗步骤中，直到符合要求。(2)清洗好的裸金电极表面滴涂分散均匀的多 壁碳-二氧化锡-壳聚糖复合液，继而修饰0.5%Nafion溶液，然后固定乙酰胆碱酯酶。酶 传感器制备结束后，放入冰箱里4°C保存备用。[0010]为达到以上目的，采取以下技术方案实现:一种检测毒死蜱农药残留的酶传感器 制备方法，其特征在于:(I)将上述制备好的酶传感器在工作底液中以不同的扫速做循环 伏安方法扫描，可以得到峰值和扫速的关系，得到是受扩散控制的。(2)配置一系列的毒死 蜱标准液，进行循环伏安扫描，得到抑制率，进一步得出上述制备的酶传感器的标准曲线、 检测范围和检测限；(3)配置一系列经常混合使用的农药溶液，以检测所制备酶传感器的 选择性；⑷通过循环伏安扫描多段验证上述酶传感器的稳定性；(5)对实际果蔬样品进行 分析得出该酶传感器的回收率。[0011]本发明以具有良好的生物相容性和成膜性的壳聚糖作为分散剂分散多壁碳和二 氧化锡所制备成的多壁碳-二氧化锡-壳聚糖纳米复合物膜能够促进电化学反应中电子的传递，提高电极上的响应电流，改善电极表面的微环境，因而可以作为载体材料，用以制备 响应信号强和灵敏度高的酶传感器；0.5%Nafion保护膜具有较高的稳定性和高度有序性， 提高了传感器表面酶的有效固定，从而增大了检测精度。[0012]所述酶传感器的制备工艺如下:(I)取2.5 μ L制备好的多壁碳-二氧化锡-壳聚 糖纳米复合膜滴涂在预处理好的金电极表面，常温下静置lh，用ΡΗ=7.5的PBS缓冲液冲洗 电极表面；(2)电极表面晾干后，取2.5μ L乙酰胆碱酯酶滴涂在电极表面，4°C下静置2h， 然后用PH=7.5的磷酸盐缓冲液冲洗表面，氮气吹干；(3)取2.5 μ L0.5%Nafion保护膜滴涂 在电极表面，常温下静置1.5h，然后用PH=7.5的PBS缓冲液冲洗表面，氮气吹干；(4)将上 述经纳米材料修饰好的电极沉浸在毒死蜱溶液中，常温下下浸泡14min，取出后用PBS缓冲 液冲洗表面，晾干待用。[0013]【专利附图】
【附图说明】附图1生物传感器修饰过程的循环伏安组装图。附图2生物传感器测试液pH值优化。附图3生物传感器测试抑制时间优化。【具体实施方式】[0014]实施例:(I)多壁碳-二氧化锡-壳聚糖纳米复合膜的制备:在50mL乙酸溶液中 加入0.1g壳聚糖制备成0.2%壳聚糖溶液。在4mL 0.2%壳聚糖溶液中加入Img 二氧化锡、 3mg多壁碳纳米管，25°C水中超声震荡30分钟，则多壁碳-二氧化锡-壳聚糖纳米复合膜 制备成功；(3)金电极的清洗:金电极修饰前，首先浸入热的“piranha”溶液(H2S04:30% H202 = 3:1)中浸泡15min，用水清洗干净，接下来用0.3ym、30nm的A1203浆在麂皮上 抛光至镜面，抛光后用蒸馏水洗去除表面污物，再移入超声水浴中清洗，每次5min，重复二 次，然后依次用6mol/L的HN03、无水乙醇和去离子水超声清洗，氮气环境下干燥。(4)金 电极的活化:彻底清洗后，电极在0.5mol/L H2S04溶液中用循环伏安法活化，扫描范围1.0V?-1.0V，反复扫描直至达到稳定的循环伏安图为止。(5)预处理好的金电极的测试: 在含有1X10-3 mol/L K3Fe(CN)6的0.20 mo I/L KN03溶液中跑循环伏安曲线，以测试所述 金电极的性能，扫描速度50mV/S，扫描范围为-0.1V?0.6V ;当所述循环伏安曲线中的峰电 位差在SOmV以下，并尽可能接近64mV，所述金电极可使用，否则要重新返回步骤⑶中，处 理所述金电极，直到符合要求。(6)取2.5μ L分散均匀的多壁碳-二氧化锡-壳聚糖纳米 复合液滴涂在电极表面，常温下lh，然后用pH7.5的磷酸盐缓冲液冲洗表面，氮气吹干。(7) 电极表面晾干后，取2.5 μ L乙酰胆碱酯酶滴涂在电极表面，4°C下静置2h，然后用PH=7.5的 磷酸盐缓冲液冲洗表面，氮气吹干。(8)取2.5 μ L0.5%Naf ion保护膜滴涂在电极表面，常 温下静置1.5h，然后用PH=7.5的PBS缓冲液冲洗表面，氮气吹干。(9)将上述经纳米材料 修饰的电极沉浸在毒死蜱溶液中，室温下浸泡14min，取出后用PBS缓冲液冲洗表面，晾干 待用。(10)从毒死蜱溶液浓度、测试底液pH和孵育时间三方面对所制备的酶传感器的实 验条件进行优化，毒死蜱溶液浓度的范围为0.1-20μ g/mL，pH的范围为6.0-8.0，孵育时间 的范围为6-14min。(11)配置0.05-100000 ng/mL的毒死蜱标准溶液，将上述制备好的酶 传感器分别浸入不同浓度的毒死蜱标准溶液，在常温下孵育14min，检测反应前后电流变化 得到其工作曲线。(12)选5根于相同条件下制备好的酶传感器检测其重现性；连续7天依次检测相同浓度的毒死蜱溶液以检测其稳定性。(13)选取有代表性的蔬菜样品，用潮湿的 抹布将蔬菜表面的泥土擦拭干净，切碎成2cm左右的见方碎片，去样品2g，放入提取瓶中， 加入IOml磷酸盐缓冲液，放入超声提取仪，超声提取3分钟，倒出提取液静置2min，备用即可。[0015]此种酶传感器检测毒死蜱农药残留的检测方法操作工艺简单，检测时间较短，检 测农药浓度范围广，灵敏度高，稳定性好，再生能力高以及对实际样品分析有较好的回收率 和重现性，符合我国农药残留快速检测技术发展和国际化要求。
【权利要求】
1.一种检测毒死蜱农药残留的酶传感器制备方法，其特征在于:一种新型的多壁 碳-二氧化锡-壳聚糖纳米复合材料的制备，制备步骤为:在50mL乙酸溶液中加入0.1g壳聚糖制备成0.2%壳聚糖溶液，在4mL 0.2%壳聚糖溶 液中加入Img 二氧化锡、3mg多壁碳纳米管，25°C水中超声震荡30分钟，获得均匀的多壁 碳-二氧化锡-壳聚糖纳米复合膜分散液。
2.如权利要求1所述的一种检测毒死蜱农药残留的酶传感器制备方法，其特征在于: 利用多壁碳-二氧化锡-壳聚糖纳米复合膜协同作用共同修饰电极的酶传感器制备步骤 为:取2.5 μ L制备好的多壁碳-二氧化锡-壳聚糖纳米复合膜滴涂在预处理好的φ=1πιπι 的金电极表面，常温下静置lh，用ρΗ7.5的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面；电极表面晾干后， 取2.5μ L乙酰胆碱酯酶滴涂在电极表面，4°C下静置2h，然后用pH7.5的磷酸盐缓冲液冲 洗表面，氮气吹干；取2.5μ L 0.5% Nafion保护膜滴涂在电极表面，常温下静置1.5h，然后 用pH7.5的磷酸盐缓冲液冲洗表面，氮气吹干；将上述经纳米材料修饰好的电极沉浸在毒 死蜱溶液中，常温下浸泡14min，取出后用磷酸盐缓冲液冲洗表面，晾干待用，酶传感器制作 完成，保存在4° C条件下备用。
【文档编号】B82Y5/00GK103558269SQ201310488105
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月18日 优先权日:2013年10月18日
【发明者】孙霞, 郭业民, 王相友, 刘君峰, 陈栋菲 申请人:山东理工大学