一种多肽修饰的CdTe量子点的制备方法和用途
【专利摘要】本发明提供了一种CLV3十二肽修饰的CdTe量子点的制备方法，包括以下步骤：采用一锅法合成CdTe量子点；采用芴甲氧羰基固相肽合成法合成CLV3十二肽，采用反向HPLC进行纯化，纯化后制得纯度大于98%的CLV3十二肽，其氨基酸序列为NH2-RTVPSGPDPLHH-COOH；采用零距离偶联法将CLV3十二肽连接到量子点CdTe的表面，从而制得CLV3十二肽修饰的CdTe量子点。采用该量子点所制备的荧光探针，以其作为具有活性功能的配体信号，对植物根端分生组织中的干细胞进行标记，为理解干细胞动态平衡维持的信号机制提供分子细胞学方面的直接证据。
【专利说明】一种多肽修饰的CdTe量子点的制备方法和用途
【技术领域】
[0001]本发明提供了一种多肽修饰的CdTe量子点，尤其涉及CLV3十二肽修饰的CdTe量子点，并且提供了该量子点在制备荧光探针中的用途，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]植物干细胞数目的维持和稳定对植物的生长发育以及农作物的性状起着关键作用。干细胞自动动态平衡(homeostasis)的维持依赖于根端或茎端干细胞和其下方的组织中心(OC)细胞(干细胞龛)之间的信息交流。如何有效捕捉这些信息对理解这种动态平衡的维持具有重要意义。信息交流的捕获，需要对植物根端或茎端分生组织中不同区域的干细胞进行标记，才能更好地理解干细胞动态平衡维持的信号机制。而如何对植物分生组织中不同区域的干细胞进行标记成为了一个难题，目前尚无一种专门针对此类研究的荧光探针，因此发明一种能够对植物茎端分生组织中不同区域的干细胞进行标记的荧光探针成为了一个难题。为解决这一问题，本发明用量子点纳米技术，合成一种荧光荧光探针，对干细胞进行标记。
[0003]CLV3是一种分泌性的多肽，在加工分泌过程中被水解为12个氨基酸组分的活性多肽。曾有研究者构建CLV3基因和绿色荧光蛋白(GFP)基因的融合基因在追踪CLV3的分泌过程。但这种方法不能真正反映CLV3多肽分泌的真实全貌。原因有:①构建的融合蛋白有在运输和加工过程中被水解，追踪到的荧光信号是GFP的信号而非活性多肽的信号融合蛋白中的GFP比12个氨基酸的活性多肽的分子量大的多，它可能会干扰小分子多肽的功能。因此，寻找分子量更小的量子点作为CLV3的荧光标签就成为一种不二选择。
【发明内容】
[0004]本发明解决了上述·【背景技术】中的不足，提供了一种CLV3十二肽修饰的CdTe量子点的制备方法，采用该量子点所制备的荧光探针，以其作为具有活性功能的配体信号，对植物根端分生组织中不同区域的干细胞进行标记，为理解干细胞动态平衡维持的信号机制提供分子细胞学方面的直接证据。
[0005]实现本发明上述目的所采用的技术方案为:
[0006]一种CLV3十二肽修饰的CdTe量子点的制备方法，包括以下步骤:(I)、采用一锅法合成CdTe量子点；(2)、采用芴甲氧羰基固相肽合成法合成CLV3十二肽，采用反向HPLC进行纯化，纯化后制得纯度大于98%的CLV3十二肽，其氨基酸序列为NH2-RTVPSGPDPLHH-C00H ； (3)、采用零距离偶联法将CLV3十二肽连接到量子点CdTe的表面，从而制得CLV3十二肽修饰的CdTe量子点。
[0007]所述步骤(1)中，CdTe量子点的合成方法具体如下:首先将CdCl2溶液与巯基乙酸混合均匀，并在混合液中持续通入高纯氮气保持混合液冒泡状态；然后采用碱性溶液将混合液的PH调节至碱性，直至混合液变澄清后停止调节；将柠檬酸三钠和Na2TeO3溶液添加至混合液中，最后加入NaBH4,混合均匀后得到反应液，并停止通入氮气；将反应液移置反应爸中,在95-105°C的条件下反应l_2h ;反应结束后在反应液中加入过量丙酮,生成沉淀,将沉淀离心分离后收集，所得沉淀即为CdTe量子点，最后将沉淀用超纯水重悬后放置于冰箱中冷藏。
[0008]所述步骤⑵中，采用ABI433A型多肽合成仪进行合成，纯化时采用反相HPLC进行，反相HPLC包含两个溶剂输送泵，检测波长为220nm，多肽纯度用220nm紫外吸收值测定和全离子液相色谱-质谱的方法的分析。
[0009]所述的零距离偶联法的步骤如下:将碳化二亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺、2-吗啉乙磺酸缓冲液以及去离子水加入到CdTe量子点溶液中，搅拌反应后制得混合物；将混合物离心除去过量的试剂，所剩余的沉淀用双蒸水洗涤后，再向沉淀中加入CLV3十二肽、双蒸水以及硼酸钠缓冲液，得到混合溶液；将混合溶液用超声波在25°C条件下温育2h，然后将混合溶液在4°C条件下储存过夜，混合溶液中过量的多肽通过离心的方法除去，即可制得CLV3十二肽修饰的CdTe量子点。
[0010]本发明中用琼脂糖凝胶电泳检测CdTe量子点和CLV3十二肽的偶联效果，电泳条带用凝胶成像系统进行成像。
[0011]上述CLV3十二肽修饰的CdTe量子点能够应用于荧光探针中，对对细胞进行荧光
[0012]在本发明中，以新型的纳米晶体荧光探针——量子点技术为手段，用具有生物功能的多肽分子和量子点进行化学偶联，所制备出多肽修饰的量子点，采用该量子点作为荧光探针对细胞进行荧光标记，能够对植物根端分生组织中不同区域的干细胞进行标记，为理解干细胞动态平衡维持的信号机制提供分子细胞学方面的直接证据。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为CLV3十二肽和CdTe量子点之间生物活性连接的零距离偶联过程示意图；
[0014]图2为琼脂糖凝胶电泳的泳动速率检测偶联效果图；
[0015]图3为实施例中CLV3-QD在拟南芥根端原生质体表面的荧光分布图。
【具体实施方式】
[0016]下面结合具体实施例对本发明做详细具体的说明，但是本发明的保护范围并不局限于以下实施例。
[0017]本实施例中首先采用一锅法合成CdTe量子点，具体合成方法如下:
[0018]将IOml CdCl2溶液(0.01mol l-1)和38ml的超纯水转移到200ml长颈瓶中，然后将溶液和10μ I巯基乙酸(TGA)混匀，并持续通入高纯度氮气保持冒泡状态；在此过程中滴加NaOH (1.0mol L—1)调pH到11.0直到混合物变为澄清为止；然后将53.8mg的柠檬酸三钠和2.0ml的Na2TeO3 (0.01mol.l-1)添加到这些混合物中；最后在通氮气的环境中，加入3.0mg的NaBH4 ;混匀后，溶液转移到反应釜中保持100°C的反应温度，反应时间为l_2h ；然后将反应产物用丙酮进行沉淀，多余反应物通过10，OOOrpm离心3min的方法除去；沉淀用超纯水重悬然后4°C冰箱保存。
[0019]然后采用芴甲氧羰基固相肽合成法合成CLV3十二肽，采用反向HPLC进行纯化，纯化后制得纯度大于98%的CLV3十二肽，其氨基酸序列为NH2-RTVPSGPDPLHH-C00H。[0020]多肽的合成用芴甲氧羰基(9-芴羰基)固相肽合成的方法(武汉纽斯特生物技术有限公司，ABI433A型多肽合成仪)进行合成，合成的12个氨基酸的CLV3多肽(NH2-RTVPSGPDPLHH-C00H)纯度达到 98.04%。
[0021]合成的多肽纯化用反相HPLC进行，它包含两个溶剂输送泵，检测波长为220nm。液相柱的规格为 Develosil-ODS HG-5, 10mm 1.d.250mm,加上保护柱(Nomura ChemicalC0.)分离采用溶剂A流向溶剂B的线性梯度洗脱:0-50%B运行20min，50 - 100%B运行5min,洗脱速度为 3.0ml mirT1。
[0022]多肽纯度用220nm紫外吸收值测定UV absorbance (220nm)和全离子液相色谱-质谱(LC-MS)的方法的分析。
[0023]再采用零距离偶联法将CLV3十二肽连接到量子点CdTe的表面，从而制得CLV3十二肽修饰的CdTe量子点，所述零距离偶联法的具体步骤如下:
[0024]将5mg碳化二亚胺，3.75mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺，0.2ml2~吗啉乙磺酸缓冲液，0.3ml去离子水，加入到CdTe (10-5mol L—1)溶液中，然后搅动反应30min ;将上述混合物4000rpm离心40min以移去过量试剂,沉淀用Iml双蒸水洗漆2次,然后向沉淀中加入0.5mlCLV3十二肽，0.3ml双蒸水，0.2ml硼酸钠缓冲液(pH8.3,0.1mol L-1);上述混合溶液用超声波(KQ520DE型，40ΚΗΖ)在25°C条件下温育2h，然后将溶液储存于4°C夜，过量多肽通过离心的方法除去(4000rpm)，即可制得CLV3十二肽修饰的CdTe量子点。
[0025]CLV3十二肽和CdTe量子点之间生物活性连接的零距离偶联过程如图1所示，用琼脂糖凝胶(质量浓度0.5%)电泳检测量子点和多肽的偶联效果。琼脂糖凝聚用TBE缓冲液配置，配方为:89m mo I L 1Tris 喊，89m mo I L1 硼酸，2m mo I L 1EDTA, ρΗ8.3,电泳为120V10min。电泳条带用凝胶成像系统进行成像。琼脂糖凝胶电泳的泳动速率检测偶联效果图如图2所示，由图中可以看出，多肽量子点的泳动速率(左侧条带)迟于尚未偶联的量子点(右侧条带)。
[0026]考虑到根端干细胞与茎端干细胞研究体系的相似性及其简单性，本发明研究了量子点标记的多肽的生物学活性极其功能。采用完整和分离到的原生质体，用这种多肽修饰的量子点进行温育，观察到了其细胞表明的不均匀分布的荧光，暗示了该多肽结合的受体不均匀分布，这一结果表明了该多肽修饰的量子点可以作为荧光探针进行荧光标记。
[0027]下面为本发明中所提供的荧光探针进行标记时的具体步骤:
[0028]将7d龄的拟南芥根切成小段，然后放在平面皿中，加入2ml酶解溶液[l/2MS+3%鹿糖+0.4mol L-1葡萄糖,2.5%纤维素酶(Onozuka R-10), 1%果胶酶(Merck试剂),1%裂解酶(R-10，Serva)，pH5.8]25°C酶解过夜；通过离心的方法(≤lOOrpm，5-lOmin)将上部酶液除去，原生质体用如下溶液进行漂洗(l/2MS+3%蔗糖+0.4mol L-1葡萄糖，pH5.8)两次，然后将原生质体重悬在上述溶液中待用；将上述荧光探针(<3μπι01 L_0和原生质体进行温育(25°C)3-4h，然后将细胞用上述溶液洗2-3次，然后用荧光显微镜进行荧光观察，观察结果如图3所示:A、B分别为CdTe量子点和细胞温育后明视野和荧光图像；C、D为CLV3-QD和细胞温育后明视野和荧光图像，比例尺:50 μ m。
【权利要求】
1.一种CLV3十二肽修饰的CdTe量子点的制备方法，其特征在于包括以下步骤:(I)、采用一锅法合成CdTe量子点；(2)、采用芴甲氧羰基固相肽合成法合成CLV3十二肽，采用反向HPLC进行纯化，纯化后制得纯度大于98%的CLV3十二肽，其氨基酸序列为NH2-RTVPSGPDPLHH-C00H ； (3)、采用零距离偶联法将CLV3十二肽连接到量子点CdTe的表面，从而制得CLV3十二肽修饰的CdTe量子点。
2.根据权利要求1所述的CLV3十二肽修饰的CdTe量子点的制备方法，其特征在于:步骤(1)中，CdTe量子点的合成方法具体如下:首先将CdCl2溶液与巯基乙酸混合均匀，并在混合液中持续通入闻纯氣气保持混合液冒泡状态；然后米用喊性溶液将混合液的pH调节至碱性，直至混合液变澄清后停止调节；将柠檬酸三钠和Na2TeO3溶液添加至混合液中，最后加入NaBH4,混合均匀后得到反应液，并停止通入氮气；将反应液移置反应釜中，在95-105°C的条件下反应1-2小时；反应结束后在反应液中加入过量丙酮,生成沉淀,将沉淀离心分离后收集，所得沉淀即为CdTe量子点，最后将沉淀用超纯水重悬后放置于冰箱中冷藏。
3.根据权利要求1所述的CLV3十二肽修饰的CdTe量子点的制备方法，其特征在于:步骤(2)中，采用ABI433A型多肽合成仪进行合成，纯化时采用反相HPLC进行，反相HPLC包含两个溶剂输送泵，检测波长为220nm，多肽纯度用220nm紫外吸收值测定和全离子液相色谱-质谱的方法的分析。
4.根据权利要求1所述的CLV3十二肽修饰的CdTe量子点的制备方法，其特征在于:所述的零距离偶联法的步骤如下:将碳化二亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺、2-吗啉乙磺酸缓冲液以及去离子水加入到CdTe量子点溶液中，搅拌反应后制得混合物；将混合物离心除去过量的试剂，剩余的沉淀用双蒸水洗涤后，再向沉淀中加入CLV3十二肽、双蒸水以及硼酸钠缓冲液，得到混合溶液；将混合溶液用超声波在25°C条件下温育2h，然后将混合溶液在4°C条件下储存过夜，混合溶液中过量的多肽通过离心的方法除去，即可制得CLV3十二肽修饰的CdTe量子点。
5.根据权利要求4所述的CLV3十二肽修饰的CdTe量子点的制备方法，其特征在于:用琼脂糖凝胶电泳检测CdTe量子点和CLV3十二肽的偶联效果，电泳条带用凝胶成像系统进行成像。
6.权利要求1中所制备的CLV3十二肽修饰的CdTe量子点在制备荧光探针中的用途。
【文档编号】B82Y20/00GK103710019SQ201310658666
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月6日 优先权日:2013年12月6日
【发明者】余光辉, 谭艳平, 崔国鹏 申请人:中南民族大学