电泳法负载庆大霉素的镁基钙磷/壳聚糖/纳米管载药膜层的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及骨科医疗器械制备领域，特别是涉及一种电泳法负载庆大霉素的镁基 钙磷/壳聚糖/纳米管载药膜层的制备方法。
【背景技术】
[0002] 在整形外科手术中软组织和骨感染是一个关注的问题，其中臀部和膝盖关节手术 感染率在2 %-4%，螺钉引起的骨感染已上升至45 %。修复手术感染率达40%。可见，感染预 防和治疗是整形外科和创伤手术中一个重要的挑战，局部应用抗生素利于骨整合，可以有 效降低骨和软骨组织感染，同时避免全身应用抗生素到达感染部位的效果差，又容易引起 毒性等缺点。
[0003] 骨修复材料可分成：金属材料、陶瓷材料、高分子材料及其复合物。金属植入材料 力学性能好，但缺乏生物活性，通常不能与骨组织发生键合，并且弹性模量过高，易产生应 力屏障效应，在体液作用下，持续放出金属离子。陶瓷植入材料:生物活性好，有一定的孔隙 率，但抗疲劳性和抗压性低。高分子植入材料:可塑性强，易加工成型，但生物活性差，大量 降解容易造成组织毒性反应，引起病变。针对上述问题，金属基陶瓷-高分子复合材料成为 植入材料的发展方向和研究的热点。
[0004] CNTs是石墨管状结构，由于其特殊的物理、电学和化学性质引起了人们的关注。 CNTs通过各种方式应用于组织工程领域，它们可以提高复合生物材料的机械性能和生物相 容性，利于与细胞结合蛋白作用，通过优先与细胞亲和来调节细胞形态、调节细胞分化等。 [0005]庆大霉素是由棘孢小单孢菌、绛红小单孢菌等发酵生成的一种氨基糖苷类抗生 素。硫酸庆大霉素是为数不多的热稳定性抗生素，具体抗菌谱广，主要用于治疗细菌感染， 尤其是对革兰氏阴性菌和金黄色葡萄球菌引起的感染。它是通过与细菌核糖体30s亚基结 合，从而阻断细菌蛋白质的合成。因此，复合庆大霉素抗生素的骨材料在防治感染性骨缺损 方面具有广阔的应用前景。
【发明内容】
[0006] 本发明是为了丰富可降解金属基复合骨植入材料的种类，而提供了可降解镁合金 表面电泳法负载庆大霉素的钙磷/壳聚糖/CNTs载药膜层的制备方法，本发明解决了复合材 料与基体结合不好、生物相容性差的问题，提供了一种新的骨植入材料载药的方法。
[0007] 为达上述目的，本发明一种电泳法负载庆大霉素的镁基钙磷/壳聚糖/纳米管载药 膜层的制备方法，其包括以下步骤：
[0008] 一、镁合金微弧氧化(ΜΑ0):
[0009]对AZ91D镁合金处理，将AZ91D镁合金放入30g/L K0H、30g/L Na4Si〇4、40g/L Na3P04和15g/L NaF溶液中，在微弧氧化过程中，AZ91D镁合金为阳极，装有电解液的不锈钢 槽为阴极，采用恒流氧化方式，电流强度为〇. lA/cm2，氧化时间为10s;
[0010] 二、电解液的配置：
[0011] 步骤a、将0.25g壳聚糖、l.Og η羟基磷灰石粒子和含庆大霉素注射液的CNTs在超 声条件下依次加到200mL醋酸水溶液中，所述醋酸水溶液含醋酸9mL，得到溶液A。其中含庆 大霉素注射液的CNTs是将40mg/ml庆大霉素注射液与0.25g/L CNTs醋酸水溶液按7.5_ 8.75:1 (mL/1)的比例混合得到，之后加蒸馏水，搅拌，过滤，干燥得到电泳碳源，以上两次所 述醋酸水溶液为每200mL中含醋酸9mL;
[0012] 步骤b，将1.5g η羟基磷灰石粒子加到300mL无水乙醇中，得到悬浮液B;
[0013] 步骤c，将溶液A与悬浮液B混合，超声混匀1 -2h、陈化24-30h，得到电泳溶液；
[0014] 三、以MA0-AZ91D为阴极，涂覆铱钽的钛合金为阳极，两电极之间的距离为1 cm，在 40V下恒压电泳20min;
[0015] 四、经步骤三处理的MA0-AZ91D浸泡在ros磷酸盐缓冲液中，在37°C±0.5°C条件 下，于250mL的PBS磷酸盐缓冲液中浸泡5d，所获得的样品经蒸馏水润洗后，室温干燥，待用， 其中步骤四中的TOS磷酸盐缓冲液需每天更换，PBS磷酸盐缓冲液由10g/L NaH2P〇4和10g/L Na2HP〇4去离子水构成。
[0016] 其中步骤四中所述PBS磷酸盐缓冲液中含体积百分比1-8%的庆大霉素注射液。
[0017] 本发明与现有技术不同之处在于本发明取得了如下技术效果：
[0018] 通过本发明在镁合金表面电泳法负载庆大霉素的钙磷/壳聚糖/CNTs载药膜层的 制备方法，膜层与基体结合良好，具有良好的生物活性及细胞相容性，电泳载药制备的 AZ91D镁合金基钙磷/壳聚糖/GNS沉积层，在m-SBF介质中药物持续释放时间达60d以上。
[0019] 下面结合附图对本发明作进一步说明。
【附图说明】
[0020] 图1是本发明实施例1中，泳液中不同浓度CNTs时钙磷/壳聚糖膜层在m-SBF中浸泡 4 周 XRD 谱图（（a)0.05g/L;(b)0.1g/L;(C)0.15g/L;(d)0.25g/L;(e)0.3g/L;(f)0.4g/L); [0021 ]图2是本发明实施例1中，泳液中不同浓度CNTs时钙磷/壳聚糖膜层在m-SBF中浸泡 4 周 FTIR 谱图（（a)0.05g/L;(b)0.1g/L;(C)0.15g/L;(d)0.25g/L;(e)0.3g/L;(f)0.4g/L);
[0022] 图3是本发明实施例1中，泳液中不同浓度CNTs时钙磷/壳聚糖膜层在m-SBF中浸泡 4 周 SEM 照片（（a)0.05g/L;(b)0.1g/L;(C)0.15g/L;(d)0.2g/L;(e)0.25g/L;(f)0.3g/L;(g) 0.4g/L)；
[0023] 图4是本发明实施例1中，泳液中不同浓度CNTs时钙磷/壳聚糖膜层的划痕金相照 片（（a)0.05g/L;(b)0.1~0.25g/L;(f)0.3g/L);
[0024] 图5是本发明实施例2中，优化制备条件下钙磷/壳聚糖/CNTs膜层在m-SBF中浸泡 不同时间条件下的 XRD谱图（（a)Oweek; (b) lweek; (c)2weeks ; (d)4weeks; (e)6weeks; (f) 8weeks；(g)lOweeks；(h)12weeks)；
[0025] 图6是本发明实施例2中，优化制备条件下钙磷/壳聚糖/CNTs膜层在m-SBF中浸泡 不同时间条件下的FTIR谱图（（a)Oweek; (b)2weeks; (c)4weeks; (d)6weeks; (e)8weeks; (f) lOweeks；(g)12weeks)；
[0026] 图7是本发明实施例2中，优化制备条件下钙磷/壳聚糖/CNTs膜层在m-SBF中浸泡 不同时间条件下的SEM照片（（a)Oweek; (b)lweek; (c)4weeks; (d)8weeks; (e)lOweeks; (f) 12weeks)；
[0027] 图8a_e是本发明实施例2中，优化制备条件下AZ91D基钙磷/壳聚糖/CNTs在m-SBF 中浸泡不同时间时Nyquist图（（a)0days(b)2weeks(c)4weeks(d) 10weeks(e) 12weeks);
[0028] 图9是本发明实施例4中，优化制备条件下CCK8法研究MA0-AZ91D基钙磷/壳聚糖/ CNTs材料与AZ9 ID，MA0-AZ9 ID，AZ91D基钙磷/壳聚糖浸渍m-SBF不同时间浸提液的细胞生存 率；
[0029]图10是本发明实施例5中，优化制备条件下AZ91D基钙磷/壳聚糖/CNTs材料与 AZ91D，MA0-AZ91D，MA0-AZ91D基钙磷/壳聚糖浸渍m-SBF不同时间的浸提液的碱性磷酸酶活 性(ALK);
[0030]图11是本发明实施例6中，优化制备条件下，AZ91D镁合金基钙磷/壳聚糖、AZ91D镁 合金基钙磷/壳聚糖/CNTs膜层试样在不同GM含量的PBS中浸渍3d后膜层中释放GM吸光度； [0031 ]图12是本发明实施例7中，优化制备条件下GM与CNTs不同比例混合时电泳载药试 样膜层中释放GM吸光度；
[0032]图13是本发明实施例8中，优化制备条件下渍载药试样膜层中GM在m-SBF中释放浓 度随浸泡时间的变化；
[0033]图14是本发明实施例9中，优化制备条件下电泳载药试样在不同条件下膜层中GM 释放曲线(a)100mL PBS+6mL GM浸泡5d后于250mL m-SBF中释放，（b)100mL PBS浸泡5d后于 m-SBF释放。
【具体实施方式】
[0034]以下结合实施例，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。 [0035] 实施例1:
[0036]本实施例中可降解镁合金表面电泳法负载庆大霉素钙磷/壳聚糖/CNTs骨植入材 料制备方法是按下述步骤进行：
[0037] 一、镁合金微弧氧化(MA0):将AZ91D镁合金放入30g/L K0H、30g/L Na4Si〇4、40g/L Na3P〇4和15g/L NaF溶液中。在微弧氧化过程中，AZ91D镁合金为阳极，装有电解液的不锈钢 槽为阴极。采用恒流氧化方式，电流强度为〇. lA/cm2，氧化时间为10s;
[0038]二、电泳液的配制：
[0039] 步骤a、将0.25g壳聚糖（简称CS)、1.0g nHA粒子和不同比例CNTs(0.05g/L;0.1g/ L; 0 · 15g/L; 0 · 25g/L; 0 · 3g/L; 0 · 4g/L)，在超声条件下依次加到200mL醋酸水溶液(含醋酸 9mL)中，得到溶液A;
[0040] 步骤b，将1.5g nHA粒子在超声条件下加到300mL无水乙醇中，得到悬浊液B;
[0041 ]步骤c，将溶液A与悬浮液B混合，制成电泳液。实验中所使用的是多壁CNTs，直径 50-70nm，长度5-12nm，CNTs在使用前先经浓硝酸活化处理，再经超声分散和微孔滤膜过滤 除去杂质；
[0042] 三、以MA0-AZ91D为阴极，涂覆铱钽的钛合金为阳极，两电极之间的距离为1 cm左 右，在40V下恒压电泳20min;
[0043] 四、经步骤三处理的MA0-AZ91D浸泡在不同成分的磷酸盐缓冲液(PBS)中，在37°C ±〇.5°C条件下，于250mL PBS中浸泡5d，所获得的样品经蒸馏水润洗后，室温干燥，待用。其 中步骤四中的PBS需每天更换，PBS由lOg/L NaH2P〇4和lOg/L Na2HP〇4去离子水构成；
[0044] 五、经步骤四处理的含有不同浓度CNTs的钙磷/壳聚糖膜层的MA0-AZ91D复合材料 浸泡在250mL模拟体液(m-SBF)中，，m-SBF的pH约为7.4，其化学组成见表1。溶于去离子水 中，试样表面积(cm 2)与m-SBF(mL)的比值是1: 250。在37°C ±0.5°C条件下，浸泡4周，所获得 的样品经蒸馏水润洗后，室温干燥，待用。
[0045] 表1 m-SBF化学成分
[0046]
[0047]
[0048] HEPESS2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)ethanesulfonicacid2-(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸。
[0049] 本实施例所述方法对镁合金进行微弧氧化会增加材料的结合力及耐蚀性。
[0050] 由图1结果可见在含有不同浓度CNTs的钙磷/壳聚糖膜层的MA0-AZ91D复合材料浸 泡在m-SBF中，膜层中主要成分是HA和HCA，泳液中CNTs浓度为0. lg/L到0.3g/L时，HA和HCA 衍射峰强度增加，当CNTs浓度从0. lg/L变化到0.25g/L时，所获得钙磷/壳聚糖/CNTs膜层的 结合力和生物活性均较好。
[0051 ]本实施例中CNTs沉积在钙磷/壳聚糖膜层中